一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物及其合成方法与流程

1.本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物及其合成方法。


背景技术：

2.荧光素广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等，其中cy7荧光素是体内成像应用中最常用的近红外红色荧光团的一种。
3.叶酸由于其分子量小、无免疫原性和稳定性好，有利于与其他基团形成化学键。叶酸对细胞表面上表达的叶酸受体具有高亲和性。细胞通过叶酸受体和叶酸的结合来实现对叶酸的摄取。虽然叶酸受体在大部分正常细胞中的表达水平非常低，但是在大量癌细胞中，常高水平表达以满足在低叶酸条件下快速分裂细胞对叶酸的较高需求。
4.叶酸受体(folate receptor，fr)是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白。其中frα受体在正常组织中如脉络丛、胎盘组织及近端肾小管、膀胱上皮细胞等也可见低中度表达，而卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌等肿瘤细胞表面frα受体数量均高水平表达。叶酸受体与叶酸及其衍生物亲和性远远超过正常细胞，更重要的是，卵巢癌肿瘤细胞表面fr的表达密度随肿瘤进展及恶性度增加而升高，因此叶酸受体成为近年来卵巢癌等肿瘤放射性核素靶向显像及治疗研究的热点，也是基于这种特性，可将显像剂、治疗药物等与叶酸偶联，靶向给予肿瘤细胞，从而应用于肿瘤的影像诊断，如核医学显像、核磁共振显像、荧光显像，和肿瘤治疗，如化疗、同位素治疗、免疫治疗、反义核苷酸治疗及基因治疗。
5.由于药理学性质通常在一定程度上受到将荧光团连接到任意受体结合配体的影响，并且包括结合亲和性改变以及受体(即激动剂或拮抗剂的性质)的活化等。所以为了量化所观察到的结合效果，在任何研究中了解荧光配体的药理学是重要的。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物及其合成方法。
7.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
8.一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物，其特征在于：所述化合物结构式如下所示：
[0009][0010]
优选地，所述的一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物的制备方法，其特征在于：
[0011]
s1、fa-osu的合成
[0012]
s11、将叶酸溶解于无水dmso中，磁力搅拌过程中分别加入dcc和hosu，将混合物于常温下避光搅拌10～20h；
[0013]
s12、过滤不溶物，真空抽滤，并用甲基叔丁基醚洗涤滤饼，抽干成黄色粉末，得到fa-osu；
[0014]
s2、nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂的合成；
[0015]
s21、取rink树脂置于固相反应柱中，用dcm溶胀树脂，抽掉溶液；
[0016]
s22、取fmoc-lys(boc)-oh、hobt，dmf溶解，待溶解澄清后加入dic，将混合溶液加入反应柱中进行反应，用dblk脱fmoc，dmf洗涤；
[0017]
s23、重复s22，偶联fmoc-cys(trt)-oh，得到nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂；
[0018]
s3、fa-cys-lys-conh2的合成；
[0019]
s31、称取fa-osu溶于dmso中，将溶液加入s32制得的nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂中，氮气鼓吹，并滴加diea；
[0020]
s32、待滴加完毕后，保持20～35℃温度反应，并用dmf洗涤，甲醇收缩，真空干燥，得到肽树脂；
[0021]
s33、将上述肽树脂加入裂解试剂，温室反应，过滤，将滤液倒入冰冻乙醚，析出黄的颗粒，离心；
[0022]
s34、用乙醚洗涤，真空干燥得到粗品，通过rp-hplc纯化，冻干得到纯度＞95％的黄色固体；
[0023]
s4、cy7衍生物的合成；
[0024]
所述反应式为
[0025][0026]
s41、避光条件下，在三口瓶中加入y-e，y-c，乙酸酐，吡啶，开启搅拌，氮气保护下反应得到蓝色固体y-f；
[0027]
s42、取蓝色固体y-f，加入到三口瓶中，用无水dmf溶解，在避光环境下，向溶液中加入hatu，2-马来酰亚胺三氟乙酸盐，diea；
[0028]
s43、在氮气保护下搅拌反应，加入冰mtbe，析出蓝色固体，过滤。
[0029]
s44、通过rp-hplc纯化冻干，得到纯度＞90％的cy7-d固体；
[0030]
s5、标记物的合成cy7-fa
[0031]
s51、在避光条件下，在三口瓶中加入fa-cys-lys-conh2，用ph＝7.2的pbs与acn混合液溶解至澄清；
[0032]
s51、在s51中慢慢加入cy7-d，氮气保护，避光反应后，过滤。
[0033]
s52、通过rp-hplc纯化冻干，得到，纯度＞95％的cy7-fa蓝色固体。
[0034]
优选地，所述s12中用甲基叔丁基醚洗涤滤饼1～3次。
[0035]
优选地，所述s32的步骤为，待滴加完毕后，保持30℃温度反应，用dmf洗涤2～4次，甲醇收缩1～3次，真空干燥后得到肽树脂。
[0036]
优选地，所述s33中的裂解试剂为tfa:tis:h2o:dtt＝90:2.5:2.5:5。
[0037]
优选地，所述s34中用乙醚洗涤2-3次。
[0038]
优选地，所述s41中氮气保护下，将反应液升温至110℃，搅拌1～2小时，反应液降至室温，将反应液滴加至乙酸乙酯中，过滤，通过rp-hplc纯化冻干，得到蓝色固体y-f。
[0039]
本发明的有益效果体现在：本发明的制备方法原料易制备，反应条件温和，且收率高，为后续新药研究、药理研究提供优质的物料。
具体实施方式
[0040]
以下结合实施例具体阐述本发明的技术方案，本发明揭示了一种与叶酸受体靶向结合的叶酸荧光素标记化合物及其合成方法。所述化合物结构式如下所示：
[0041][0042]
以下结合具体实施例阐述下该化合物的制备：
[0043]
步骤一、fa-osu的合成
[0044]
将叶酸(4.41g，10mmol)溶解于250ml无水dmso中，磁力搅拌过程中分别加入dcc(2.48g，12mmol)和hosu(2.3g，20mmol)，将混合物于常温下避光搅拌16h。过滤不溶物，真空抽滤，并用甲基叔丁基醚洗涤滤饼两次，抽干成黄色粉末，得到5.5gfa-osu，无需进一步纯化，可以做下一步反应。
[0045]
步骤二、nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂的合成
[0046]
称取2g rink树脂(替代度为0.52mmol/g)置于固相反应柱中，用dcm溶胀树脂20min，抽掉溶液。称取fmoc-lys(boc)-oh(2.08mmol)、hobt(2.08mmol)，20ml dmf溶解，待溶解澄清后加入dic(2.08mmol),将混合溶液加入反应柱中，反应2-3h。用dblk脱fmoc，dmf洗涤5次。重复以上步骤，偶联fmoc-cys(trt)-oh，得到nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂。
[0047]
步骤三、fa-cys-lys-conh2的合成
[0048]
称取fa-osu(2mmol)溶于dmso中，将溶液加入nh
2-cys(trt)-lys(boc)-rink树脂中，氮气鼓吹，并滴加diea(4mmol)。待滴加完毕后，保持30℃温度反应4h。dmf洗涤3次，甲醇收缩2次，真空干燥，得到3.2g肽树脂。
[0049]
将上述肽树脂加入裂解试剂(tfa:tis:h2o:dtt＝90:2.5:2.5:5)，温室反应2h。过滤，将滤液倒入冰冻乙醚，析出黄的颗粒，离心。再用乙醚洗涤3次，真空干燥，得到1.3g粗品。通过rp-hplc纯化，冻干得到0.56g,纯度＞95％的黄色固体。
[0050]
步骤四、cy7衍生物(cy7-d)的合成
[0051][0052]
50ml三口瓶，避光，加入0.5600g y-e，0.3360g y-c，5.6ml乙酸酐，2.8ml吡啶，开启搅拌，氮气保护下，反应液升温至110℃，搅拌1小时，反应液降至室温，将反应液滴加至50ml乙酸乙酯中，过滤，通过rp-hplc纯化冻干后，得到206mg蓝色固体(y-f)。
[0053]
称取100mg(1eq)蓝色固体(y-f)，加入到50ml三口瓶中，用10ml无水dmf溶解，避光。向溶液中加入hatu(2eq)，2-马来酰亚胺三氟乙酸盐(1.5eq)，diea(2ml)。氮气保护并搅拌，反应2h后，加入冰mtbe，析出蓝色固体，过滤。通过rp-hplc纯化冻干，得到63mg，纯度＞90％的cy7-d固体。
[0054]
步骤五、标记物的合成(cy7-fa)
[0055]
50ml三口瓶，避光，加入10.3mg fa-cys-lys-conh2,用ph＝7.2的pbs和acn混合液溶解至澄清。慢慢加入10mg cy7-d，氮气保护，避光反应1-2h后，过滤。通过rp-hplc纯化冻干，得到7mg，纯度＞95％的cy7-fa蓝色固体。
[0056]
本发明中涉及的英文缩写所代表的含义如下表所示：
[0057][0058]
当然本发明尚有多种具体的实施方式，在此就不一一列举。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。