一种孝顺竹转录因子BmMYB83基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种孝顺竹(bambusamultiplex)转录因子bmmyb83基因及其应用。

背景技术：

myb转录因子是植物中最大的一类转录因子之一，参与了植物生长发育过程中的多种活动，包括胁迫响应(baldoni，e.等，internationaljournalofmolecularsciences，16，15811-15851，2015)、激素合成(wang等，bmcgenomics，16：17，2015)、信号转导。而在植物细胞壁次生生长的过程中，myb转录因子呈现出层级网络的调控方式，参与细胞壁纤维素、半纤维素与木质素等成分的合成。其中myb46与myb83是网络调控的主开关，被两类nac转录开关因子直接调控(zhang等，frontiersinplantscience，9：1535，2018)。

有遗传学的研究表明，myb46和myb83的拟南芥双突变体会产生严重的次生壁合成缺陷，而过表达两个基因则可激活纤维素、木质素和木聚糖等合成基因的表达上调(zhong等，plantcell，19(9)，2776-2792，2007；ko等，plantjournal，60(40)，649-665，2009；mccarthy等，plantcellphysiology，50(11)，1950-1964，2009)；而在拟南芥myb46myb83双突变体中过表达osmyb46或者zmmyb46可在一定程度上恢复表型缺陷，此外，在拟南芥中分别过表达osmyb46和zmmyb46可导致很严重的叶片卷曲表型(zhong等，plantcellphysiology，52(10)，1856-1871，2011)。

目前对竹类植物中myb转录因子的研究仅在毛竹中有所体现。研究人员将毛竹中pher2r3mybs转录因子用系统分析的方法归类为17个亚组，并通过在拟南芥中异位表达phemyb4-1的技术验证了该基因可增加植株的耐寒性，以及提高了植株对干旱和盐胁迫的敏感性(hou等，frontiersinplantscience，9，738，2018)。除此之外，对于竹类植物中其他myb转录因子的研究几近空白。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种孝顺竹转录因子bmmyb83基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述孝顺竹转录因子bmmyb83基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种孝顺竹转录因子bmmyb83基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述孝顺竹转录因子bmmyb83基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述孝顺竹转录因子bmmyb83基因的载体。

所述孝顺竹转录因子bmmyb83基因在使植物表型发生植株矮化、叶片卷曲、花茎数量增多或根长缩短的改变中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

1)构建所述孝顺竹转录因子bmmyb83基因的载体；

2)将所构建的转录因子bmmyb83基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到植株矮化、叶片卷曲、花茎数量增多或根长缩短的植物。

所述的应用中，所述的植物为拟南芥或水稻。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明借助模式植物拟南芥和水稻来挖掘孝顺竹中myb转录因子资源，提供的转录因子bmmyb83，其核苷酸序列如seqidno.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为seqidno.2所示。通过基因克隆表达与对比分析，揭示了孝顺竹bmmyb83转录因子编码基因系统进化地位，并提供了一种应用该基因的方法，过表达该基因可使拟南芥植株株型改变，包括植株矮化、叶片卷曲、花茎数量增多等；也可使水稻根长缩短。叶片卷曲、花茎数量增多是农艺中有用的性状，根长缩短和植株矮化也是农作物育种中有用的性状改变，本发明的基因将在植物性状改良中发挥重要作用。

附图说明

图1为bmmyb83转录因子扩增产物凝胶电泳图谱图；

图2为bmmyb83转录因子系统发生树图；

图3为bmmyb83转录因子氨基酸序列比对图；

图4为bmmyb83转基因水稻与野生型水稻“日本晴”植株的根长表型图，wt表示野生型植株，line4，10，14，17分别表示转基因水稻的不同株系；

图5为bmmyb83转基因拟南芥与野生型拟南芥植株叶片表型图，其中col-表示拟南芥哥伦比亚野生型植株，line1，2，4，5，6，8分别表示转基因植株的不同株系；

图6为bmmyb83转基因拟南芥与野生型拟南芥植株整体株型、植株大小、花茎数量图，line1，4，8分别表示转基因拟南芥的不同株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：孝顺竹bmmyb83转录因子编码基因的获得

1.rna提取

提取材料为孝顺竹竹笋，rna提取使用原平皓rnapure超纯快速提取试剂盒，按照操作说明书提取，贮存于-80℃备用

2.cdna第一链合成和反转录pcr

采用全式金(北京)one-stepcdna合成试剂盒，按照操作指南将总rna反转录成cdna。反应体系和反应条件分别为：2μg制备的总rna，anchoredoligo(dt)18primerlμl，10μl的2×tsreactionmix，1μltransscriptrt/rienzymemix，1μl的gdnaremover，加rnase-freewater补到20μl，轻轻混匀后离心。pcr仪42℃反转录30min，85℃5s；冰上冷却；离心后存放于-20℃待用。

3.pcr扩增bmmyb83的cds区域

根据孝顺竹转录组测序及基因注释结果，获得myb83的基因全长序列，其序列id为bmuun039904。在其cds区域以外的上下游设计两条引物myb83-s(5′-agccctttttccatccttg-3′)和myb83-a(5′-gtactccttggcagcagcta-3′)作为pcr反应的引物。

所用pcr酶为toyobo高保真酶，反应体系为50μl：ddh2o，34μl；10×buffer，5μl；dntp，5μl；mg²⁺，2μl；正向引物，1μl；反向引物，1μl；cdna，1μl；kod-plus酶，1μl。pcr程序为：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃55s，循环38次；72℃10min。将所得pcr产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约1152bp的片断，如图1所示。纯化回收后，送金斯瑞生物科技有限公司(南京)测序。测序结果如seqidno.1所示，核苷酸序列长度为1152bp；其表达序列如seqidno.2所示，由383个氨基酸残基组成的蛋白质。

实施例2：孝顺竹bmmyb83转录因子功能分析

1.序列比较分析

为了分析孝顺竹bmmyb83同其他物种myb转录因子的亲缘关系，用mega7建立了bmmyb83同其他物种myb转录因子的系统进化树。结果(图2)表明bmmyb83与模式植物水稻中的osmyb83及osmyb46亲缘关系最近，同属一簇。

用dnaman分析了bmmyb83与其他物种中亲缘关系相近的myb转录因子的同源性。结果(图3)表明bmmyb83与水稻中osmyb83有较高的同源性，序列相似度为58.84％。而与水稻osmyb46及拟南芥atmyb83的序列相似度分别为39.44％和38.39％。

2.水稻转基因分析

2.1载体构建

测序正确的pcr产物连接至全式金(北京)的peasy-blunt载体上，连接体系为：4.5μldna，0.5μlvector。轻轻混匀后室温放置5min，然后置于冰上。

取感受态细胞trans1-t1置于冰上融化，加入上述连接后的载体，轻弹混匀，冰浴30min；42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min；加入1ml室温的不含抗生素的lb培养基，200rpm37℃培养1h；8000rpm离心1min获得菌体，吸去大部分上清，留200μl培养基重悬菌体。涂布至含有氨苄卡纳霉素lb平板；置于37℃培养箱过夜培养。挑取10个单克隆至含4mllb培养基的试管中分别摇菌，37℃200rpm18小时后，抽提质粒，并送质粒至金斯瑞公司测序。测序正确的质粒命名为peasy-blunt-bmmyb83。

2.2表达载体构建

该部分由武汉伯远生物公司代为操作。

设计有酶切位点的引物进行pcr反应，引物序列分别为：

bmmyb83(+)：5′-cagtcgtctcacaacatgaggaagccggagttccc-3′；

bmmyb83(-)：5′-cgatcgtctcattcaacttggaaatcaagga-3′；

融合gfp(+)：5′-cagtggtctcatccctgtatcgtgaagggcgagga-3′；

融合gfp(-)：5′-cagtggtctcatacatcagttgtagagctcgtcca-3′。

2个50μl的反应体系：buffer，5μl；dntps，2μl；正向引物，2μl；反向引物，2μl；cdna，1μl；ddh2o，34μl；taq酶，2u；mg²⁺，4μl。pcr程序为：94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃56s，循环30次；72℃10min，16℃30min。1％琼脂糖凝胶电泳后，分别将1149bp与717bp的电泳条带切下，放在同一个体系中溶胶回收(回收产物标记为：rdnamg2)，测序无误后进行酶切连接。

载体酶切体系为20μl：buffer：2μl，bsai/eco31i：1μl，pbwa(v)hu-ccdb：4μl，h2o：13μl。37℃1h。rdnamg2酶切体系为20μl：buffer：2μl，bsai/eco31i：1μl，rdnamg2：4μl，h2o：13μl。37℃1h。

将载体酶切物与回收片段酶切产物合并回收，pcr纯化试剂盒纯化之后进行连接，连接体系为10μl：buffer：1μl，t4-1igase：1μl，h2o：5.5μl，回收产物：2.5μl。20℃1h。

将5-10μl连接产物转化大肠杆菌感受态，涂卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，挑取10个菌斑同时进行1.5mlep管接菌和pcr鉴定。鉴定所用引物为pbwa(v)hu-ccdb鉴定引物：pubiseq+，nosseq-r，pbw2+，pbw2-。

检测引物组1：

pubiseq+：5′-cctgccttcatacgctatttatttgcttgg-3′

nosseq-r：5′-caagaccggcaacaggattcaatc-3′

检测引物组2：

pbw2+：5′-gcaacgctctgtcatcgttacaat-3′

pbw2-：5′-gcgattaagttgggtaacgccaggg-3′

pcr反应鉴定，反应体系为25μl，组分为：h2o：16.5μl，buffer：2.5μl，mg²⁺：2μl，dntp：1μl，pubiseq+/pbw2+：1μl，nosseq-r/pbw2-：1μl，taq酶：1u，template：1μl。反应程序为：94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃56s，30个循环；72℃10min；16℃30min。目标条带为1456bp左右的片段。

取1～3个阳性条带对应的菌液100μl送样测序，其余400μl菌液接种到含有卡纳霉素抗性的5-10ml的lb中，试管摇菌，送菌液测序，与bmmyb83序列一致的菌液提取质粒待转化农杆菌。

2.3农杆菌转化

1)200ng质粒，加40μl农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化(u，1.8kv；r，200ω；c，25μf)。

2)电击后添加800μlsoc液体培养基，28℃培养1h；soc液体培养基成分为：2％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，10mmnacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2，20mm葡萄糖。

3)4000rpm离心10分钟收集菌体，200μlsoc重悬，涂在含100μg/ml壮观霉素，利福平40μg/ml，链霉素100μg/mllb固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。

2.4农杆菌介导的水稻愈伤组织的转化

(1)水稻愈伤组织的诱导

取粳稻品种“日本晴”的成熟种子，机械脱壳，挑选饱满无菌斑优质种子，进行消毒；将消毒过后的种子接种到愈伤组织诱导培养基上进行诱导，以水稻成熟胚为材料诱导愈伤组织。

愈伤诱导培养基(nb)：n6大量元素+b5微量元素+b5有机物+fe盐+30g/l蔗糖+500mg/l谷氨酰胺+500mg/l脯氨酸+300mg/l水解酪蛋白+2mg/l2，4-d+3.0g/l植物凝胶，调节ph至5.8。

n6大量元素包括：1650mg/lnh4no3，1900mg/lkno3，440mg/lcacl2·2h2o，370mg/lmgso4·7h2o，170mg/lkh2po4。

b5微量元素包括：0.83mg/lki，6.2mg/lh2bo3，22.3mg/lmnso4.4h2o，8.6mg/lznso4.7h2o，0.25mg/lna2moo4·2h2o，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.025mg/lcocl2·6h2o。

b5有机物包括：100mg/l0肌醇，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l盐酸吡哆醇，0.1mg/l盐酸硫胺素，2mg/l甘氨酸。

(2)农杆菌转化

按照eha105感受态操作说明书进行。取-80℃保存的农杆菌感受态室温融化，使其处于冰水混合状态时插入冰中；每100μl的感受态加入0.01～1μg构建好的目的基因的质粒，轻轻拨打离心管底部混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min；加入700μl无抗的lb液体培养基，20℃震荡培养2～3h；6000rpm离心1min，去大部分上清，留100μl左右上清轻轻吹打重悬菌体，涂含有卡纳霉素、利福平的lb板，倒置培养2～3d。

挑取农杆菌单菌落，置于含适量抗生素的yeb培养基中，28℃，220rpm摇菌培养，摇至od值约为1～1.2；5000rmp离心10min，去上清，用蔗糖悬浮液(5％蔗糖和0.03％表面活性剂silwet)重悬菌体，调od600值至0.8～1.0，光下活化2～3h。

yeb培养基为：牛肉浸膏5g/l，酵母提取物1g/l，蛋白胨：5g/l，蔗糖：5g/l，mgso4·7h2o：0.5g/l，调ph为7.0，kana：50mg/l，rif：50mg/l。

(3)水稻愈伤组织的筛选及分化

挑选浅黄色、颗粒状、质地比较坚硬密实的愈伤组织，置于携带目的基因的农杆菌悬浮液中侵染，之后置于共培养基上培养。共培养基为：n6大量元素+b5微量元素+b5有机物+fe盐+30g/l麦芽糖+500mg/l水解酪蛋白+2g/l肌醇+100μmol/las+3g/l植物凝胶+2mg/l2，4-d，ph调为5.5。

将长势良好的愈伤组织取出晾干，转入筛选培养基上进行第一次筛选，将具有抗性愈伤的初始愈伤组织转入新的培养基进行第二次筛选。最后挑选抗性愈伤，移入分化培养基进行诱导分化成苗，待苗生长至1cm左右再移至生根培养基。同时进行不侵染农杆菌的愈伤组织的诱导及分化作为野生型对照苗。

筛选培养基为：nb+50mg/l潮霉素+200mg/l头孢唑林钠+200mg/l羟苄青霉素，ph调为5.8。

愈伤预分化培养基为：nb+20g/l山梨醇+5mg/laba+3mg/lcuso4+3mg/lba+1mg/lnaa+50mg/l潮霉素+100mg/l头孢唑林钠+100mg/l羟苄青霉素，ph调为5.8。

愈伤分化培养基为：n6大量元素+b5微量元素+b5有机物+20g/l蔗糖+20g/山梨醇+500mg/l水解酪蛋白+2mg/lba+1mg/lnaa+50mg/l潮霉素+3.0g/l植物凝胶+100mg/l羟苄青霉素+100mg/l头孢唑林钠，ph调为5.8。

生根培养基为：1/2ms+20g/l蔗糖+3.0g/l植物凝胶+100mg/l羟苄青霉素+100mg/l头孢唑林钠，ph调为5.8。

(4)水稻阳性克隆苗的鉴定

水稻试管苗长至10cm左右大小，通过ctab法提取dna，对试管苗进行pcr鉴定。具体步骤为：

研磨：取转基因苗，加入ctab研磨好后，再加适量的ctab；水溶：30min，每10min摇一次；将样品冷却至正常温度后，加氯仿异戊醇，体积与ctab相同，振荡20min；离心10min，将上清转移至ep管中；加0.7倍的异丙醇(提前放入-20℃冰箱中预冷)，轻摇，可观察丝状物，放入冰箱中静置30min；离心5min，弃上清；用70％的酒精清洗，移液枪吹打使其悬浮，每管均需加入ddh2o和rna酶；1％琼脂糖凝胶检测。

将检测为阳性克隆的水稻苗置于水稻培养箱中进行培养，打开瓶盖进行练苗，培养条件为光照700um，温度28℃，湿度rh70％，光照14h，黑暗10h。三天后取出小苗，冲洗掉根部培养基，使用盆栽的方法进行培养，所用土壤为大田土。

将bmmyb83转基因植株收种后，与野生型种子在相同条件下催芽，出芽后用水稻营养液培养一周后观察其表型发现，在两者苗高无明显差异的情况下，所得转基因水稻植株的根系长度比野生型要短(图4)。

3拟南芥转化

3.1播种

取泥炭土、蛭石、珍珠岩按照1∶3∶0.5的比例混合均匀，121℃高压灭菌20min备用。将灭菌土装入育苗钵，底部浇水(第一次浇水可加入浓度为1g/l的花无缺)，待钵内土壤吸水变潮湿即可播种。取野生型哥伦比亚col-0的种子放入4℃冰箱一周左右，取出后均匀撒入土中，覆盖保鲜膜，放入人工气候箱培养，培养温度为24℃，光照120um。待拟南芥出苗展开第一对真叶后(约10天左右)，除去保鲜膜，培养至盛花期备用。

3.2农杆菌转化

同2.4中(2)农杆菌转化。

3.3花序浸染法转化拟南芥

取盛花期的拟南芥3～4盆，提前剪掉结实果荚和已经盛开的花，将花序在活化后的悬浮液中浸没14s左右，潮湿黑暗环境培养24h后取出，放入培养箱正常培养。

3.4筛选、观察与鉴定

1)当拟南芥长角果变黄或棕色时，套袋并停止浇水使植株慢慢枯死后统一收种，得到转基因t0种子；

收获后的t0代种子放入4℃冰箱低温处理7d左右(春化)；

配制ms固体培养基，高压灭菌后放入超净工作台中慢慢降温，培养基温度降到约50℃时加入潮霉素，潮霉素浓度为20mg/l。同时配制无潮霉素的ms培养基备用；

取适量春化后的转基因t0代种子，75％乙醇消毒5min，无菌水洗5遍，均匀撒在含潮霉素的ms板上，同时铺野生型col-0的种子在不含抗的ms培养基上作为对照；

将平板放入培养箱培养，待抗性ms培养基上的幼苗生根且第一对真叶展开(一般需要12～14d)，即可移栽幼苗至灭菌的土壤中，浇足水覆盖保鲜膜直至成活再除去保鲜膜。

2)取不同株系的转基因阳性苗的1～2片莲座叶利用trizol法分别提取rna，操作步骤参考说明书，所用离心管、枪头等耗材均为rnase-free。

取1～2片叶片液氮磨样，加入1mltrizol，用枪头吹打混匀，室温静置5min；每1mltrizol加入200ml氯仿，剧烈震荡30s，室温静置3min；于10000g4℃离心15min；取出后把上层的水相(每1mltrizol约600μl上清)转移到新的离心管中；加入500μl异丙醇颠倒混匀，室温静置10min；10000g4℃离心10min，在管底和管壁会有胶状沉淀；去上清，加入1ml75％的乙醇(depc水配制)，漩涡剧烈震荡；7500g4℃离心5min；去掉上清，室温放置5min左右，尽可能去除乙醇；加入55μlrna溶解液，在55～60℃温度下溶解10min；1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取rna的完整性。

反转录方法参考实施例1中的cdna第一链合成和反转录pcr，cdna稀释10倍后备用。

qrt-pcr酶为南京诺唯赞的chamq^tmuniversalsybr，体系为20μl：h2o，7.2μl；mix，10μl；上/下游引物：0.4μl；cdna模板，2μl。设定程序预变性95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。col-0作为转基因株系的对照，actin作为内参。

qrt-pcr实验鉴定所用引物序列如下：

atmyb83-s：5′-ccaacagcccatgagcagg-3′

atmyb83-a：5′-acgaggatcggcaccacg-3′

atactin-s：5′-ctctccgctttgaattgtctcgttg-3′

atactin-a：5′-ggtaccattgtcacacacgattggt-3′

所得转基因拟南芥1，2，4，5，6，8株系的bmmyb83的表达量分别为107.63，142.43，107.86，27.68，10.95，12.11。其表型呈现出温和(line2，5，6)或者严重(line1，4，8)的叶片卷曲现象(图5)；植株矮化且花茎数量增多(图6)的特性。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种孝顺竹转录因子bmmyb83基因及其应用

<130>100

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1152

<212>dna

<213>bambusamultiplex

<400>1

atgaggaagccggagttcccggcgacgaagggtggtagcggcgccgtggcggggtgtggg60

ggaaacggcaatgcggctgcggctgcggcggcggcgaagctgcgaaaggggctctggtcg120

ccggaggaggacgagaagctggtggcgtacatgctgcggagcgggcaggggtcgtggagc180

gacgtggcgcgcaacgccgggctgcaaaggtgcggcaagagctgccgcctccggtggatc240

aactacctccgccccgacctcaagcgcggcgccttctcgccgcaggaggaggagctcatc300

gtcaacctccgcgccatccttggcaacaggtggtctcagatcgctgcccggctgccgggg360

cgcaccgacaacgagatcaagaacttctggaactccaccatcaagaagcgcccgaagaac420

tcggcggcgtcctctccggcgacgaccgactgcgcgtcgccgccggagcccaagctcccg480

gtcgacggcggcgccagctgcctcgacctcgccggcgtcgaggacggcgcccaccatgca540

atgaaaagcatgtgggtggactcgtcctcctcatcatcctcgtcgctgcagagccggccg600

tccgcgatggcggcggcggctgccaggagctacggcggcctcctccagctgccagaccaa660

gtctgcggcgtggcggcctacacgctggcgccgttcttccacgaccatgcatcgttcaaa720

tttgctgcattgcatggtggtggttactacggaagcactcaccaagggatggcaatggaa780

ggaggtggaagcttcataggaggaggtgaaagcagcgtgctctatagtgtgccccctctg840

ctagagcccatagcagtagaagaagaccagaccataatggcatcaagtaacaacaccact900

accaaccctgaaaacaacagcaacaacactactactgagactaccacacagagtagcaac960

aatggcagcagcatcacagacaacaacagtagcaacaacaagaacatcaacattagccta1020

ctgagcaacgatgtggtctactgggaggcaggtcaccaacagcccatgagcaggaatgtc1080

atgggggagtgggacctggagttgatgaaagatgtgtcatccttacctttccttgatttc1140

caagttgaatga1152

<210>2

<211>383

<212>prt

<213>bambusamultiplex

<400>2

metarglysproglupheproalathrlysglyglyserglyalaval

151015

alaglycysglyglyasnglyasnalaalaalaalaalaalaalaala

202530

lysleuarglysglyleutrpserproglugluaspglulysleuval

354045

alatyrmetleuargserglyglnglysertrpseraspvalalaarg

505560

asnalaglyleuglnargcysglylyssercysargleuargtrpile

65707580

asntyrleuargproaspleulysargglyalapheserproglnglu

859095

glugluleuilevalasnleuargalaileleuglyasnargtrpser

100105110

glnilealaalaargleuproglyargthraspasngluilelysasn

115120125

phetrpasnserthrilelyslysargprolysasnseralaalaser

130135140

serproalathrthraspcysalaserproprogluprolysleupro

145150155160

valaspglyglyalasercysleuaspleualaglyvalgluaspgly

165170175

alahishisalametlyssermettrpvalaspserserserserser

180185190

serserserleuglnserargproseralametalaalaalaalaala

195200205

argsertyrglyglyleuleuglnleuproaspglnvalcysglyval

210215220

alaalatyrthrleualaprophephehisasphisalaserphelys

225230235240

phealaalaleuhisglyglyglytyrtyrglyserthrhisglngly

245250255

metalametgluglyglyglyserpheileglyglyglygluserser

260265270

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