核酸、多肽偶联组合物、多肽组合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种核酸、多肽偶联组合物、多肽组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase，cdk)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期调控中发挥重要作用，推动、调控细胞周期各时相的有序进行，促进细胞分裂和增殖。cdk3是cdk家族的重要成员之一，在细胞周期调控中发挥重要作用。cdk3活性出现在g1期，与cycline结合，在g1/s转换中发挥重要作用。此外，cdk3与cyclinc结合，促使细胞从g0重返细胞周期。

研究表明，cdk3在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中高表达，mir-873和mir-125a-3p通过下调靶基因cdk3的表达，降低er(雌激素受体)活性，抑制er阳性乳腺癌细胞的增殖和荷瘤小鼠的肿瘤生长。研究发现，cdk3在脑胶质瘤中高表达。cdk3磷酸化atf1(转录激活因子1)和c-jun(一种转录调节因子，属亮氨酸拉链家族成员)，激活atf1和ap-1(一种转录激活因子)的转录活性，促进jb6细胞(小鼠表皮细胞)转化和ras基因诱导的nih3t3细胞平板集落形成，而cdk3knockdown(cdk3敲低)抑制atf1活性、抑制胶质瘤细胞增殖和软琼脂克隆形成。研究还发现，cdk3在皮肤癌中高表达，cdk3通过与转录因子nfat3相互作用而磷酸化nfat3，促进皮肤癌恶性转化和肿瘤发生。上述研究说明cdk3在细胞恶性转化和肿瘤发生发展中可能发挥癌基因的作用，与肿瘤的恶性生物学行为密切相关。因此，非常有必要研究cdk3的生物学及肿瘤细胞学中的生物功能。其中，识别cdk3的抗体是必不可少的工具。然而，现有的识别cdk3的抗体的特异性较差，严重限制对cdk3的深入研究。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够诱导产生特异性较高的cdk3抗体的多肽组合物。

此外，还有必要提供一种多肽组合物的制备方法和应用、核酸、多肽偶联组合物。

一种多肽组合物，所述多肽组合物含有氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽和氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽。

研究发现，包含有氨基酸序列如seqidno.1的多肽和氨基酸序列seqidno.2所示的多肽的多肽组合物能够诱导产生特异性较高的cdk3抗体，有利于对cdk3的深入研究。

在其中一个实施例中，所述多肽的羧基端被酰胺化。

一种多肽组合物的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或基因工程技术制备氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽和氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽。

一种核酸，所述核酸含有氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽的编码序列或氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽的编码序列。

一种多肽偶联组合物，所述多肽偶联组合物包括两个多肽偶联物，两个所述多肽偶联物均包括多肽部分，一个所述多肽偶联物的多肽部分含有氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽，另一个所述多肽偶联物的多肽部分含有氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽。

在其中一个实施例中，两个所述多肽偶联物均包括偶联部分，所述偶联部分与所述多肽部分连接，所述偶联部分选自血蓝蛋白、卵清蛋白及牛血清白蛋白中的至少一种。

一种cdk3抗体的制备方法，包括如下步骤：

采用抗原对动物进行免疫，收集免疫后的所述动物的血清，得到cdk3抗体，所述抗原为上述多肽组合物或者上述多肽偶联组合物。

一种cdk3抗体，由上述cdk3抗体的制备方法制备得到。

上述多肽组合物、上述多肽偶联组合物或者上述cdk3抗体在制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置中的应用。

一种检测试剂盒，包括：上述多肽组合物、上述多肽偶联组合物或者上述cdk3抗体。

附图说明

图1为实施例5的westernblot的结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的多肽组合物能够诱导产生特异性较高的cdk3抗体，以有利于对cdk3的深入研究，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测cdk3或者用于检测cdk3抗体的效价。

在其中一个实施例中，多肽组合物包含氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽和氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽。具体地，如seqidno.1所示的氨基酸序列为：fpkwtrkgleeivpnlepegrd；如seqidno.2所示的氨基酸序列为：ydpsqritaktalahpyfsspepspaar。

进一步地，氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽的羧基端被酰胺化。具体地，氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽的碳末端的d(即天冬氨酸)的羧基被酰胺化为酰胺基，即nh2-fpkwtrkgleeivpnlepegrd-conh2。

进一步地，氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽的羧基端被酰胺化。具体地，氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽的碳末端的r(即精氨酸)的羧基被酰胺化为酰胺基，即nh2-ydpsqritaktalahpyfsspepspaar-conh2。

研究发现，包含有氨基酸序列如seqidno.1的多肽和氨基酸序列seqidno.2所示的多肽的多肽组合物，能够诱导产生特异性较高的cdk3抗体，有利于对cdk3的深入研究。

上述实施方式的多肽组合物的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或基因工程技术制备得到上述多肽。

在其中一个实施例中，多肽固相合成法为boc固相合成法或fmoc固相合成法。其中，boc为叔丁氧羰基。boc固相合成法中以易酸解的boc基团作为n-ɑ-保护基团。fmoc为9-芴甲氧羰基。fmoc固相合成法中以易酸解的fmoc基团作为n-ɑ-保护基团。

在其中一个实施中，基因工程技术具体为：构建重组载体，重组载体含有上述多肽的编码序列。通过构建重组载体能够较好地保存编码上述多肽的编码序列，有利于多肽的表达。

进一步地，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。重组载体能够表达或克隆多肽。

更进一步地，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于多肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为his标签、gst标签或sumo标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。

具体地，重组载体包括基因工程载体。上述多肽的编码序列插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pet-32a载体、pgex-6p-1载体、ppic-9k载体或ppic-zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。

在其中一个实施中，基因工程技术具体为：通过构建重组细胞，重组细胞含有上述多肽的编码序列或上述重组载体。重组细胞为克隆上述多肽的细胞或表达上述多肽的细胞。

通过构建重组细胞，能够克隆或表达上述多肽，使得能够大规模的制备多肽，并且通过重组细胞定向表达该多肽，以能够获得纯度较高的多肽，进而有利于多肽的应用。

进一步地，重组细胞包括受体细胞。上述多肽的编码序列或上述重组载体位于受体细胞内。

更进一步地，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。具体地，受体细胞为大肠杆菌dh5α、大肠杆菌top10、大肠杆菌orgami(de3)、毕赤酵母gs115或毕赤酵母smd1168。需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。

当然，上述多肽组合物的制备方法还包括将上述多肽混合的步骤。

上述多肽组合物的制备方法中，多肽的制备工艺简单、操作方便，且制备得到的多肽的纯度较高，以诱导产生特异性较高的cdk3抗体，有利于对cdk3的深入研究。

进一步地，提供一实施方式的核酸，该核酸含有上述实施方式的任一多肽的编码序列。此种设置，使得能够通过基因工程技术以获得上述实施方式的任一多肽。

一实施方式的多肽偶联组合物包括两个多肽偶联物，两个多肽偶联物均包括多肽部分，一个多肽偶联物的多肽部分含有氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽，另一个多肽偶联物的多肽部分含有氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽。通过将上述多肽制成多肽偶联物，有利于增强多肽的免疫原性，以高效诱导cdk3抗体，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测cdk3或者用于检测cdk3抗体的效价。

进一步地，两个多肽偶联物均还包括偶联部分。偶联部分与对应的多肽部分连接。更进一步地，偶联部分选自血蓝蛋白(klh)、卵清蛋白(ova)及牛血清白蛋白(bsa)中的至少一种。该偶联部分能够与多肽部分偶联，以激起更加充分的免疫反应。

可选地，偶联部分为klh。klh(keyholelimpethemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一能够与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量为45000～130000。klh比bsa有更高的免疫原性。

在一个具体示例中，多肽部分为上述多肽，偶联部分为klh。

经试验验证，采用上述多肽偶联组合物诱导产生的cdk3抗体的效价在1:32000以上，免疫功能较强。

此外，提供上述实施方式的多肽偶联物的制备方法，包括如下步骤：将sulfo-smcc[即4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐]、多肽部分与偶联部分混合并反应，以使多肽部分与偶联部分连接，得到多肽偶联物；多肽部分含有上述实施方式的多肽或上述实施方式的多肽的制备方法制备得到的多肽。

在其中一个实施例中，sulfo-smcc、多肽部分和偶联部分的质量比为1:10:10。

在其中一个实施例中，将sulfo-smcc、多肽部分与偶联部分混合并反应的步骤包括s110～s120：

s110、将sulfo-smcc与偶联部分混合并反应形成中间物。

在其中一个实施例中，s110包括：将偶联部分与ah溶液混合，得到第一混合物；将sulfo-smcc与dmso(二甲亚砜)混合，得到第二混合物；将第一混合物与第二混合物混合并反应，得到中间物。其中，ah溶液包括na2hpo4、nah2po4、nacl和edta，且ah溶液的ph值为7.2。进一步地，第一混合物中偶联部分的终浓度为10mg/ml。第二混合物中sulfo-smcc的终浓度为100mg/ml。反应温度为室温。反应时间为4h。

在其中一个实施例中，将sulfo-smcc与偶联部分混合并反应的步骤之前，还包括如下步骤：对sulfo-smcc与偶联部分混合并反应得到的反应物进行纯化。需要说明的是，采用本领域的常规方法对上述反应物进行纯化，例如层析柱分离纯化，此处不再赘述。

s120、将中间物与多肽部分混合并反应，得到多肽偶联物。

具体地，将中间物与多肽部分混合并反应的步骤包括：将多肽部分溶解后与ah溶液混合，得到多肽混合物；向中间物中加入多肽混合物混合并反应，得到多肽偶联物。其中，溶解多肽的化学试剂为dmf(n,n-二甲基甲酰胺)。多肽混合物中多肽的浓度为6mg/ml。中间物和多肽混合物混合的混合物中，多肽部分、偶联部分与sulfo-smcc的质量比为10:10:1。

在其中一个实施例中，反应的时间为2h～12h。反应的温度为室温。

上述多肽偶联物的制备方法，操作简单，制备得到的多肽偶联物能够高效诱导cdk3抗体。

一实施方式的cdk3抗体的制备方法能够制备特异性和效价均较高的cdk3抗体，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测cdk3或者用于检测cdk3抗体的效价。该cdk3抗体的制备方法包括如下步骤：采用抗原对动物进行免疫，收集免疫后的动物的血清，得到cdk3抗体，抗原为上述实施方式的多肽组合物或者上述实施方式的多肽偶联组合物。

具体地，将抗原与弗氏完全佐剂混合后，以180μg/只～220μg/只的抗原剂量免疫兔子，饲养2周～3周后，得到初次免疫的兔子；

将抗原与弗氏不完全佐剂混合后以80μg/只～120μg/只的抗原剂量对初次免疫的兔子进行加强免疫，饲养2周～3周后，得到免疫后兔子。其中，加强免疫的次数不限于，可以为一次，也可以为多次，例如可以为四次。加强免疫的次数为四次时，相邻两次加强免疫的时间间隔为2周～3周。

其中，兔子为本领域常规的用于动物实验的兔子，例如可以为rb59731新西兰兔或者rb59732新西兰兔。

需要说明的是，动物不限于为兔子，也可以为其他动物，例如小鼠或者大鼠。

在其中一个实施例中，收集免疫后的动物的血清的步骤之后，还包括如下步骤：纯化血清，得到cdk3抗体。纯化血清的方式为亲和纯化。

上述cdk3抗体的制备方法操作简单，采用上述实施方式的多肽组合物或者上述实施方式的多肽偶联组合物作为抗原能够制备得到特异性和效价均较高的cdk3抗体。

一实施方式的检测试剂盒包括上述实施方式的多肽组合物或者上述实施方式的多肽偶联组合物。该检测试剂盒能够用于检测cdk3抗体的效价。

需要说明的是，上述检测试剂盒还可以包括本领域中其他常见的试剂，例如包括包被液、封闭液和洗涤液。其中，包被液例如可以为ph8.5的tris-hcl、10mm、ph7.4的pbs或者50mm、ph9.6的na2co3。封闭液包括bsa(牛血清蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白或者明胶等。洗涤液为pbst(磷酸盐缓冲液)或纯水。

上述检测试剂盒能够用于检测cdk3抗体的效价，并且检测的准确性较高。

一实施方式的检测试剂盒包括上述实施方式的cdk3抗体。该检测试剂盒能够用于检测cdk3。

需要说明的是，上述检测试剂盒还可以包括本领域中其他常见的试剂，可以根据需要进行设置，此处不再赘述。

上述检测试剂盒中的cdk3抗体具有较高的特异性和效价，能够用于检测cdk3，并且检测的特异性和准确性较高。

以下为具体实施例部分：

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[m](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例1

多肽的合成

根据设计的氨基酸序列，采用固相合成法合成多肽。其中，氨基酸序列如seqidno.1所示的多肽命名为p1。氨基酸序列如seqidno.2所示的多肽命名为p2。

固相合成法的过程具体包括：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构与固相载体(即不溶性的高分子树脂)相连，然后以该结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分(即经活化的待连接氨基酸)反应，接长肽链，重复操作，直到达到所要合成的肽链长度为止，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，得到多肽。

其中，将裂解树脂后的肽链进行纯化的方式为rp-hplc(反相高效液相色谱)，纯化条件为：流动相a为质量百分含量为0.1％的tfa(三氟乙酰基)的水溶液，流动相b为质量百分含量为0.1％的tfa的乙腈溶液；洗脱方式为梯度洗脱，即以流动相a和流动相b的体积比为90:40在30min内洗脱至梯度流动相a和流动相b的体积比为40:90，流速为1ml/min；温度为室温(即23℃)；检测器为紫外检测器，检测波长为214nm。

纯化的具体步骤包括：将裂解树脂后的肽链溶解在流动相a中，注入20mg～30mg(或者2ml～2.5ml)样品，按照上述纯化条件进行层析，并收集主峰，然后冻干，得到纯化后的多肽。

采用液相色谱质谱法(lc-ms)鉴定纯化后的多肽的纯度，鉴定条件为：流动相a为质量百分含量为0.05％的tfa(三氟乙酰基)的水溶液，流动相b为质量百分含量为0.1％的tfa的乙腈溶液；洗脱方式为梯度洗脱，即以流动相a和流动相b的体积比为90:10在10min内洗脱至梯度流动相a和流动相b的体积比为40:60，流速为1ml/min；温度为室温(即23℃)；检测器为紫外检测器，检测波长为214nm；质谱为大气压电喷雾(api-esi)质谱。经鉴定，纯化后的每种多肽的纯度高于90％。每种多肽均合成10mg。

实施例2

多肽偶联物的制备

(1)柱床准备：纯水及偶联缓冲液洗涤柱床；偶联缓冲液即ah溶液，包括na2hpo4、nah2po4、nacl和edta，且ah溶液的ph值为7.2。

(2)多肽混合物的制备：采用dmf溶解多肽，静置30min，待溶液中无颗粒状不溶物，加ah溶液混合，得到多肽混合物，多肽混合物中多肽的浓度为6mg/ml。其中，多肽为实施例1合成的每种多肽，得到每种多肽的多肽混合物。

(3)将偶联部分与ah溶液混合，得到第一混合物，第一混合物中偶联部分的终浓度为10mg/ml。将sulfo-smcc与dmso混合，得到第二混合物，第二混合物中sulfo-smcc的终浓度为100mg/ml；将第一混合物与第二混合物混合并在室温下反应4h，用层析柱进行分离，得到中间物。偶联部分为钥孔血蓝蛋白。

(4)向中间物中加入多肽混合物，并用垂直混合仪混匀，再置于室温下过夜反应，得到多肽偶联物，将多肽偶联物至于-20℃保存。其中，中间物和多肽混合物混合的混合物中，多肽部分、偶联部分与sulfo-smcc的质量比为10:10:1。

需要说明的是，上述两种多肽均用上述方法制备得到两种多肽偶联物，分别命名为p1-klh和p2-klh。

实施例3

cdk3抗体的制备

1、免疫动物为两只兔子，即rb59731新西兰兔，rb59732新西兰兔。

2、将实施例2制备的p1-klh和p2-klh按照质量比1：1混合之后作为抗原分别免疫两只新西兰兔，具体的cdk3抗体的制备步骤如下：

(1)初次免疫：将抗原与弗氏完全佐剂按体积比为1:1混合后，以200μg/只的抗原剂量免疫兔子，饲养15天后，得到初次免疫的兔子。免疫方式为腹腔注射。

(2)二次免疫：在初次免疫之后，于第15天将抗原与弗氏不完全佐剂按体积比为1:1混合后以100μg/只的抗原剂量对初次免疫的兔子进行二次免疫，正常饲喂。

(3)三次免疫：在初次免疫后的第29天按照步骤(2)的操作对二次免疫的兔子进行三次免疫正常饲喂。在初次免疫后的第35天，对三次免疫的兔子进行采血，采血量为5ml，并收集血清，以用于elisa检测。

(4)四次免疫：在初次免疫之后，于第43天按照步骤(2)的操作对三次免疫的兔子进行四次免疫。

(4)五次免疫：在初次免疫之后，于第57天按照步骤(2)的操作对四次免疫的兔子进行五次免疫。在初次免疫后的第69天，对五次免疫的兔子进行采血，采血量为5ml，并收集血清，以用于elisa检测。两只兔子经五次免疫得到的血清分别命名为第一血清(对应于rb59731新西兰兔)和第二血清(rb59732新西兰兔)。

实施例4

对实施例3得到的第一血清和第二血清分别进行elisa检测

1、阳性血清：实施例3得到的第一血清和第二血清；阴性血清(即阴性对照)：兔进行免疫前的血清；空白对照：体积百分含量为2％的bsa的水溶液。按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、l:16000、1:32000分别稀释各血清样本，以用于进行elisa检测。

2、所需溶液包括包被液、封闭液和洗涤液，包被液为50mm、ph9.6的na2co3；洗涤液为纯水。

3、elisa检测过程如下：

(1)将p1、p2分别溶解于包被液中，得到两种抗原溶液，抗原溶液中抗原的浓度为2μg/ml。

(2)在对应的孔中加入100μl的抗原溶液，4℃过夜孵育。倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次。

(3)每孔加200μl的封闭液，37℃孵育1小时。倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次，得到包被有p1的酶标板和包被有p2的酶标板。

(4)每孔加100μl的一抗(即步骤1中的各稀释后的血清)，37℃孵育1小时。倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次。

(5)每孔加100μl的二抗(1:10000稀释后的羊抗兔二抗，羊抗兔二抗购于sigma公司)，37℃孵育1小时。倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次。

(6)拍干孔中残留液体，每孔加100μl的显色液(tmb)，37℃避光显色10min。每孔加50μl、2m的h2so4的水溶液终止显色反应，并立即读取450nm下的吸光值(即od值)。测定结果详见表1。

表1elisa的检测结果

实施例5

特异性验证

(1)培养hek293t细胞于6孔板中(0fbsdmem培养基，37度，5％co2)，密度约为60％～70％后；利用invitrogenlipo3000，按照invitrogenlipo3000的体积(μl)与质粒的质量(μg)1：1的比例于hek293t中分别转染pcdh-cdk3表达质粒和pcmv6-entry-cdk2表达质粒，接着继续培养36h。其中，pcdh-cdk3表达质粒中cdk3蛋白的orf(开放阅读框)如seqidno.3所示，即：5’-atggatatgttccagaaggtagagaagatcggagagggcacctatggggtggtgtacaaggccaagaacagggagacagggcagctggtggccctgaagaagatcagactggatttggagatggagggggtcccaagcactgccatcagggagatctcgctgctcaaggaactgaagcaccccaacatcgtccgactgctggacgtggtgcacaacgagaggaagctctatctggtgtttgagttcctcagccaggacctgaagaagtacatggactccaccccaggctcagagctccccctgcacctcatcaagagctacctcttccagctgctgcagggggtgagtttctgccactcacatcgggtcatccaccgagacctgaagccccagaacctgctcatcaatgagttgggtgccatcaagctggctgacttcggcctggctcgcgccttcggggtgcccctgcgcacctacacccatgaggtggtgacactgtggtatcgcgcccccgagattctcttgggcagcaagttctataccacagctgtggatatctggagcattggttgcatctttgcagagatggtgactcgaaaagccctgtttcctggtgactctgagattgaccagctctttcgtatctttcgtatgctggggacacccagcgaagacacatggcccggggtcacccagctgcctgactataagggcagcttccctaagtggaccaggaagggactggaagagattgtgcccaatctggagccagagggcagggacctgctcatgcaactcctgcagtatgaccccagccagcggatcacagccaagactgccctggcccacccgtacttctcatcccctgagccctccccagctgcccgccagtatgtgctgcagcgattccgccattga-3’；pcmv6-entry-cdk2表达质粒中cdk2蛋白的orf如seqidno.4所示，即：5’-atggagaacttccaaaaggtggaaaagatcggagagggcacgtacggagttgtgtacaaagccagaaacaagttgacgggagaggtggtggcgcttaagaaaatccgcctggacactgagactgagggtgtgcccagtactgccatccgagagatctctctgcttaaggagcttaaccatcctaatattgtcaagctgctggatgtcattcacacagaaaataaactctacctggtttttgaatttctgcaccaagatctcaagaaattcatggatgcctctgctctcactggcattcctcttcccctcatcaagagctatctgttccagctgctccagggcctagctttctgccattctcatcgggtcctccaccgagaccttaaacctcagaatctgcttattaacacagagggggccatcaagctagcagactttggactagccagagcttttggagtccctgttcgtacttacacccatgaggtggtgaccctgtggtaccgagctcctgaaatcctcctgggctgcaaatattattccacagctgtggacatctggagcctgggctgcatctttgctgagatggtgactcgccgggccctattccctggagattctgagattgaccagctcttccggatctttcggactctggggaccccagatgaggtggtgtggccaggagttacttctatgcctgattacaagccaagtttccccaagtgggcccggcaagattttagtaaagttgtacctcccctggatgaagatggacggagcttgttatcgcaaatgctgcactacgaccctaacaagcggatttcggccaaggcagccctggctcaccctttcttccaggatgtgaccaagccagtaccccatcttcgactc-3’。

(2)36h后，使用1×laemllilysisbuffer裂解细胞，并用10％polyacrilamide凝胶进行sds-page电泳，然后将凝胶转印至pvdf膜。

(3)1小时5％脱脂牛奶封闭后，用5％脱脂牛奶以1:500的体积比稀释实施例3制备的第一血清孵育2小时，以1:10000稀释二抗(羊抗兔二抗)，完成westernblot的后续步骤，结果如图1所示。

由图1可知，以p1-klh和p2-klh的混合物作为抗原诱导产生的抗体能够特异性的识别cdk3而不识别cdk2。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>深圳大学

<120>核酸、多肽偶联组合物、多肽组合物及其制备方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

pheprolystrpthrarglysglyleuglugluilevalproasnleu

151015

gluprogluglyargasp

20

<210>2

<211>28

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tyraspproserglnargilethralalysthralaleualahispro

151015

tyrpheserserprogluproserproalaalaarg

2025

<210>3

<211>918

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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