低分子量猴头菌多糖及其制备方法与应用与流程

本发明涉及药用菌多糖的提取纯化技术领域，尤其涉及一种低分子量猴头菌多糖及其制备方法与应用。

背景技术：

猴头菌(hericiumerinaceus)是一种珍贵的药食两用菌，其子实体和菌丝体含有大量多糖、多肽、低聚糖和脂肪族酰类等重要活性物质。其中，多糖是猴头菌中含量最丰富的生物活性物质。现代药理研究结果表明，猴头菌多糖提取物具有治疗慢性胃炎、抗氧化、增强免疫力等功效，且具有许多潜在的药用价值。

机体胃黏膜细胞损伤很常见，尤其是氧化损伤，此类损伤可以进一步诱发胃痛、胃穿孔以及十二指肠胃溃疡等。相比传统制酸剂和胃黏膜保护化学制剂，猴头菌多糖因其作用靶点多、安全性好的作用特点而受到广泛关注。但是，目前现有研究多数集中于猴头菌多糖的粗放制备，制得的猴头菌多糖的分子量较大；与之对应的低分子量猴头菌多糖及其制备方法则鲜见报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种低分子量猴头菌多糖的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的低分子量猴头菌多糖。

本发明的再一目的在于提供上述低分子量猴头菌多糖的应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种低分子量猴头菌多糖的制备方法，包括如下步骤：将猴头菌进行水提、醇沉、脱色、脱蛋白、纯化、分离，得到低分子量猴头菌多糖；具体包括如下优选步骤：

(1)将猴头菌粉末进行水提，得到猴头菌多糖水提物；

(2)向步骤(1)得到的猴头菌多糖水提物醇沉，收集沉淀，干燥，得到多糖粗提物；

(3)用水将步骤(2)得到的多糖粗提物溶解，得到粗多糖溶解液；将粗多糖溶解液和大孔树脂混合进行脱色，固液分离，将得到的液体干燥，得到脱色的粗多糖；

(4)用水将步骤(3)得到的脱色的粗多糖溶解，使用蛋白酶进行酶解脱蛋白，过滤，得到脱色脱蛋白的粗多糖溶液；

(5)将步骤(4)得到的脱色脱蛋白的粗多糖溶液透析，超滤，离心，得到分子量＜10kda的粗多糖溶液；

(6)将步骤(5)得到的分子量＜10kda的粗多糖溶液采用柱层析进行纯化，浓缩，干燥，得到低分子量猴头菌多糖。

步骤(1)中所述的猴头菌粉末是将猴头菌子实体干燥、粉碎、过筛后得到的粉末。

所述的干燥的温度为40～70℃；优选为50℃。

所述的过筛为过80～120目筛；优选为过100目筛，得到的猴头菌粉末的颗粒尺寸约为150μm。

步骤(1)中所述的水提的方法如下：将水与猴头菌粉末混匀，加热，固液分离，得到的药渣重复提取0次以上；将得到的提取液合并。

所述的水的用量为按照猴头菌粉末：水＝料液比为1：10～1：20(g：ml)配比计算；优选为按照猴头菌粉末：水＝料液比为1：15(g：ml)配比计算。

所述的加热为70～100℃条件下水浴1～5h；优选为85℃条件下水浴3h。

所述的水为蒸馏水。

所述的重复提取的次数优选为3次。

所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的离心的条件为2000～5000rpm离心10～20min；优选为3000rpm离心15min。

步骤(2)中所述的醇沉中所用的醇优选为乙醇。

所述的乙醇的用量为按照醇在醇沉体系中的浓度为体积比80～85％计算；优选为按照醇在醇沉体系中的浓度为体积比85％计算。

步骤(2)中所述的收集沉淀的方式优选为抽滤。

步骤(3)中所述的大孔树脂为食品级d315大孔树脂；其用量按相当于粗多糖溶解液1/3～1/2体积计算。

步骤(3)中所述的脱色优选在搅拌状态下进行。

所述的搅拌为200～500rpm搅拌2～5h；优选为300rpm搅拌4h。

步骤(2)和(3)中所述的干燥为-0.1mpa、50℃条件下真空干燥。

步骤(4)中所述的脱色脱蛋白的粗多糖溶液为了更有利于进行步骤(5)中的透析，优选还包括浓缩或干燥步骤，使其体积进一步缩小。

步骤(4)中所述的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种；优选为木瓜蛋白酶。

所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶时，调整ph值至4～6；优选为调整ph值至5.5。

所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，调整ph值至6～8；优选为调整ph值至7.5。

所述的蛋白酶为胃蛋白酶时，调整ph值至2～4；优选为调整ph值至2.5。

所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶时，调整ph值至6～8；优选为调整ph值至7.0。

所述的木瓜蛋白酶的用量为10～20u/mg；优选为15u/mg。

所述的胰蛋白酶的用量为5～15u/mg；优选为10u/mg。

所述的胃蛋白酶的用量为5～15u/mg；优选为10u/mg。

所述的菠萝蛋白酶的用量为10～20u/mg；优选为15u/mg。

步骤(4)中所述的脱蛋白的温度为55～60℃；优选为60℃。

步骤(4)中所述的脱蛋白的时间为3～8h；优选为4h。

步骤(5)中所述的透析是采用透析袋在离子水中透析24～36h；优选为透析36h。

所述的透析袋的截留分子量为3.5kda。

步骤(5)中所述的超滤的超滤膜截留分子量为10kda。

步骤(5)中所述的超滤优选采用milliporeamiconultra超滤离心管。

步骤(5)中所述的离心为25℃条件下7500g离心10min。

步骤(6)中所述的柱层析是采用deae-52纤维素树脂进行柱层析。

所述的deae-52纤维素树脂的上样量为柱床体积的1～5％。

步骤(6)中所述的浓缩为真空浓缩。

步骤(6)中所述的干燥为冷冻干燥。

一种低分子量猴头菌多糖，通过上述制备方法制备得到。

上述低分子量猴头菌多糖在制备预防和修复胃黏膜细胞氧化损伤药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的制备方法反应条件温和，制备过程绿色、环保，得到的低分子量猴头菌多糖保持了良好的活性。

2.本发明的低分子量猴头菌多糖分子量在10kda以下，将其用于预防和修复胃黏膜细胞氧化损伤效果更加显著，对ges-1细胞相对增殖率的提高分别达到69.07％和78.7％。

附图说明

图1是胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的脱蛋白效果图。

图2是猴头菌粗多糖hepc和低分子量猴头菌多糖hepw1的ft-ir谱图。

图3是猴头菌粗多糖hepc和低分子量猴头菌多糖hepw1的sem图。

图4是猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1及对照样品hep1的细胞毒性评估结果图。

图5是猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1及对照样品hep1预防胃黏膜细胞氧化损伤效果图；其中，a、b、c和d代表显著性差异水平，相同字母表示差异性不显著，b、c和d依次代表差异更显著。

图6是猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1及对照样品hep1修复胃黏膜细胞氧化损伤效果图；其中，a、b、c和d代表显著性差异水平，相同字母表示差异性不显著，b、c和d依次代表差异更显著。

具体实施方式

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

(1)选取福建省古田县的野生猴头菌子实体，50℃烘干至恒重，粉碎，过100目筛，得到颗粒大小均匀的猴头菌粉末。

(2)称取步骤(1)得到的猴头菌粉末50g，将其与蒸馏水按照料液比1：15(g：ml)混合并搅拌均匀，置于85℃条件下水浴3h，离心(3000rpm、15min)，得到猴头菌浸提液(初次)；补水至原体积，置于85℃条件下水浴3h，离心(3000rpm、15min)，得到猴头菌浸提液(2次)；补水至原体积，置于85℃条件下水浴3h，离心(3000rpm、15min)，得到猴头菌浸提液(3次)；合并三次水浴浸提液，得到猴头菌多糖水提物。

(3)向步骤(2)得到的猴头菌水提物中加入95％(v/v)的乙醇溶液，使乙醇浓度达到85％(v/v)，抽滤，收集沉淀，真空干燥(-0.1mpa、50℃)，得到多糖粗提物。

(4)将步骤(3)得到的多糖粗提物采用蒸馏水溶解，加入1/3溶解液体积的食品级d315大孔树脂，使用磁力搅拌器搅拌(300rpm、4h)，过滤，将滤液真空干燥(-0.1mpa、50℃)，得到脱色的粗多糖hepc。

(5)将步骤(4)得到的脱色的粗多糖hepc配制成溶液，分成四组，分别加入胰蛋白酶(ph值7.5、酶用量10u/mg)、胃蛋白酶(ph值2.5、酶用量10u/mg)、木瓜蛋白酶(ph值5.5、酶用量15u/mg)、菠萝蛋白酶(ph值7.0、酶用量15u/mg)，60℃条件下脱蛋白4h，然后通过苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝g-250法分别测定多糖损失率、蛋白质脱除率(周宏,黄芳,梁倩倩.响应面法优化龙须菜多糖提取工艺[j].食品工业科技,2013,34(7):260-264.；王琳炜,欧阳臻,张碧娟,等.霍山铁皮石斛多糖的脱蛋白工艺及结构初步分析[j].食品科学,2017,38(12):164-170.)。

结果显示，分别采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解之后，粗多糖hepc的多糖损失率分别为17.76％、34.21％、14.57％、15.23％，蛋白质脱除率分别为85.74％、80.32％、83.85％、72.38％，4种蛋白酶均具有较好的脱蛋白效果，其中，木瓜蛋白酶脱蛋白效果更优，具有高效、低损的性能(图1)。

(6)将步骤(4)脱色的粗多糖hepc溶解并将溶解液的ph值调整至5.5，向溶解液中加入适量的木瓜蛋白酶(ph值5.5、酶用量15u/mg)，混合均匀，60℃条件下处理4h，过滤取滤液，真空干燥(-0.1mpa，50℃)得到脱色脱蛋白的粗多糖。

(6)将步骤(5)中制得的粗多糖溶解、装入截留分子量为3.5kda的透析袋、置于去离子水中透析36h。

(7)收集步骤(6)中透析完成的粗多糖溶液采用milliporeamiconultra超滤离心管进行超滤(超滤膜的截留分子量为10kda)，7500g离心10min。

(8)收集步骤(7)中透析后的粗多糖溶液(分子量＜10kda)，然后通过deae-52纤维素柱层析纯化多糖(董文霞，刘萍，张京声，吴培培，杨革.deae-52纤维素静态法分离纯化桦褐孔菌多糖的工艺优化[j].食品工艺科技.2018，39(04)：154-158.)。

(9)收集步骤(8)中纯化后的多糖溶液并进行真空浓缩，之后进行冷冻干燥，制得精制的猴头菌多糖hepw1。

实施例2多糖样品的表征

(1)检测样品

实施例1的猴头菌粗多糖hepc；

实施例1的低分子量猴头菌多糖hepw1；

对照样品hep1(制备过程同实施例1，步骤(7)中使用的超滤膜的截留分子量为30kda)。

(2)检测方法

1)用0.02mol/l的kh2po4溶液分别溶解葡聚糖标准品、hepc、hepw1及hep1，样品浓度均为2.0mg/ml。色谱柱为tskg-5000pwxl(7.8×300mm)和tskg-3000pwxl(7.8×300mm)串联，waters2414示差检测器，柱温35℃，流动相为0.02mol/l的kh2po4缓冲溶液，其流速控制在0.6ml/min，进样量为20μl。各样品分别检测45min，再由breeze1gpc软件处理数据，并根据标准曲线方程计算出各样品的重均分子量。

2)将实施例1的猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1进行多糖的红外光谱分析(ft-ir)。称取5mg样品与50mg已干燥至恒重的溴化钾kbr研磨混合均匀，压制薄片，进行傅里叶变换红外光谱分析。

3)将实施例1的猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1进行扫描电镜分析(sem)。取少量干燥至恒重的样品，使用导电胶将样品分别固定于铜板上，对样品表面进行喷金处理，用扫描电镜在20kv加速电压下观察样品的表面形貌。

(3)检测结果

多糖样品(hepc、hepw1及hep1)的重均分子量如表1所示。

表1

多糖样品(hepc、hepw1)的红外光谱分析的检测结果如图2所示，其中扫描波数为4000～400cm^-1。两种样品的红外光谱图具有相似性，但猴头菌粗多糖hepc在吸收波长λ^-1为919.0cm^-1处仍有较为灵敏的响应值，说明了存在d-吡喃葡萄糖的非对称环伸缩振动。

多糖样品(hepc、hepw1)的外观形貌如图3所示，hepc的色泽较暗、褶皱较多，具有一些孔洞结构；hepw1的色泽较为明亮一些，褶皱较少，样品表面光滑，呈块状。sem结果说明hepc样品分子量较高，杂质较多，相比之下，hepw1样品杂质少，分子量较低。

实施例3多糖样品的细胞毒性评估

分别称取实施例1的猴头菌粗多糖hepc、低分子量猴头菌多糖hepw1和对照样品hep1，并分别配制成不同浓度(125、250、500、1000、2000、4000μg/ml)的多糖溶液，采用mtt法(wu,f.,zhou,c.,zhou,d.,ou,s.,zhang,x.,&huang,h..structurecharacterizationofanovelpolysaccharidefromhericiumerinaceusfruitingbodiesanditsimmunomodulatoryactivities.food&function,2018,9:294-306.；lin,z.,liao,w.,&ren,j..structuralcharacterizationofapolysaccharidefractionfromplatycladusorientalis(l.)francoanditsmacrophageimmunomodulatoryandanti-hepatitisbvirusactivities.journalofagriculturalandfoodchemistry,2016,64:5813-5823.)检测hepc、hepw1及hep1对人胃黏膜细胞(ges-1，湖南丰晖生物科技)的毒性作用。结果表明，三种多糖样品(hepc、hepw1及hep1)展示出相似的细胞毒性，即当多糖样品溶液的浓度高于1000μg/ml时，ges-1细胞的细胞活力受到抑制，当多糖样品溶液浓度低于1000μg/ml时，多糖样品对ges-1细胞无毒副作用(图4)。

实施例4预防人胃黏膜细胞氧化损伤的效果

选取对数生长期的人胃黏膜细胞(ges-1，湖南丰晖生物科技)作为研究对象。实验分组：空白组(完全培养基，即含有10％(v/v)fbs的dmem培养基)、对照组(细胞+完全培养基)、h2o2损伤组(细胞+完全培养基+终浓度为600μmol/l的h2o2)、处理组(细胞+完全培养基+猴头菌多糖+终浓度为600μmol/l的h2o2，猴头菌多糖分别为实施例1的hepc、hepw1及对照样品hep1)。处理组以3.0×10⁴个/ml的细胞数接种ges-1细胞于96孔板，每组设6个复孔。细胞贴壁(大约4h)以后，加入含猴头菌多糖的完全培养基，使得猴头菌多糖的终浓度分别为200、300、400、500μg/ml，培养24h，加入含有h2o2的完全培养基(h2o2的终浓度为600μmol/l)，以损伤经过猴头菌多糖预处理的ges-1细胞，持续培养12h、24h、36h。

利用mtt法测定细胞活性：用药后的细胞按10μl/孔的量加入5g/l的mtt溶液，继续培养4h，弃孔内培养液，每孔加入150μldmso，摇床上低速摇动10min，使用酶标仪于570nm波长测定各孔吸光度值，然后采用mtt法进行细胞活性分析，得到h2o2损伤组及处理组的细胞存活率分别为a和b，最后换算为ges-1细胞相对增殖率(％)＝(b-a)/a×100。

结果如图5所示，实施例1的hepc、hepw1及对照样品hep1均能够预防人胃黏膜细胞的氧化损伤，与h2o2损伤组相比较，都能够降低ges-1细胞的损伤率；500μg/ml的hepc、hepw1及hep1对应的ges-1细胞相对增殖率的分别为18.95％、69.07％及45.33％，与hepc、hep1相比，hepw1预防胃损伤的效果显著提高。

实施例5修复人胃黏膜细胞氧化损伤的效果

选取对数生长期的人胃黏膜细胞(ges-1，湖南丰晖生物科技)作为研究对象。实验分组：空白组(完全培养基，即含有10％(v/v)fbs的dmem培养基)、对照组(细胞+完全培养基)、h2o2损伤组(细胞+完全培养基+终浓度为600μmol/l的h2o2)、处理组(细胞+完全培养基+猴头菌多糖+终浓度为600μmol/l的h2o2，猴头菌多糖分别为实施例1的hepc、hepw1及对照hep1)。处理组ges-1细胞孵育12h以后加入含有h2o2的完全培养基(h2o2的终浓度为600μmol/l)损伤6h，之后加入含猴头菌多糖的完全培养基，使得猴头菌多糖的终浓度分别为200、300、400、500μg/ml，培养24h。

采用和实施例4相同的mtt法测定细胞活性，使用酶标仪于570nm波长测定各孔吸光度值，得到损伤组及处理组的细胞存活率分别为a和b，最后换算为ges-1细胞相对增殖率(％)＝(b-a)/a×100。

结果如图6所示，实施例1制得的hepc、hepw1及对照样品hep1均能够修复人胃黏膜细胞的氧化损伤，与h2o2损伤组比较，都能够降低ges-1细胞的损伤率；500μg/ml的hepc、hepw1及hep1对应ges-1细胞的相对增殖率的分别为39.25％、78.7％及47.93％，与hepc、hep1相比，hepw1具有更显著的修复胃损伤功效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。