一套基于KASP的SNP标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学、种质资源学和分子育种
技术领域：
，尤其涉及一套基于kasp的snp标记及其应用。
背景技术：
：雪茄烟因其独有的风格特色、深厚的文化内涵和更高的吸食安全性，吸引着越来越多的消费者，近年来国内外市场需求日益增长，产业前景广阔。但是，我国雪茄烟研究工作起步晚，基础研究落后，各研究单位引进、收集、交换的雪茄烟资源、品种众多，存在同种异名或者同名异种的现象，非常不利于雪茄烟资源的管理和利用。且雪茄烟具体遗传背景尚不清楚，不能够有效快速的进行雪茄烟常规育种和分子育种工作。因此，对这些资源构建指纹图谱，剔除重复收集、引进的资源，为每份资源赋予独有的身份信息，对雪茄烟资源收集鉴定和品种分子审定意义重大。目前，烟草种质资源依然采用第二代分子标记来进行指纹图谱构建工作。随着分子标记技术和第二代测序技术的快速发展，snp标记和基因组学理论、方法不断深入到种质资源多样性检测和指纹图谱构建工作中。由于snp标记具有覆盖全基因组、通量高、位点特异、共显性遗传、错误率低、开发和检测成本低等诸多优势，未来将成为高通量种质资源检测的重要标记类型。近年来，snp标记已经广泛应用于小麦、水稻、玉米等大宗作物的指纹图谱构建和遗传进化分析上，目前尚未见到基于kasp技术的snp分子标记来进行雪茄烟资源鉴定和品种审定的报导。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一套基于kasp的snp标记及其应用，采用本发明提供的snp标记，完成雪茄烟snp指纹图谱构建工作，能系统鉴定现有雪茄烟资源，并剔除重复收集的资源，建立雪茄烟品种知识产权保护机制。利用本发明提供的snp标记筛选鉴定新收集的雪茄烟资源，审定新培育的雪茄烟品种，并利用到雪茄烟育种工作中。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一套基于kasp的snp标记，所述snp标记包括cigarsnp01-1、cigarsnp01-2、cigarsnp02-1、cigarsnp02-2、cigarsnp03-1、cigarsnp03-2、cigarsnp04-1、cigarsnp04-2、cigarsnp05-1、cigarsnp06-1、cigarsnp06-2、cigarsnp07-1、cigarsnp07-2、cigarsnp08-1、cigarsnp09-1、cigarsnp09-2、cigarsnp10-1、cigarsnp10-2、cigarsnp11-1、cigarsnp11-2、cigarsnp11-3、cigarsnp12-1、cigarsnp12-2、cigarsnp12-3、cigarsnp13-1、cigarsnp13-2、cigarsnp14-1、cigarsnp15-1、cigarsnp15-2、cigarsnp16-1、cigarsnp16-2、cigarsnp17-1、cigarsnp17-2、cigarsnp18-1、cigarsnp18-2、cigarsnp19-1、cigarsnp19-2、cigarsnp20-1、cigarsnp20-2、cigarsnp20-3、cigarsnp21-1、cigarsnp22-1、cigarsnp22-2、cigarsnp23-1、cigarsnp23-2、cigarsnp23-3、cigarsnp24-1和cigarsnp24-2。优选的，所述cigarsnp01-1位于雪茄的染色体nt01上，物理位置为20189161；所述cigarsnp01-2位于雪茄的染色体nt01上，物理位置为127733497；所述cigarsnp02-1位于雪茄的染色体nt02上，物理位置为108245254；所述cigarsnp02-2位于雪茄的染色体nt02上，物理位置为87338587；所述cigarsnp03-1位于雪茄的染色体nt03上，物理位置为5854407；所述cigarsnp03-2位于雪茄的染色体nt03上，物理位置为20901328；所述cigarsnp04-1位于雪茄的染色体nt04上，物理位置为101426258；所述cigarsnp04-2位于雪茄的染色体nt04上，物理位置为44511003；所述cigarsnp05-1位于雪茄的染色体nt05上，物理位置为24187234；所述cigarsnp06-1位于雪茄的染色体nt06上，物理位置为20171212；所述cigarsnp06-2位于雪茄的染色体nt06上，物理位置为99243063；所述cigarsnp07-1位于雪茄的染色体nt07上，物理位置为59134911；所述cigarsnp07-2位于雪茄的染色体nt07上，物理位置为91456765；所述cigarsnp08-1位于雪茄的染色体nt08上，物理位置为68017703；所述cigarsnp09-1位于雪茄的染色体nt09上，物理位置为100690577；所述cigarsnp09-2位于雪茄的染色体nt09上，物理位置为96986746；所述cigarsnp10-1位于雪茄的染色体nt10上，物理位置为51896682；所述cigarsnp10-2位于雪茄的染色体nt10上，物理位置为115185980；所述cigarsnp11-1位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为66259728；所述cigarsnp11-2位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为23822295；所述cigarsnp11-3位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为57168417；所述cigarsnp12-1位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为125890111；所述cigarsnp12-2位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为31687315；所述cigarsnp12-3位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为25943135；所述cigarsnp13-1位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp13-2位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp13-2位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp14-1位于雪茄的染色体nt14上，物理位置为23358247；所述cigarsnp15-1位于雪茄的染色体nt15上，物理位置为86671490；所述cigarsnp15-2位于雪茄的染色体nt15上，物理位置为78242076；所述cigarsnp16-1位于雪茄的染色体nt16上，物理位置为65433447；所述cigarsnp16-2位于雪茄的染色体nt16上，物理位置为9110774；所述cigarsnp17-1位于雪茄的染色体nt17上，物理位置为72622941；所述cigarsnp17-2位于雪茄的染色体nt17上，物理位置为195888994；所述cigarsnp18-1位于雪茄的染色体nt18上，物理位置为10034161；所述cigarsnp18-2位于雪茄的染色体nt18上，物理位置为61973096；所述cigarsnp19-1位于雪茄的染色体nt19上，物理位置为137571210；所述cigarsnp19-2位于雪茄的染色体nt19上，物理位置为22172908；所述cigarsnp20-1位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为47926589；所述cigarsnp20-2位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为72837945；所述cigarsnp20-3位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为31675895；所述cigarsnp21-1位于雪茄的染色体nt21上，物理位置为27200249；所述cigarsnp22-1位于雪茄的染色体nt22上，物理位置为166；所述cigarsnp22-2位于雪茄的染色体nt22上，物理位置为83063701；所述cigarsnp23-1位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为42324361；所述cigarsnp23-2位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为41108155；所述cigarsnp23-3位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为63738673；所述cigarsnp24-1位于雪茄的染色体nt24上，物理位置为20135887；所述cigarsnp24-2位于雪茄的染色体nt24上，物理位置为11946597。优选的，扩增所述snp标记的kasp引物的核苷酸序列如seqidno.1～144；seqidno.1～3扩增cigarsnp01-1；seqidno.4～6扩增cigarsnp01-2；seqidno.7～9扩增cigarsnp02-1；seqidno.10～12扩增cigarsnp02-2；seqidno.13～15扩增cigarsnp03-1；seqidno.16～18扩增cigarsnp03-2；seqidno.19～21扩增cigarsnp04-1；seqidno.22～24扩增cigarsnp04-2；seqidno.25～27扩增cigarsnp05-1；seqidno.28～30扩增cigarsnp06-1；seqidno.31～33扩增cigarsnp06-2；seqidno.34～36扩增cigarsnp07-1；seqidno.37～39扩增cigarsnp07-2；seqidno.40～42扩增cigarsnp08-1；seqidno.43～45扩增cigarsnp09-1；seqidno.46～48扩增cigarsnp09-2；seqidno.49～51扩增cigarsnp10-1；seqidno.52～54扩增cigarsnp10-2；seqidno.55～57扩增cigarsnp11-1；seqidno.58～60扩增cigarsnp11-2；seqidno.61～63扩增cigarsnp11-3；seqidno.64～66扩增cigarsnp12-1；seqidno.67～69扩增cigarsnp12-2；seqidno.70～72扩增cigarsnp12-3；seqidno.73～75扩增cigarsnp13-1；seqidno.76～78扩增cigarsnp13-2；seqidno.79～81扩增cigarsnp14-1；seqidno.82～84扩增cigarsnp15-1；seqidno.85～87扩增cigarsnp15-2；seqidno.88～90扩增cigarsnp16-1；seqidno.91～93扩增cigarsnp16-2；seqidno.94～96扩增cigarsnp17-1；seqidno.97～99扩增cigarsnp17-2；seqidno.100～102扩增cigarsnp18-1；seqidno.103～105扩增cigarsnp18-2；seqidno.106～108扩增cigarsnp19-1；seqidno.109～111扩增cigarsnp19-2；seqidno.112～114扩增cigarsnp20-1；seqidno.115～117扩增cigarsnp20-2；seqidno.118～120扩增cigarsnp20-3；seqidno.121～123扩增cigarsnp21-1；seqidno.124～126扩增cigarsnp22-1；seqidno.127～129扩增cigarsnp22-2；seqidno.130～132扩增cigarsnp23-1；seqidno.133～135扩增cigarsnp23-2；seqidno.136～138扩增cigarsnp23-3；seqidno.139～141扩增cigarsnp24-1；seqidno.142～144扩增cigarsnp24-2。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在构建雪茄烟snp指纹图谱中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在检测雪茄烟资源中的应用。优选的，包括：提取待测雪茄烟的基因组dna，利用上述技术方案所述的snp标记对基因组dna进行检测，得到待测雪茄烟的基因型数据；将所述待测雪茄烟的基因型数据与已有的雪茄烟基因型数据比对，当存在3个以上差异位点时，待测雪茄烟为新资源。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在雪茄烟遗传多样性分析中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在雪茄烟类群划分中的应用。本发明提供了一套基于kasp的snp标记及其应用，采用本发明提供的snp标记，完成雪茄烟snp指纹图谱构建工作，能系统鉴定现有雪茄烟资源，并剔除重复收集的资源，建立雪茄烟品种知识产权保护机制。利用本发明提供的snp标记筛选鉴定新收集的雪茄烟资源，审定新培育的雪茄烟品种，并利用到雪茄烟育种工作中。本发明具有以下优点和有益效果：本发明从113份雪茄烟资源简化测序产生的58万个snp中筛选设计出48个雪茄烟核心snp标记。利用该套标记组合可以应用于构建雪茄烟snp指纹图谱，检测雪茄烟品种的真实性，保证雪茄烟资源收集的可靠性，可以进行雪茄烟资源亲缘关系分析，并指导雪茄烟育种工作。所选择的48个snp标记具有很高的遗传多样性，且稳定好，均匀分布在雪茄烟24条染色体上，具有较好的可重复性，有很好的可利用性和推广价值。将snp标记转换成kasp标记，可以提高检测的准确定和分辨率，且检测成本与ssr标记相当，检测过程更加快速、高通量，且检测过程中没有有毒化学试剂的使用。通过本发明可以实现雪茄烟资源鉴定的高通量、低成本和自动化的检测。附图说明图1为kasp标记snpviewer2读取；图2为111份雪茄烟资源聚类图；图3为111份雪茄烟资源群组图。具体实施方式本发明提供了一套基于kasp的snp标记，所述snp标记包括cigarsnp01-1、cigarsnp01-2、cigarsnp02-1、cigarsnp02-2、cigarsnp03-1、cigarsnp03-2、cigarsnp04-1、cigarsnp04-2、cigarsnp05-1、cigarsnp06-1、cigarsnp06-2、cigarsnp07-1、cigarsnp07-2、cigarsnp08-1、cigarsnp09-1、cigarsnp09-2、cigarsnp10-1、cigarsnp10-2、cigarsnp11-1、cigarsnp11-2、cigarsnp11-3、cigarsnp12-1、cigarsnp12-2、cigarsnp12-3、cigarsnp13-1、cigarsnp13-2、cigarsnp14-1、cigarsnp15-1、cigarsnp15-2、cigarsnp16-1、cigarsnp16-2、cigarsnp17-1、cigarsnp17-2、cigarsnp18-1、cigarsnp18-2、cigarsnp19-1、cigarsnp19-2、cigarsnp20-1、cigarsnp20-2、cigarsnp20-3、cigarsnp21-1、cigarsnp22-1、cigarsnp22-2、cigarsnp23-1、cigarsnp23-2、cigarsnp23-3、cigarsnp24-1和cigarsnp24-2。在本发明中，所述cigarsnp01-1位于雪茄的染色体nt01上，物理位置为20189161；所述cigarsnp01-2位于雪茄的染色体nt01上，物理位置为127733497；所述cigarsnp02-1位于雪茄的染色体nt02上，物理位置为108245254；所述cigarsnp02-2位于雪茄的染色体nt02上，物理位置为87338587；所述cigarsnp03-1位于雪茄的染色体nt03上，物理位置为5854407；所述cigarsnp03-2位于雪茄的染色体nt03上，物理位置为20901328；所述cigarsnp04-1位于雪茄的染色体nt04上，物理位置为101426258；所述cigarsnp04-2位于雪茄的染色体nt04上，物理位置为44511003；所述cigarsnp05-1位于雪茄的染色体nt05上，物理位置为24187234；所述cigarsnp06-1位于雪茄的染色体nt06上，物理位置为20171212；所述cigarsnp06-2位于雪茄的染色体nt06上，物理位置为99243063；所述cigarsnp07-1位于雪茄的染色体nt07上，物理位置为59134911；所述cigarsnp07-2位于雪茄的染色体nt07上，物理位置为91456765；所述cigarsnp08-1位于雪茄的染色体nt08上，物理位置为68017703；所述cigarsnp09-1位于雪茄的染色体nt09上，物理位置为100690577；所述cigarsnp09-2位于雪茄的染色体nt09上，物理位置为96986746；所述cigarsnp10-1位于雪茄的染色体nt10上，物理位置为51896682；所述cigarsnp10-2位于雪茄的染色体nt10上，物理位置为115185980；所述cigarsnp11-1位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为66259728；所述cigarsnp11-2位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为23822295；所述cigarsnp11-3位于雪茄的染色体nt11上，物理位置为57168417；所述cigarsnp12-1位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为125890111；所述cigarsnp12-2位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为31687315；所述cigarsnp12-3位于雪茄的染色体nt12上，物理位置为25943135；所述cigarsnp13-1位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp13-2位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp13-2位于雪茄的染色体nt13上，物理位置为86466436；所述cigarsnp14-1位于雪茄的染色体nt14上，物理位置为23358247；所述cigarsnp15-1位于雪茄的染色体nt15上，物理位置为86671490；所述cigarsnp15-2位于雪茄的染色体nt15上，物理位置为78242076；所述cigarsnp16-1位于雪茄的染色体nt16上，物理位置为65433447；所述cigarsnp16-2位于雪茄的染色体nt16上，物理位置为9110774；所述cigarsnp17-1位于雪茄的染色体nt17上，物理位置为72622941；所述cigarsnp17-2位于雪茄的染色体nt17上，物理位置为195888994；所述cigarsnp18-1位于雪茄的染色体nt18上，物理位置为10034161；所述cigarsnp18-2位于雪茄的染色体nt18上，物理位置为61973096；所述cigarsnp19-1位于雪茄的染色体nt19上，物理位置为137571210；所述cigarsnp19-2位于雪茄的染色体nt19上，物理位置为22172908；所述cigarsnp20-1位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为47926589；所述cigarsnp20-2位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为72837945；所述cigarsnp20-3位于雪茄的染色体nt20上，物理位置为31675895；所述cigarsnp21-1位于雪茄的染色体nt21上，物理位置为27200249；所述cigarsnp22-1位于雪茄的染色体nt22上，物理位置为166；所述cigarsnp22-2位于雪茄的染色体nt22上，物理位置为83063701；所述cigarsnp23-1位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为42324361；所述cigarsnp23-2位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为41108155；所述cigarsnp23-3位于雪茄的染色体nt23上，物理位置为63738673；所述cigarsnp24-1位于雪茄的染色体nt24上，物理位置为20135887；所述cigarsnp24-2位于雪茄的染色体nt24上，物理位置为11946597。在本发明中，所述snp标记的物理位置优选是基于烟草k326基因组17年染色体版(ftp://ftp.sgn.cornell.edu/genomes/nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/)+未挂载到染色体的congtig序列为参考基因组确定的。在本发明中，扩增所述snp标记的kasp引物的核苷酸序列如seqidno.1～144。在本发明中，seqidno.1～3扩增cigarsnp01-1，具体如下：seqidno.1：gaaggtgaccaagttcatgcttcgaaaagatcaaacatcaaagggaaatat；seqidno.2：gaaggtcggagtcaacggattcgaaaagatcaaacatcaaagggaaatag；seqidno.3：cgaggctggtggttgtgattgatattt。在本发明中，seqidno.4～6扩增cigarsnp01-2，具体如下：seqidno.4：gaaggtgaccaagttcatgctactaagtagagccaatatgtgagatga；seqidno.5：gaaggtcggagtcaacggattctaagtagagccaatatgtgagatgg；seqidno.6：tgtctccatgggtgatggtaacaaaatt。在本发明中，seqidno.7～9扩增cigarsnp02-1，具体如下：seqidno.7：gaaggtgaccaagttcatgctgttctagattcaagctacctctcg；seqidno.8：gaaggtcggagtcaacggattcgttctagattcaagctacctctca；seqidno.9：tgaggtcttacaaatcttagactaccaaaaa。在本发明中，seqidno.10～12扩增cigarsnp02-2，具体序列如下：seqidno.10：gaaggtgaccaagttcatgcttgtattagcagcttatgcgtctctc；seqidno.11：gaaggtcggagtcaacggattgtgtattagcagcttatgcgtctctt；seqidno.12：taactgctagtaatagatggacaggttataa。在本发明中，seqidno.13～15扩增cigarsnp03-1，具体如下：seqidno.13：gaaggtgaccaagttcatgctatcatcacacaatgcaggaaaatcaattat；seqidno.14：gaaggtcggagtcaacggattcatcacacaatgcaggaaaatcaattac；seqidno.15：ttaggaaaagtgaaagatcatagctttatctata。在本发明中，seqidno.16～18扩增cigarsnp03-2，具体如下：seqidno.16：gaaggtgaccaagttcatgctttcaagtttcaagctttaaattgggaacta；seqidno.17：gaaggtcggagtcaacggattcaagtttcaagctttaaattgggaactg；seqidno.18：tttcaggataatcggaataaacttggaagaa。在本发明中，seqidno.19～21扩增cigarsnp04-1，具体如下：seqidno.19：gaaggtgaccaagttcatgctgtagtctgcgggcatatgttcg；seqidno.20：gaaggtcggagtcaacggattaatgtagtctgcgggcatatgttca；seqidno.21：ccagggtcctgatagatggacgtt。在本发明中，seqidno.22～24扩增cigarsnp04-2，具体如下：seqidno.22：gaaggtgaccaagttcatgctatttcctttctaggaattctttgaacaatc；seqidno.23：gaaggtcggagtcaacggattatttcctttctaggaattctttgaacaatg；seqidno.24：cacggcagaagaactggagcagtt。在本发明中，seqidno.25～27扩增cigarsnp05-1，具体如下：seqidno.25：gaaggtgaccaagttcatgcttgtgatgagaagagtttgtttataatgtgt；seqidno.26：gaaggtcggagtcaacggatttgtgatgagaagagtttgtttataatgtga；seqidno.27：aagatagaaatcaagaacccaatagtctgtt。在本发明中，seqidno.28～30扩增cigarsnp06-1，具体如下：seqidno.28：gaaggtgaccaagttcatgctccaaactcaaagttcaatcactgc；seqidno.29：gaaggtcggagtcaacggattgccaaactcaaagttcaatcactgt；seqidno.30：tctattggttcagaggtttgtgtgaagaa。在本发明中，seqidno.31～33扩增cigarsnp06-2，具体如下：seqidno.31：gaaggtgaccaagttcatgcttatgcagtattttgatcatttgccctataa；seqidno.32：gaaggtcggagtcaacggatttgcagtattttgatcatttgccctatag；seqidno.33：gaacaggggtgcattgataggagtt。在本发明中，seqidno.34～36扩增cigarsnp07-1，具体如下：seqidno.34：gaaggtgaccaagttcatgctccccaaaagcacaacattcgaaatac；seqidno.35：gaaggtcggagtcaacggatttccccaaaagcacaacattcgaaataa；seqidno.36：cagatttagattcgcaggaagtctcttaa。在本发明中，seqidno.37～39扩增cigarsnp07-2，具体如下：seqidno.37：gaaggtgaccaagttcatgctctcaggtcaacacataacaactcaat；seqidno.38：gaaggtcggagtcaacggattctcaggtcaacacataacaactcaac；seqidno.39：tggtctcgtgatacaaggccactta。在本发明中，seqidno.40～42扩增cigarsnp08-1，具体如下：seqidno.40：gaaggtgaccaagttcatgcttcatggaaatttgggacataactattcg；seqidno.41：gaaggtcggagtcaacggattattcatggaaatttgggacataactattca；seqidno.42：acagacctcctcatttggggatcat。在本发明中，seqidno.43～45扩增cigarsnp09-1，具体如下：seqidno.43：gaaggtgaccaagttcatgctagttggaaaacattgctccattcgc；seqidno.44：gaaggtcggagtcaacggattaaagttggaaaacattgctccattcgt；seqidno.45：atttcggatcagagaccgggttgat。在本发明中，seqidno.46～48扩增cigarsnp09-2，具体如下；seqidno.46：gaaggtgaccaagttcatgctctaaaggacaacaatttgatacatttgact；seqidno.47：gaaggtcggagtcaacggattctaaaggacaacaatttgatacatttgaca；seqidno.48：tccacgtaatccatcattttgttgatatgaa。在本发明中，seqidno.49～51扩增cigarsnp10-1，具体序列如下：seqidno.49：gaaggtgaccaagttcatgcttctgcaggtaaccagtaagaaacca；seqidno.50：gaaggtcggagtcaacggatttgcaggtaaccagtaagaaaccg；seqidno.51：agcgaaattgctcctgctaggacaa。在本发明中，seqidno.52～54扩增cigarsnp10-2，具体如下：seqidno.52：gaaggtgaccaagttcatgcttatataaatctcagtttctagcgaacacat；seqidno.53：gaaggtcggagtcaacggatttataaatctcagtttctagcgaacacac；seqidno.54：tttatacgtagaaattgggaatcttcaggat。在本发明中，seqidno.55～57扩增cigarsnp11-1，具体如下：seqidno.55：gaaggtgaccaagttcatgctgcttgtcattatatatgggagactaga；seqidno.56：gaaggtcggagtcaacggattcttgtcattatatatgggagactagc；seqidno.57：gtaagatggacaacccagtacccaa。在本发明中，seqidno.58～60扩增cigarsnp11-2，具体如下：seqidno.58：gaaggtgaccaagttcatgctggcatatcatcataagactaggcaaat；seqidno.59：gaaggtcggagtcaacggattgcatatcatcataagactaggcaaac；seqidno.60：gagaggcattgatccaacttttgtttgaat。在本发明中，seqidno.61～63扩增cigarsnp11-3，具体如下：seqidno.61：gaaggtgaccaagttcatgcttgagtaaggtaccgggtgactg；seqidno.62：gaaggtcggagtcaacggattattgagtaaggtaccgggtgacta；seqidno.63：gataccacttttgtcacaacccaaattgat。在本发明中，seqidno.64～66扩增cigarsnp12-1，具体如下：seqidno.64：gaaggtgaccaagttcatgctattgattattttggtcctccagttcca；seqidno.65：gaaggtcggagtcaacggatttgattattttggtcctccagttccg；seqidno.66：acgggtggttactacgaggtgaatt。在本发明中，seqidno.67～69扩增cigarsnp12-2，具体如下：seqidno.67：gaaggtgaccaagttcatgcttaacgccacctgggcgggt；seqidno.68：gaaggtcggagtcaacggattacgccacctgggcgggc；seqidno.69：ttgtgttgtaatttgaattttaacctacgagata。在本发明中，seqidno.70～72扩增cigarsnp12-3，具体如下：seqidno.70：gaaggtgaccaagttcatgctacttttgggtaaacagactcagaatca；seqidno.71：gaaggtcggagtcaacggattcttttgggtaaacagactcagaatcg；seqidno.72：aactatacgaacctatcggaacaatcaaaat。在本发明中，seqidno.73～75扩增cigarsnp13-1，具体如下：seqidno.73：gaaggtgaccaagttcatgcttctggccgaaatcatatgtagcact；seqidno.74：gaaggtcggagtcaacggatttggccgaaatcatatgtagcacc；seqidno.75：gtgactatgcaagttgacgagtgtatat。在本发明中，seqidno.76～78扩增cigarsnp13-2，具体如下：seqidno.76：gaaggtgaccaagttcatgctactctcttaaatatccccaaaagcact；seqidno.77：gaaggtcggagtcaacggattctctcttaaatatccccaaaagcacc；seqidno.78：gaagtctcctcagggtaagtattttgaatt。在本发明中，seqidno.79～81扩增cigarsnp14-1，具体如下：seqidno.79：gaaggtgaccaagttcatgctcgggcattgtttcatcttggtatct；seqidno.80：gaaggtcggagtcaacggattgggcattgtttcatcttggtatcc；seqidno.81：gcctcgacccatttggtgaaatagtt。在本发明中，seqidno.82～84扩增cigarsnp15-1，具体如下：seqidno.82：gaaggtgaccaagttcatgctgatttatatacttgttaggatgtttggacta；seqidno.83：gaaggtcggagtcaacggattatttatatacttgttaggatgtttggactg；seqidno.84：gcagtggaattcatctaaaacaatccgaaa。在本发明中，seqidno.85～87扩增cigarsnp15-2，具体如下：seqidno.85：gaaggtgaccaagttcatgcttgaagaacagaatggagcaagagga；seqidno.86：gaaggtcggagtcaacggattaagaacagaatggagcaagaggg；seqidno.87：cgcggatcaggacttgcgggta。在本发明中，seqidno.88～90扩增cigarsnp16-1，具体如下：seqidno.88：gaaggtgaccaagttcatgctatccgatgatccaatctgcatcac；seqidno.89：gaaggtcggagtcaacggattgatccgatgatccaatctgcatcat；seqidno.90：cattataaccaatatccttccgtgatcgaa。在本发明中，seqidno.91～93扩增cigarsnp16-2，具体如下：seqidno.91：gaaggtgaccaagttcatgctgaaggatatggcagagcttcgc；seqidno.92：gaaggtcggagtcaacggattaagaaggatatggcagagcttcgt；seqidno.93：tcttcgcgttcgcgtaacactcttt。在本发明中，seqidno.94～96扩增cigarsnp17-1，具体如下：seqidno.94：gaaggtgaccaagttcatgctcatatactatgacctatcaaaagctcaataat；seqidno.95：gaaggtcggagtcaacggatttatactatgacctatcaaaagctcaataac；seqidno.96：gctaccggaggcaataagaacaatataaaa。在本发明中，seqidno.97～99扩增cigarsnp17-2，具体如下：seqidno.97：gaaggtgaccaagttcatgctactctagatctctatagctgaggac；seqidno.98：gaaggtcggagtcaacggattaaactctagatctctatagctgaggat；seqidno.99：gattaaagcagtgcagagttagaccata。在本发明中，seqidno.100～102扩增cigarsnp18-1，具体如下：seqidno.100：gaaggtgaccaagttcatgcttaaacatcgttccacgttgtagcca；seqidno.101：gaaggtcggagtcaacggattacatcgttccacgttgtagccg；seqidno.102：aaggagactaaaggaaagcctttgataattt；在本发明中，seqidno.103～105扩增cigarsnp18-2，具体如下：seqidno.103：gaaggtgaccaagttcatgctgcggtggaacggcggatac；seqidno.104：gaaggtcggagtcaacggattggcggtggaacggcggatat；seqidno.105：ctaaattaccttccaaacaataccttcaaattaat。在本发明中，seqidno.106～108扩增cigarsnp19-1，具体如下：seqidno.106：gaaggtgaccaagttcatgctttttctttcgcttcctcgttttcactt；seqidno.107：gaaggtcggagtcaacggattttctttcgcttcctcgttttcactc；seqidno.108：taaaatgtgcaccattaagcagacaatgttt。在本发明中，seqidno.109～111扩增cigarsnp19-2，具体如下：seqidno.109：gaaggtgaccaagttcatgctacacacgtcacaaatgacaccaca；seqidno.110：gaaggtcggagtcaacggattcacacgtcacaaatgacaccacg；seqidno.111：caaagaaaagcctctgtaaactcctgatat。在本发明中，seqidno.112～114扩增cigarsnp20-1，具体如下：seqidno.112：gaaggtgaccaagttcatgctacctccccaactcaactgagtc；seqidno.113：gaaggtcggagtcaacggattcacctccccaactcaactgagta；seqidno.114：gtagcactctttgattgggcggtttat。在本发明中，seqidno.115～117扩增cigarsnp20-2，具体如下：seqidno.115：gaaggtgaccaagttcatgctccaagttcaggtccccttgcaa；seqidno.116：gaaggtcggagtcaacggattcaagttcaggtccccttgcac；seqidno.117：tgcacgcttcatattcggccatattatt。在本发明中，seqidno.118～120扩增cigarsnp20-3，具体如下：seqidno.118：gaaggtgaccaagttcatgctatcatcagtatcccttacattgtcaca；seqidno.119：gaaggtcggagtcaacggattcatcagtatcccttacattgtcacg；seqidno.120：aatctatcgttgcattgttcgatatggatat。在本发明中，seqidno.121～123扩增cigarsnp21-1，具体如下：seqidno.121：gaaggtgaccaagttcatgctcacagatattcttctcaaggaatttgaa；seqidno.122：gaaggtcggagtcaacggattcacagatattcttctcaaggaatttgac；seqidno.123：ctcatgacttgtagaacctatgaaccta。在本发明中，seqidno.124～126扩增cigarsnp22-1，具体如下：seqidno.124：gaaggtgaccaagttcatgctagaccttacccctacctttatgga；seqidno.125：gaaggtcggagtcaacggattagaccttacccctacctttatggt；seqidno.126：cttgagccgagggtctatcggaaa。在本发明中，seqidno.127～129扩增cigarsnp22-2，具体如下：seqidno.127：gaaggtgaccaagttcatgctacttgtcgaacccgccagtcta；seqidno.128：gaaggtcggagtcaacggattacttgtcgaacccgccagtctt；seqidno.129：agatacaagaagaaagacattccgggtt。在本发明中，seqidno.130～132扩增cigarsnp23-1，具体如下：seqidno.130：gaaggtgaccaagttcatgctacagctatagaatcccccaccg；seqidno.131：gaaggtcggagtcaacggatttacagctatagaatcccccacca；seqidno.132：gaatccttgagtgcttctgtgcactt。在本发明中，seqidno.133～135扩增cigarsnp23-2，具体如下：seqidno.133：gaaggtgaccaagttcatgctaagactaaaattccaggatagttggct；seqidno.134：gaaggtcggagtcaacggattgactaaaattccaggatagttggcc；seqidno.135：tgcaccatacggacaaccctcttta。在本发明中，seqidno.136～138扩增cigarsnp23-3，具体如下：seqidno.136：gaaggtgaccaagttcatgctaaagcggaaataacaagttcgcatcta；seqidno.137：gaaggtcggagtcaacggattagcggaaataacaagttcgcatctg；seqidno.138：ggggtactcccatttgtgaggtaaaa。在本发明中，seqidno.139～141扩增cigarsnp24-1，具体如下：seqidno.139：gaaggtgaccaagttcatgctaactgtgattattcccatttctgtttgtta；seqidno.140：gaaggtcggagtcaacggattctgtgattattcccatttctgtttgttg；seqidno.141：tctgtctcccgatgaagtaagccaa。在本发明中，seqidno.142～144扩增cigarsnp24-2，具体如下：seqidno.142：gaaggtgaccaagttcatgctcatgtgatttgtggcggtacaagt；seqidno.143：gaaggtcggagtcaacggattatgtgatttgtggcggtacaagc；seqidno.144：tactcgaatgcctccgaataaaatcaattat。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在构建雪茄烟snp指纹图谱、数据库中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：提取待测雪茄烟的基因组dna，以所述基因组dna为模版经上述技术方案所述的kasp引物进行扩增，得到基因型数据，根据所述基因型数据构建雪茄烟snp指纹图谱、数据库。在本发明中，所述扩增的程序包括：94℃预变性14分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61-55℃延伸60秒，10个循环；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃延伸60秒，26个循环。在本发明中，所述扩增的体系包括：1.5μldna模板，2.5μl2×kaspmastermix，0.07μlkaspprimermix，水0.93μl，总反应体系是5μl。本发明还能提供了上述技术方案所述的snp标记在检测雪茄烟资源、品种中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：提取待测雪茄烟的基因组dna，利用上述技术方案所述的snp标记对基因组dna进行检测，得到待测雪茄烟的基因型数据；将所述待测雪茄烟的基因型数据与已有的雪茄烟基因型数据比对，当存在3个以上差异位点时，待测雪茄烟为新资源。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在雪茄烟遗传多样性分析中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的snp标记在雪茄烟类群划分中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：(1)提取待测雪茄烟样品的基因组dna；(2)利用上述技术方案所述的snp标记对待测雪茄烟样品进行检测，获得待测雪茄烟样品基因型数据；(3)根据(2)获得的待测雪茄烟样品基因型数据，通过用popgene32软件计算观察等位基因数no，有效等位基因ne，nei’s基因多样性指数h，shannon’s多态信息指数i。并用pic_calcversion0.6软件计算多态信息量(pic)：其中为n该位点的等位基因数，pi为第i个等位基因在群体中的频率，pj为第j个等位基因在群体中的频率。材料间遗传相似系数(gs，geneticsimilaritycoefficient)和遗传距离(geneticdistance)按照公式：gs＝m/(m+n)，gd＝1-gs来计算，其中，m为基因型间共有带数目，n为差异带数目。利用mega7.0.26软件以非加权配对法(upgma，unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean)进行聚类分析并绘制出聚类图，从而获得待测样品的遗传背景及所在类群。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1雪茄烟核心snp标记的筛选前期对113份雪茄烟资源进行简化基因组测序，gbs(genotyping-by-sequencing)技术指通过测序进行基因分型，通过选取合适的限制性内切酶结合高通量群体测序构建snp分子标记，而gbs文库的构建，首先使用限制性内切酶对基因组dna进行酶切，然后加上带barcode的测序接头，对样本进行混合，构建小片段文库(250-550bp)，进行pe125双末端测序。1、基因组电子酶切评估为了检查酶切的效率和对所有标记进行分析，将基因组按照限制性内切酶的位点对参考基因组进行酶切，统计相应的情况，便于后期的评估。effective代表符合筛选片段条件的分子标记。表1基因组电子酶切评估2、variant分析variant变异指在基因组水平上由单个核苷酸或者几个核苷酸的插入或缺失所引起的的变异形成dna序列多态性。使用软件gatk(3.4-46)的unifiedgenotyper模块将处理好的比对文件进行多个样本的variant检测，检测到的变异使用variantfiltration进行过滤，过滤参数为-window4，-filter"qd<4.0||fs>60.0||mq<40.0"，-g_filter"gq<20"。使用annovar对检测出的variant进行功能注释。3、雪茄烟核心snp标记初筛选(1)基于全基因组简化测序获得的580942个snp，筛选缺失比例小于5％的位点，共计540781个snp位点；(2)为避免snp附近区域存在拷贝数变异和重复序列，在剩下的snp位点中筛选杂合比例小于10％的snp位点，共计526773个snp位点；(3)雪茄烟核心snp标记要保证标记的多态性，在剩下的snp位点中筛选最小等位基因频率maf>0.45的位点，共获得7061个snp位点。4、雪茄烟核心snp标记获得(1)分型比例80％以上；(2)次要等位基因频率maf0.1以上；(3)位点符合哈迪温伯格平衡；(4)多态信息含量pic0.35以上；(5)衰减距离ld0.2以上；(6)位点前后100bp不存在其他的变异，(7)将位点上下游100bp的序列比对到染色体水平的参考，判断其所在染色体以及位置信息。通过筛选最终筛选到715个可靠的snp位点，在此基础上，考虑染色体均匀分布，位点所在附近序列信息不为nnn等继续进行筛选。选定200个snp位点进行kasp标记开发，用候选验证群体进行kasp标记验证工作，最终选定48个kasp标记作为后续进行雪茄烟snp指纹图谱工作的snp标记，最终获得如表3所示的48个雪茄烟核心snp标记。表248个雪茄烟核心snp标记实施例2利用48个雪茄烟核心snp标记鉴定111份雪茄烟资源的方法111份雪茄烟种质资源是国家烟草种质资源中期库近年来收集保存的雪茄烟种质资源，只进行过表型鉴定，有表型表现较一致的无法鉴别是否为同一份雪茄烟资源，还有存在资源名称相似甚至一致的现象。应用本发明的48个雪茄烟核心snp标记及kasp引物，对以上资源进行亲缘关系鉴定，具体实验步骤如下：(1)dna模板的准备：111份雪茄烟在5片真叶期取样，采用ctab法提取基因组dna。(2)kasp引物的设计、合成：筛选的snp位点在设计kasp引物时需要上引物-primer_allelex的5’端添加fam荧光标签序列5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’，下引物-primer_alleley的5’端添加hex荧光标签序列5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’。引物合成交由六合华大(北京)基因科技有限公司合成。表3kasp引物序列(3)反应体系：表4反应体系组分384tapedna模板1.5μl2×kaspmastermix2.5μlkaspassaymix0.07μl水0.93μl总体积5μl(4)lgc反应条件：94℃预变性14分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，61-55℃延伸60秒，10个循环；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃延伸60秒，26个循环。(5)结果分析：利用karaken软件进行数据前处理和分析工作，通常以excel文件的形式导出基因型分型数据，将基因型与参考基因组相同的条带的标记为“1”，不相同的记为“0”，缺失记为“9”，构建数列矩阵，利用mega7.0.26软件以非加权配对法进行聚类分析并绘制出聚类图(图2)。从聚类图来看，基本符合地域和资源名称特征，有种质名称相似或者相同的资源亲缘关系非常近(b112-印尼1号，b231-印尼1号.柬埔寨)，侧面证明本次分析结果可靠。实施例3利用雪茄烟核心snp标记进行雪茄烟资源群体结构分析的方法本发明在筛选雪茄烟核心snp标记的时候，考虑到标记的多态性和特异性，入选部分来自不同类群特异snp位点信息，因此可以进行雪茄烟资源群体结构分析。将实施例1开发的48对kasp标记对111份来自世界各国的雪茄烟资源进行群体结构分析。111份雪茄烟资源dna提取、上机反应和下级基因型获得及结果分析，具体方法同实施例2。群体遗传结构指遗传变异在物种或群体中的一种非随机分布。处于同一亚群内的不同个体亲缘关系较高，而亚群与亚群之间则亲缘关系稍远。群体结构分析有助于理解进化过程，并且可以通过基因型和表型的关联研究确定个体所属的亚群。根据以上分析得到的snp信息，可以推断出样本的群体结构。采用plink和frappe软件进行群体结构分析，发现k＝4时snpstructure有最小的错误率，因此将雪茄烟资源群体分成4个亚群，在亲缘关系图谱中用不同颜色代替(图3)。结果如图3所示，从图中可以看出，4个亚群(古巴雪茄烟-蓝色、美国雪茄烟-绿色、印尼雪茄烟-紫色、中国晾晒烟-红色)能够较明显的区分开来。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司海南省公司<120>一套基于kasp的snp标记及其应用<160>144<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaaggtgaccaagttcatgcttcgaaaagatcaaacatcaaagggaaatat51<210>2<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaaggtcggagtcaacggattcgaaaagatcaaacatcaaagggaaatag50<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgaggctggtggttgtgattgatattt27<210>4<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaaggtgaccaagttcatgctactaagtagagccaatatgtgagatga48<210>5<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gaaggtcggagtcaacggattctaagtagagccaatatgtgagatgg47<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgtctccatgggtgatggtaacaaaatt28<210>7<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaaggtgaccaagttcatgctgttctagattcaagctacctctcg45<210>8<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gaaggtcggagtcaacggattcgttctagattcaagctacctctca46<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tgaggtcttacaaatcttagactaccaaaaa31<210>10<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gaaggtgaccaagttcatgcttgtattagcagcttatgcgtctctc46<210>11<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaaggtcggagtcaacggattgtgtattagcagcttatgcgtctctt47<210>12<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12taactgctagtaatagatggacaggttataa31<210>13<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gaaggtgaccaagttcatgctatcatcacacaatgcaggaaaatcaattat51<210>14<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gaaggtcggagtcaacggattcatcacacaatgcaggaaaatcaattac49<210>15<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ttaggaaaagtgaaagatcatagctttatctata34<210>16<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gaaggtgaccaagttcatgctttcaagtttcaagctttaaattgggaacta51<210>17<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gaaggtcggagtcaacggattcaagtttcaagctttaaattgggaactg49<210>18<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tttcaggataatcggaataaacttggaagaa31<210>19<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gaaggtgaccaagttcatgctgtagtctgcgggcatatgttcg43<210>20<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20gaaggtcggagtcaacggattaatgtagtctgcgggcatatgttca46<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21ccagggtcctgatagatggacgtt24<210>22<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gaaggtgaccaagttcatgctatttcctttctaggaattctttgaacaatc51<210>23<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gaaggtcggagtcaacggattatttcctttctaggaattctttgaacaatg51<210>24<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24cacggcagaagaactggagcagtt24<210>25<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gaaggtgaccaagttcatgcttgtgatgagaagagtttgtttataatgtgt51<210>26<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gaaggtcggagtcaacggatttgtgatgagaagagtttgtttataatgtga51<210>27<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27aagatagaaatcaagaacccaatagtctgtt31<210>28<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gaaggtgaccaagttcatgctccaaactcaaagttcaatcactgc45<210>29<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gaaggtcggagtcaacggattgccaaactcaaagttcaatcactgt46<210>30<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tctattggttcagaggtttgtgtgaagaa29<210>31<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31gaaggtgaccaagttcatgcttatgcagtattttgatcatttgccctataa51<210>32<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32gaaggtcggagtcaacggatttgcagtattttgatcatttgccctatag49<210>33<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gaacaggggtgcattgataggagtt25<210>34<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gaaggtgaccaagttcatgctccccaaaagcacaacattcgaaatac47<210>35<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gaaggtcggagtcaacggatttccccaaaagcacaacattcgaaataa48<210>36<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36cagatttagattcgcaggaagtctcttaa29<210>37<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gaaggtgaccaagttcatgctctcaggtcaacacataacaactcaat47<210>38<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gaaggtcggagtcaacggattctcaggtcaacacataacaactcaac47<210>39<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39tggtctcgtgatacaaggccactta25<210>40<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40gaaggtgaccaagttcatgcttcatggaaatttgggacataactattcg49<210>41<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gaaggtcggagtcaacggattattcatggaaatttgggacataactattca51<210>42<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42acagacctcctcatttggggatcat25<210>43<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gaaggtgaccaagttcatgctagttggaaaacattgctccattcgc46<210>44<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gaaggtcggagtcaacggattaaagttggaaaacattgctccattcgt48<210>45<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45atttcggatcagagaccgggttgat25<210>46<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46gaaggtgaccaagttcatgctctaaaggacaacaatttgatacatttgact51<210>47<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47gaaggtcggagtcaacggattctaaaggacaacaatttgatacatttgaca51<210>48<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48tccacgtaatccatcattttgttgatatgaa31<210>49<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49gaaggtgaccaagttcatgcttctgcaggtaaccagtaagaaacca46<210>50<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50gaaggtcggagtcaacggatttgcaggtaaccagtaagaaaccg44<210>51<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51agcgaaattgctcctgctaggacaa25<210>52<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52gaaggtgaccaagttcatgcttatataaatctcagtttctagcgaacacat51<210>53<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53gaaggtcggagtcaacggatttataaatctcagtttctagcgaacacac49<210>54<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54tttatacgtagaaattgggaatcttcaggat31<210>55<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>55gaaggtgaccaagttcatgctgcttgtcattatatatgggagactaga48<210>56<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>56gaaggtcggagtcaacggattcttgtcattatatatgggagactagc47<210>57<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>57gtaagatggacaacccagtacccaa25<210>58<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>58gaaggtgaccaagttcatgctggcatatcatcataagactaggcaaat48<210>59<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>59gaaggtcggagtcaacggattgcatatcatcataagactaggcaaac47<210>60<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>60gagaggcattgatccaacttttgtttgaat30<210>61<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>61gaaggtgaccaagttcatgcttgagtaaggtaccgggtgactg43<210>62<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>62gaaggtcggagtcaacggattattgagtaaggtaccgggtgacta45<210>63<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>63gataccacttttgtcacaacccaaattgat30<210>64<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>64gaaggtgaccaagttcatgctattgattattttggtcctccagttcca48<210>65<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>65gaaggtcggagtcaacggatttgattattttggtcctccagttccg46<210>66<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>66acgggtggttactacgaggtgaatt25<210>67<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>67gaaggtgaccaagttcatgcttaacgccacctgggcgggt40<210>68<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>68gaaggtcggagtcaacggattacgccacctgggcgggc38<210>69<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>69ttgtgttgtaatttgaattttaacctacgagata34<210>70<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>70gaaggtgaccaagttcatgctacttttgggtaaacagactcagaatca48<210>71<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>71gaaggtcggagtcaacggattcttttgggtaaacagactcagaatcg47<210>72<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>72aactatacgaacctatcggaacaatcaaaat31<210>73<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>73gaaggtgaccaagttcatgcttctggccgaaatcatatgtagcact46<210>74<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>74gaaggtcggagtcaacggatttggccgaaatcatatgtagcacc44<210>75<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>75gtgactatgcaagttgacgagtgtatat28<210>76<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>76gaaggtgaccaagttcatgctactctcttaaatatccccaaaagcact48<210>77<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>77gaaggtcggagtcaacggattctctcttaaatatccccaaaagcacc47<210>78<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>78gaagtctcctcagggtaagtattttgaatt30<210>79<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>79gaaggtgaccaagttcatgctcgggcattgtttcatcttggtatct46<210>80<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>80gaaggtcggagtcaacggattgggcattgtttcatcttggtatcc45<210>81<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>81gcctcgacccatttggtgaaatagtt26<210>82<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>82gaaggtgaccaagttcatgctgatttatatacttgttaggatgtttggacta52<210>83<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>83gaaggtcggagtcaacggattatttatatacttgttaggatgtttggactg51<210>84<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>84gcagtggaattcatctaaaacaatccgaaa30<210>85<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>85gaaggtgaccaagttcatgcttgaagaacagaatggagcaagagga46<210>86<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>86gaaggtcggagtcaacggattaagaacagaatggagcaagaggg44<210>87<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>87cgcggatcaggacttgcgggta22<210>88<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>88gaaggtgaccaagttcatgctatccgatgatccaatctgcatcac45<210>89<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>89gaaggtcggagtcaacggattgatccgatgatccaatctgcatcat46<210>90<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>90cattataaccaatatccttccgtgatcgaa30<210>91<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>91gaaggtgaccaagttcatgctgaaggatatggcagagcttcgc43<210>92<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>92gaaggtcggagtcaacggattaagaaggatatggcagagcttcgt45<210>93<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>93tcttcgcgttcgcgtaacactcttt25<210>94<211>53<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>94gaaggtgaccaagttcatgctcatatactatgacctatcaaaagctcaataat53<210>95<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>95gaaggtcggagtcaacggatttatactatgacctatcaaaagctcaataac51<210>96<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>96gctaccggaggcaataagaacaatataaaa30<210>97<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>97gaaggtgaccaagttcatgctactctagatctctatagctgaggac46<210>98<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>98gaaggtcggagtcaacggattaaactctagatctctatagctgaggat48<210>99<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>99gattaaagcagtgcagagttagaccata28<210>100<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>100gaaggtgaccaagttcatgcttaaacatcgttccacgttgtagcca46<210>101<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>101gaaggtcggagtcaacggattacatcgttccacgttgtagccg43<210>102<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>102aaggagactaaaggaaagcctttgataattt31<210>103<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>103gaaggtgaccaagttcatgctgcggtggaacggcggatac40<210>104<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>104gaaggtcggagtcaacggattggcggtggaacggcggatat41<210>105<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>105ctaaattaccttccaaacaataccttcaaattaat35<210>106<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>106gaaggtgaccaagttcatgctttttctttcgcttcctcgttttcactt48<210>107<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>107gaaggtcggagtcaacggattttctttcgcttcctcgttttcactc46<210>108<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>108taaaatgtgcaccattaagcagacaatgttt31<210>109<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>109gaaggtgaccaagttcatgctacacacgtcacaaatgacaccaca45<210>110<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>110gaaggtcggagtcaacggattcacacgtcacaaatgacaccacg44<210>111<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>111caaagaaaagcctctgtaaactcctgatat30<210>112<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>112gaaggtgaccaagttcatgctacctccccaactcaactgagtc43<210>113<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>113gaaggtcggagtcaacggattcacctccccaactcaactgagta44<210>114<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>114gtagcactctttgattgggcggtttat27<210>115<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>115gaaggtgaccaagttcatgctccaagttcaggtccccttgcaa43<210>116<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>116gaaggtcggagtcaacggattcaagttcaggtccccttgcac42<210>117<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>117tgcacgcttcatattcggccatattatt28<210>118<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>118gaaggtgaccaagttcatgctatcatcagtatcccttacattgtcaca48<210>119<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>119gaaggtcggagtcaacggattcatcagtatcccttacattgtcacg46<210>120<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>120aatctatcgttgcattgttcgatatggatat31<210>121<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>121gaaggtgaccaagttcatgctcacagatattcttctcaaggaatttgaa49<210>122<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>122gaaggtcggagtcaacggattcacagatattcttctcaaggaatttgac49<210>123<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>123ctcatgacttgtagaacctatgaaccta28<210>124<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>124gaaggtgaccaagttcatgctagaccttacccctacctttatgga45<210>125<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>125gaaggtcggagtcaacggattagaccttacccctacctttatggt45<210>126<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>126cttgagccgagggtctatcggaaa24<210>127<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>127gaaggtgaccaagttcatgctacttgtcgaacccgccagtcta43<210>128<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>128gaaggtcggagtcaacggattacttgtcgaacccgccagtctt43<210>129<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>129agatacaagaagaaagacattccgggtt28<210>130<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>130gaaggtgaccaagttcatgctacagctatagaatcccccaccg43<210>131<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>131gaaggtcggagtcaacggatttacagctatagaatcccccacca44<210>132<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>132gaatccttgagtgcttctgtgcactt26<210>133<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>133gaaggtgaccaagttcatgctaagactaaaattccaggatagttggct48<210>134<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>134gaaggtcggagtcaacggattgactaaaattccaggatagttggcc46<210>135<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>135tgcaccatacggacaaccctcttta25<210>136<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>136gaaggtgaccaagttcatgctaaagcggaaataacaagttcgcatcta48<210>137<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>137gaaggtcggagtcaacggattagcggaaataacaagttcgcatctg46<210>138<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>138ggggtactcccatttgtgaggtaaaa26<210>139<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>139gaaggtgaccaagttcatgctaactgtgattattcccatttctgtttgtta51<210>140<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>140gaaggtcggagtcaacggattctgtgattattcccatttctgtttgttg49<210>141<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>141tctgtctcccgatgaagtaagccaa25<210>142<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>142gaaggtgaccaagttcatgctcatgtgatttgtggcggtacaagt45<210>143<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>143gaaggtcggagtcaacggattatgtgatttgtggcggtacaagc44<210>144<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>144tactcgaatgcctccgaataaaatcaattat31当前第1页12