SLC26A4基因突变体及其应用

slc26a4基因突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种slc26a4基因突变体及其应用。


背景技术：

2.耳聋(hearing loss,hl)是最常见的感官功能障碍类疾病，相当一部分的耳聋患者的发病与遗传因素有关。通过基因检测手段确定耳聋发病的分子机制，从而进一步采取产前基因诊断和干预措施，是降低耳聋发生率的有效手段，也是耳聋防治的根本途径之一。根据是否有并发的其他临床表型，遗传性耳聋可分为综合征型耳聋(syndromic hearing loss,shl)和非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss,nshl)。
3.非综合征型耳聋在先天性遗传性耳聋中占70％左右，其中又有75％-80％为常染色体隐性遗传(autosomal recessive,ar)。迄今为止，已有超过100个基因座(loci)与常染色体隐性耳聋相关联，这些基因座被命名为dfnb。由不同致病基因导致的非综合征型耳聋在发病年龄、听力损失程度、进行性等方面存在明显差异。确定耳聋发病的致病基因有助于为患者选取合适的听力干预手段，更好地提高耳聋患者的生活质量。
4.随着测序技术的发展，越来越多的遗传性耳聋相关基因得到鉴定，为遗传性耳聋的分子学诊断提供了基础，使得更多的遗传性耳聋患者得到诊断与治疗。然而，由于遗传性耳聋具有很强的遗传异质性，目前仍有大量的致病基因未被鉴定，所以这方面的研究还有很大的空间，仍需要加强基因鉴定方面的研究。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于一种slc26a4基因突变体及其应用。
6.全外显子测序(whole-exome sequencing，wes)是应用频率最高的基因组测序方法。外显子是人基因组的蛋白编码区域，利用序列捕获技术可以将其dna捕获并且富集。虽然外显子区域仅占全基因组1％左右，却包含了85％的致病突变。相比全基因组测序，全外显子测序更加经济、高效。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及utr区域内的变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异与疾病的关系。
7.发明人针对自行收集的一例常染色体隐性非综合征型耳聋trio家系(父母+先证者)，通过全外显子测序、家系分析联合sanger测序验证的方法进行致病突变检测和验证。最终，根据各项检测结果，发明人确定了常染色体隐性非综合征型耳聋的新的致病突变——slc26a4基因上的c.128delg突变，且该突变与患者另一条染色体上同一个基因的突变c.1001+5g>c构成复合杂合(in trans)，导致了常染色体隐性非综合征型耳聋的发生。
8.slc26a4基因定位于人类染色体7q31，包含21个外显子，由780个氨基酸组成，编码pendrin跨膜转运蛋白，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。在内耳，pendrin表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊等处，异变的蛋白将对这些结构的正常生理功能产生
影响，引发耳聋。
9.slc26a4基因上一些变异位点，会导致疾病的发生，例如临床可表现为大前庭导水管，儿童时期的听力损失，90％的患者为双侧性，听力损失程度不一，可表现为接近正常或重-极重度，病程可为稳定性、进行性或波动性，听力可逐步下降至全聋，跌倒、撞击等行为或无外界影响都可能引发听力的下降。发明人通过对一例常染色体隐性非综合征型耳聋trio家系进行研究，发现了致病突变位点slc26a4基因上的c.128delg突变与同一基因的突变c.1001+5g>c构成复合杂合(in trans)，能够导致常染色体隐性非综合征型耳聋的发生，应用该突变位点可以用于筛查常染色体隐性耳聋致病突变携带者。两个突变位点结合可以用于常染色体隐性耳聋患者的分子诊断以及相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高。当然，还可以根据需要与slc26a4基因上已经报道的其他变异位点等联用使用，或者与其他已经报道的用于常染色体隐性耳聋表征的突变位点联用，应用于常染色体隐性耳聋患者的分子诊断以及相关疾病的鉴别和诊断。
10.在本发明的第一方面，本发明提供了一种基因突变。根据本发明的实施例，所述基因突变与野生型slc26a4基因相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变。发明人发现slc26a4基因的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，从而可以通过检测该基因突变在生物样本中是否发生，有效地检测生物样本是否患非综合征型耳聋。根据本发明的实施例，所提供的基因突变是可检测的。
11.在本发明的第二方面，本发明提供了一种核酸。根据本发明的实施例，所提供的核酸与野生型slc26a4基因相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变。发明人发现slc26a4基因的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，从而可以通过检测上述核酸在生物样品中是否存在，有效地检测生物样品是否易患非综合征型耳聋。根据本发明的实施例，所提供的核酸是可分离的。
12.在本发明的第三方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽与野生型slc26a4基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有下列突变：p.arg43profster23和/或c.1001+5g>c突变引起的氨基酸移码突变。如上文提到的，slc26a4基因的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变引起的氨基酸移码突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，因此上述核酸所表达的蛋白或者多肽与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而可以通过检测该蛋白或者多肽在生物样品中是否存在，有效地检测生物样品是否易患非综合征型耳聋。根据本发明的实施例，所提供的多肽是可分离的。
13.在本发明的第四方面，本发明提供了一种检测基因突变或核酸或多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，所述试剂盒或者设备用于诊断非综合征型耳聋，所述基因突变为本发明第一方面所述的基因突变，所述核酸为本发明第二方面所述的核酸，所述多肽为本发明第三方面所述的多肽。如上所述，前面提到的基因突变、核酸、多肽与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而可以将能够用于检测这些基因突变、核酸或者多肽的试剂来制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或设备能有效筛选出患有非综合征型耳聋的生物样品。
14.在本发明的第五方面，本发明提供了一种生物模型在筛选药物中的用途，所述生物模型携带下列至少之一：(1)本发明第一方面所述的基因突变；(2)本发明第二方面所述的核酸；(3)表达本发明第三方面所述的多肽。需要说明的是，“生物模型携带本发明第一方
面所述的基因突变”表示，生物模型携带的slc26a4基因与野生型slc26a4基因相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变；“生物模型携带本发明第二方面所述的核酸”表示，生物模型携带的核酸序列与野生型slc26a4基因的核酸序列相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变；“生物模型携带本发明第三方面所述的多肽”表示，生物模型携带的多肽与野生型slc26a4基因所表达的多肽相比，具有p.arg43profster23和/或c.1001+5g>c突变引起的氨基酸移码突变。所提供的生物模型能有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究。根据本发明的实施例，所提供的生物模型可以用于筛选药物，所述药物用于治疗非综合征型耳聋。所提供的生物模型可以为细胞模型或者动物模型。
15.在本发明的第六方面，本发明提供了一种特异性改变基因突变或者核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗非综合征型耳聋，其中所述基因突变为本发明第一方面所述的基因突变，所述核酸为本发明第二方面所述的核酸。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的基因突变或者前面所述的核酸与非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于治疗非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋。
16.在本发明的第七方面，本发明提供了一种用于治疗非综合型耳聋的药物，所述药物含有：特异性改变本发明第一方面所述的基因突变或者本发明第二方面所述的核酸的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于治疗非综合征型耳聋。
17.在本发明的第八方面，本发明提供了一种构建体，包含本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的核酸。需要说明的是，“构建体包含本发明第一方面所述的基因突变”表示，构建体与野生型slc26a4基因相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变；“构建体包含本发明第二方面所述的核酸”表示，构建体携带的核酸序列与野生型slc26a4基因的核酸序列相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究的模型。
18.在本发明的第九方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞是通过本发明第八方面所述的构建体转化受体细胞获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究。
19.在本发明的第十方面，本发明提供了一种检测非综合征型耳聋的试剂盒，所述试剂盒中包括检测本发明第一方面所述的基因突变的试剂，和/或检测本发明第二方面所述的核酸的试剂，和/或检测本发明第三方面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患非综
合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品。
附图说明
20.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
21.图1显示了根据本发明的一个实施例提供的常染色体隐性非综合型耳聋trio家系图。
22.图2显示了根据本发明的一个实施例提供的患者家系中患者的纯音测听结果。
23.图3显示了根据本发明的一个实施例提供的患者家系中所有家系成员的slc26a4基因的c.1001+5g>c突变位点的代表性sanger测序验证峰图。
24.图4显示了根据本发明的一个实施例提供的患者家系中所有家系成员的slc26a4基因的c.128delg突变位点的代表性sanger测序验证峰图。
具体实施方式
25.下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时，对于本文中的某些术语进行了说明，这些说明仅仅用来帮助理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。
26.本文中，术语“非综合征型耳聋”在本领域也常被称为“非综合征型遗传性耳聋”，其是指耳聋为发病个体的唯一症状，无其他遗传性损害性器官功能障碍。
27.术语“常染色体隐性非综合征型耳聋”在本领域也通常为称为“常染色体隐性非综合征型遗传性耳聋”或者被称为“非综合征型常染色体隐性耳聋”或者“非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋”，是指遗传性耳聋是发生在常染色体上的隐性等位基因所控制的，即需要两个等位基因均表现为隐性，该患者表现为患病。且由于c.128delg突变和c.1001+5g>c突变表现为复合杂合，只有两个位点均发生突变，患者才表现为患病。
28.本发明发现了常染色体隐性耳聋致病基因slc26a4上的致病位点c.128delg突变，该突变与患者另一条染色体上同一个基因的突变c.1001+5g>c构成复合杂合(in trans)，导致了常染色体隐性非综合征型耳聋的发生。该突变位点可以用于筛查常染色体隐性耳聋致病突变携带者,也可用于常染色体隐性耳聋患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为常染色体隐性耳聋的早期诊断、鉴别诊断及药物治疗提供科学依据。
29.需要说明的是，本文中所提供的slc26a4基因上的突变位点，可以用来作为非综合征型耳聋的标示，更具体地说是常染色体隐性非综合征型耳聋的标示；或者这些突变位点的出现用来说明生物样品患有非综合征型耳聋，更具体地说是患有常染色体隐性非综合征型耳聋。这并不意味着“非综合征型耳聋”、“常染色体隐性非综合征型耳聋”是作为slc26a4基因上该突变位点的一种限制。也就是说，如果要对slc26a4基因上的该突变位点所表征的疾病进行详细地指示或者说明时，可以知悉其可以说明该生物样品是患有非综合征型耳聋，更具体地说是常染色体隐性非综合征型耳聋；但是也完全可以根据具体目的或者针对对象不同，被直接告知患有遗传性耳聋，更或者说是患有耳聋。
30.本文中，野生型slc26a4基因的dna序列(例如内含子序列、外显子序列等)、rna序
列、编码蛋白信息等有关该野生型slc26a4基因的信息均在ncbi数据库中有收录，可以参考下述网址获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5172。本文中所示出的c.128delg突变、c.1001+5g>c突变均是以ncbi数据库中野生型slc26a4基因的cdna及内含子序列为参考而确定的。
31.本文中，所示出的c.128delg突变是指在野生型slc26a4基因的cdna上第128位碱基发生g碱基缺失。
32.为了方面查看，将野生型slc26a4基因的部分dna序列提供如下，c.128delg突变对应该部分野生型序列(seq id no:1)的双下划线加粗碱基即为发生的碱基g的缺失。
33.seq id no:1(对应ncbi数据库编号为ncbi reference sequence:nm_000441.1，对应的序列区段：intron1-exon2-intron2，其中以着重号...所标出的碱基为内含子序列)如下所示：
[0034][0035][0036]
相应地，slc26a4基因的c.128delg突变导致氨基酸改变，该氨基酸可以表示为p.arg43profster23,代表相较于野生型slc26a4基因所表达的氨基酸，经过突变的多肽的第43位氨基酸由精氨酸(arg)变为脯氨酸(pro)，同时发生移码，在移码23个氨基酸后发生终止(以第43位突变后的脯氨酸作为移码后的第一个氨基酸来计)。
[0037]
同样地，本文中，所示出的c.1001+5g>c突变是指在野生型slc26a4基因的8号内含子的第5位发生的g碱基突变为c碱基。
[0038]
为了方便查看，将野生型slc26a4基因的部分dna序列提供如下，如seq id no:2所示(其中双下划线加粗的碱基即为突变碱基，由碱基g突变为碱基c)。
[0039]
seq id no:2(序列区段：intron6-exon7-intron7-exon8-intron8，其中以着重号...所标出的碱基为内含子序列)
[0040][0041]
相应地，该slc26a4基因的c.1001+5g>c突变会影响剪切，导致氨基酸发生移码突
变。
[0042]
需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以收录于ncbi数据库中的内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列等可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准确定，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
[0043]
而且，本领域技术人员能够理解的是，本文中所使用的野生型slc26a4基因序列位置是以人类基因组grch38中野生型slc26a4基因的序列为准，但当该野生型slc26a4基因存在于其他物种时，该序列可能会有所差异，可以将该物种的野生型slc26a4基因与人类基因组中野生型slc26a4基因进行比对，获得该物种的野生型slc26a4基因中所对应的位置。
[0044]
基因突变
[0045]
在本发明的一个方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型slc26a4基因相比，具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变。发明人发现该基因上的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变与非综合征型耳聋(如常染色体隐性非综合征型耳聋)的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型耳聋。
[0046]
基因突变通常指基因在结构上发生碱基对组成或者排列顺序的改变。本文中，基因突变是指发生在slc26a4基因上的碱基的缺失、插入、替换等。该基因突变是可以被检测的或者说是可以被辨别的，其可以作为slc26a4基因上的一个突变位点被检测或者辨别，也可以被作为slc26a4基因的部分核酸或者slc26a4基因的全部核酸被检测或者辨别。当然也可以称该基因突变是可以被甄选的。可以采用本领域常用的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂等，对上述基因突变进行检测。
[0047]
核酸
[0048]
在本发明的又一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型slc26a4基因相比，所述核酸具有下列的突变：c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变。发明人发现slc26a4基因的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，从而通过检测上述核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型耳聋。
[0049]
对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及slc26a4基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0050]
多肽
[0051]
在本发明另一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，与所述野生型slc26a4基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有下列突变：p.arg43profster23和/或c.1001+5g>c突变所引起的氨基酸移码突变。如前所述，slc26a4基因的c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，该突变基因所表达的蛋白也与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而通过检测上述多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型耳聋。
[0052]
检测前面所述的核酸、基因突变、多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的用途
[0053]
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的基因突变或前面所述的核酸或前面所述的多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断非综合征型耳聋。如前所述，前面所述的基因突变、核酸、多肽与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂，可以用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品。
[0054]
根据本发明的实施例，所述非综合征型耳聋为常染色体隐性非综合征型耳聋。
[0055]
根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别所述多肽的抗体与所述多肽的特异性结合来检测待测样品中是否存在上述突变，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述多肽是否存在；发明人还可以通过预先设计特异性识别所述核酸或基因突变的探针，通过探针与上述核酸或基因突变位点所在的核酸片段发生互补配对，来鉴别上述核酸或基因突变的存在；发明人还可以设计用于扩增上述基因突变所在外显子的特异性引物，进而通过基因扩增以及测序，确定上述基因突变是否存在；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述发生p.arg43profster23的多肽和/或c.1001+5g>c突变引起的氨基酸移码突变的多肽是否存在。所提供的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一，能特异性、高灵敏性地筛选出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的多肽，进而特异性、高灵敏性地筛选出患非综合征型耳聋，尤其是患常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品，进而能有效用于制备筛选患非综合征型耳聋，尤其是患常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品的试剂盒或者设备。
[0056]
生物模型
[0057]
在本发明的另一方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)前面所述的核酸；(2)前面所述的基因突变；(3)表达前面所述的多肽。根据所提供的生物模型，能有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究的模型。这些生物模型可以是细胞模型也可以是动物模型。
[0058]
试剂在制备药物中的用途
[0059]
在本发明的又一方面，本发明提出了特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗非综合征型耳聋。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型耳聋的发病密切相关，由此，由这些能够特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂所制备的药物能有效用于治疗非综合征型耳聋。
[0060]
根据本发明的实施例，所述试剂为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，crispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，发明人可以设计出
sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与dcas9在细胞中共表达，通过grna介导d cas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
[0061]
治疗非综合征型耳聋的药物
[0062]
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种用于治疗非综合征型耳聋的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于治疗非综合征型耳聋。
[0063]
根据本发明的实施例，所述试剂为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，crispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，发明人可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与dcas9在细胞中共表达，通过grna介导d cas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
[0064]
构建体及重组细胞
[0065]
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。将所提供的构建体转化受体细胞获得重组细胞，能够有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
[0066]
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受限制，其包括但不限于质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(cosmid)、病毒中的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna、rna，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为dna，因为dna相对于rna而言，其更稳定，并且易于操作。
[0067]
在本发明的再一个方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的相关研究的模型。
[0068]
根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。
[0069]
检测非综合征型耳聋的试剂盒
[0070]
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种检测非综合征型耳聋的试剂盒。根据
本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测前面所述的核酸的试剂，和/或检测前面所述的基因突变的试剂，和/或检测前面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型耳聋的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品。
[0071]
筛选患非综合征型耳聋的生物样品的方法
[0072]
除了上述内容之外，本发明还提出了一种筛选患非综合征型耳聋的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：
[0073]
从生物样品提取核酸样本；
[0074]
基于所述核酸样本，确定所述核酸样本的核酸序列；
[0075]
基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型slc26a4基因相比是否具有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变，判断所述生物样品是否患非综合征型耳聋，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型slc26a4基因相比有且仅有c.128delg突变和/或c.1001+5g>c突变，是所述生物样品患有非综合征型耳聋的指示。所提供的筛选患非综合征型耳聋的生物样品的方法，可以有效地筛选患非综合征型耳聋，尤其是常染色体隐性非综合征型耳聋的生物样品。
[0076]
首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品slc26a4基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选患非综合征型耳聋的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中slc26a4基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组dna，也可以是该全基因组中包含slc26a4基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总rna，也可以是从生物样品中提取的mrna。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组dna。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用rna作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取rna样本，优选rna样本为mrna；以及基于所得到的rna样本，通过反转录反应，获得cdna样本，所得到的cdna样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用rna作为核酸样本筛选患非综合征型耳聋的生物样品的效率。
[0077]
对所得到的核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制，例如可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体实施例，可以利用选bgiseq-500、bgiseq-500rs、hiseq2000、solid、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据
本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自bgiseq-500、bgiseq-500rs、hiseq2000、solid、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集slc26a4基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。可以采用外显子靶向序列富集系统如：华大自主外显子捕获芯片，aglient sureselect，nimblegen等其他外显子或目标区域捕获平台，对目标片段进行富集。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自slc26a4基因特异性引物的至少一种，对核酸样本进行pcr扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过pcr扩增，富集slc26a4基因外显子，从而能够进一步提高筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。根据本发明的实施例，slc26a4基因特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库grch37.1/hg19，采用primer3.0在线设计获得，例如可以参考ucsc(http://genome.ucsc.edu/)，应用primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(生工生物工程公司合成)，并利用primer-blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。
[0078]
针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如illumina公司所提供的规程，例如参见illumina公司multiplexing sample preparation guide(part#1005361；feb 2010)或paired-end sampleprep guide(part#1005063；feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0079]
需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应slc26a4基因的编码序列即可。
[0080]
最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸序列与参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述的突变时，即指示生物样品患非综合征型耳聋。由此，通过根据本发明实施例的筛选患非综合征型耳聋的生物样品的方法，可以有效地筛选患非综合征型耳聋的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用soapaligner/soap2进行比对。
[0081]
需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选患非综合征型耳聋的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法，例如用作科研或者其他试剂盒的生产工艺等应用中。
[0082]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0083]
实施例1确定常染色体隐性耳聋致病突变
[0084]
1、样本搜集
[0085]
发明人搜集到一个中国汉族常染色体隐性非综合征型耳聋患者trio家系(父母+先证者)，其家系图见图1。
[0086]
如图1所示，该家系包含3名成员，女儿为耳聋患者(即家系图中的ii-1)、父母为正常人(即家系图中的i-1、i-2)，符合常染色体隐性遗传模式。其中，实心图标为患者，半实心图标为携带者，箭头所指为先证者。
[0087]
该家系中患者的纯音测听结果见图2所示。在图2中，横坐标表示纯音的频率，纵坐标表示听力级别，如果听力正常，阈值曲线应该是在0附近浮动。如图2所示，纯音测听结果显示患者ii-1双耳极重度耳聋。
[0088]
发明人收集该家系内所有成员的外周血样，加入edta抗凝，-80摄氏度保存。所有血样均已签属知情同意书。
[0089]
2、dna提取
[0090]
取上述家系所有成员的外周血，分别利用qiamp bloodkit(qiagen,hilden,germany)抽提外周血白细胞的基因组dna，并利用qubitfluorometer和琼脂糖凝胶电泳测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dna od260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于50纳克/微升，总量不少于3微克。
[0091]
3、捕获测序
[0092]
利用agilent等液相捕获系统，结合illumina hiseq2500的高通量测序技术，对所有家系成员的样本进行测序。捕获范围包括全基因组外显子区域(约占全基因组1％)，捕获区域总长可达50m，测序数据量10-12gb，100
×
有效测序深度。主要步骤包括打断、文库制备和上机测序。
[0093]
测序数据下机后，使用内部定制流程进行变异检测、注释以及数据库比对，根据人群频率、软件预测结果、家系分析等手段，确定候选致病位点。
[0094]
结果在患者的slc26a4基因上发现复合杂合c.[1001+5g>c]；[128delg]突变。家系分析显示，患者的父亲和母亲分别为c.1001+5g>c突变和c.128delg杂合携带者。
[0095]
根据slc26a4基因相关耳聋的隐性遗传模式，若c.[1001+5g>c]；[128delg]突变经sanger验证为真阳性，则上述两个构成复合杂合的变异可以基本确认为患者的耳聋致病原因。接下来经过sanger法对该复合突变进行了验证。
[0096]
实施例2 sanger法测序验证
[0097]
分别对实施例1中所提供的常染色体隐性非综合型耳聋患者家系中的所有家系成员(包括患者和听力正常的父母)的slc26a4基因进行检测：
[0098]
针对slc26a4基因的c.1001+5g>c和c.128delg突变设计引物，然后通过pcr扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，并测定属于突变型还是野生型，验证slc26a4基因的c.1001+5g>c和c.128delg突变是否在样本中检出。
[0099]
具体步骤如下：
[0100]
1、dna提取
[0101]
按照实施例1所述的dna提取方法，提取受试者外周静脉血中的基因组dna备用。
[0102]
2、引物设计及pcr反应
[0103]
首先，参考人类基因组参考序列grch37/hg19，分别针对slc26a4基因的c.128delg突变和c.1001+5g>c突变设计特异性引物，具体序列如下：
[0104]
针对slc26a4基因的c.128delg突变的引物序列如下：
[0105]
上游引物1：tttctgttcctcgctcttccc(seq id no:3，对应seq id no:1中波浪线所示出的序列)
[0106]
下游引物1：ttccctccccaaggcgtg(seq id no:4，与seq id no:1中波浪线所示出的序列反向互补)
[0107]
针对slc26a4基因的c.1001+5g>c突变的引物序列如下：
[0108]
上游引物2：atggtctctgtatcaaccaaca(seq id no:5，对应seq id no:2中的波浪线所示出的序列)
[0109]
下游引物2：ggagtatcagtgaaatgaagcttgt(seq id no:6，与seq id no:2中波浪线所示出的序列反向互补)
[0110]
然后，按照以下配比配制各dna样本的pcr反应体系以及进行pcr反应(分别利用不同的引物对进行扩增)：
[0111]
反应体系如下(20μl)：
[0112]
试剂名称单个反应标准量(μl)ddh2o12.810
×
buffer2.0dntp(2.5mm)2.0上游引物(10pmol)1.0下游引物(10pmol)1.0taq酶(5u/q)0.2dna模板1.0共计20.0
[0113]
pcr反应条件如下：
[0114][0115]
由此，获得各受试者基因组dna样本的pcr扩增产物。
[0116]
3、sanger测序
[0117]
将步骤2得到的pcr产物经纯化后，直接进行dna测序，测序使用abi3730xl型测序
仪进行正反向测序。测序结果如图3和图4所示。
[0118]
图3显示了患者家系中所有家系成员的slc26a4基因的c.1001+5g>c突变位点的代表性sanger测序验证峰图。由图3可知，患者与听力正常的父亲均为slc26a4基因c.1001+5g>c突变的杂合携带者，患者母亲为纯合野生型，提示患者的该突变来源自父亲。
[0119]
图4显示了患者家系中所有家系成员的slc26a4基因的c.128delg突变位点的代表性sanger测序验证峰图。由图4可知，患者与听力正常的母亲均为slc26a4基因的c.128delg突变的杂合携带者，患者父亲为纯合野生型，提示患者的该突变来源自母亲。
[0120]
结合以上信息，可以确认slc26a4基因的c.1001+5g>c和c.128delg突变所构成的复合杂合基因型是这个隐性耳聋家系中，耳聋患者ii-1的致病原因。
[0121]
实施例3检测试剂盒
[0122]
制备一检测试剂盒，其包含能够检测slc26a4基因的c.1001+5g>c和c.128delg突变的引物，用于筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品，其中，这些引物为slc26a4基因特异性引物，其序列如实施例2中seq id no:3～4以及seq id no:5～6所示。
[0123]
利用上述试剂盒筛选易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品的具体步骤为：
[0124]
按照实施例1的步骤2所述的方法提取待测者dna，以所提取的dna为模板与上述slc26a4基因的特异性引物进行pcr反应(pcr反应体系和反应条件参见实施例2)，并按照本领域常规方法对pcr产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.1001+5g>c和c.128delg突变，能够有效地检测本发明的slc26a4基因突变体在待测者dna中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患常染色体隐性非综合型耳聋，进一步，能够从待测者中筛选出易患常染色体隐性非综合型耳聋的生物样品。
[0125]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0126]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。