一种高效分离人滑膜原代细胞的方法与流程

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种高效分离人滑膜原代细胞的方法。

背景技术：

滑膜(synovium)是关节囊的内层，呈淡红色，薄而柔软，由疏松结缔组织组成。滑膜可以分泌滑液，在关节活动中起重要作用。正常的滑膜分为两层，即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层)。滑膜细胞起源于骨骼胚基中的间充质。滑膜组织内包含多种细胞，如滑膜细胞、白细胞、脂肪细胞等。滑膜细胞又分a型和b型两种。巨噬细胞样a型细胞(mlc)有丝状伪足，具有吞噬功能，不具有增殖能力。b型滑膜细胞(flc)又称成纤维滑膜细胞，分裂增殖迅速，可以进行体外传代培养。

由于滑膜细胞可以分泌多种炎症介质，如肿瘤坏死因子(tnf)、白细胞介素1(il-1)等介质参与关节损伤的病理过程。滑膜细胞是维持关节正常功能的重要组织结构，同时也是各种关节疾病疾患时的主要病变部位，特别是内风湿性关节炎中滑膜组织的改变最为明显。通过体外培养滑膜细胞，并检测其功能，在研究骨关节炎发病机制、临床疗效作用机制、抗风湿等新型药物筛选及药理机制方面具有重要意义，而体外培养滑膜细胞也是研究其形态、结构和功能，及其在关节病中的作用和影响的前提和基础。而如何最大限度的将滑膜原代细胞从滑膜组织中进行分离，同时保持细胞的完整性和代谢活性，是亟需解决的一个难题。

目前，滑膜细胞培养法有组织块培养法、酶消化法等。组织块培养法是在无菌的条件下取出滑膜组织，用无菌的pbs溶液冲洗3遍，然后用眼科剪分离滑膜周围的脂肪组织并将滑膜剪碎成1-2mm³的碎块，将碎块在细胞培养瓶底部均匀铺展，加入2mldmem完全培养液，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，每3-5d更换培养基并小心除去非贴壁组织块，当成纤维样滑膜细胞铺满70％-80％的瓶底时传代。酶消化法是在超净台内取出滑膜组织，用无菌pbs溶液冲洗3遍，分离滑膜组织，然后将滑膜组织充分剪碎后放入培养瓶中，用0.25％胰蛋白酶消化30min，离心弃胰酶，再加入胶原酶消化2h，最后过滤加入2mldmem完全培养液，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，每24h换液1次，细胞长满瓶底时进行传代。在临床应用中，组织块培养法的缺点是组织块种植困难不易成活、且原代细胞生长周期长、细胞数量少；酶消化法的缺点是不能有效消化分离纤维组织，使滑膜细胞不易游离，且过筛网时堵塞网孔，故细胞数量很少。

可见，开发一种可获得纯度高数量足的滑膜细胞的高效分离滑膜细胞的方法具有积极的意义。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、稳定、便捷分离人滑膜原代细胞的培养方法，该方法可简化传统原代培养方法，降低成本，得到大量的滑膜细胞。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效分离人滑膜原代细胞的方法，包括如下步骤：

(1)取人体新鲜滑膜组织置于无菌培养皿中，采用hank′s平衡盐混合液反复冲洗，并将清洗后的滑膜组织转移至无菌培养瓶中，以无菌剪刀剪碎，移入ep管并加入hank′s平衡盐混合液混匀，离心并弃上清；

(2)收集离心后的沉淀物，加入含有青链霉素混合液的dmem培养液重悬，并加入含ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液，置于co2培养箱中进行消化培养；

(3)培养结束后，取出培养物并加入胰蛋白酶，吹打成浆状，随后用无菌细胞过滤筛过滤，收集滤液并离心，弃上清；

(4)收集离心后的沉淀物，用dmem高糖培养液重悬沉淀物，置于细胞培养瓶于co2细胞培养箱中，进行细胞培养，待细胞贴壁，即得所需人滑膜原代细胞。

具体的，所述步骤(1)中，所述hank′s平衡盐包括如下成分：

具体的，所述步骤(1)中，所述剪碎步骤为将所述滑膜组织剪碎至呈泥状、无颗粒感，且体积不大于1mm³。

具体的，所述步骤(2)中，所述青链霉素在所述dmem培养液中的质量浓度为0.5-1.5wt％。

具体的，所述步骤(2)中，所述消化液中，所述ⅱ型胶原酶的含量为0.1-1u/ml。

具体的，所述步骤(2)中，所述消化液中，所述糖苷酶的含量为0.1-1u/ml。

具体的，所述步骤(2)中，所述消化培养步骤为35-40℃、3-8％co2培养箱消化培养6h。

具体的，所述步骤(3)中，控制所述胰蛋白酶的含量为0.2u/每ml培养物。

具体的，所述步骤(4)中，所述dmem高糖培养液中还包括0.5-1.5wt％青链霉素和8-12wt％澳洲胎牛血清。

具体的，所述步骤(4)中，所述细胞培养步骤为置于35-40℃、3-8％co2恒温培养。

具体的，所述步骤(4)中，还包括在培养48h后进行更换培养液的步骤。

本发明所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，采用hank′s平衡盐溶液对滑膜进行预处理，并在加入ⅱ型胶原酶和糖苷酶消化处理后于co2培养箱中进行消化培养，随后再次加入胰蛋白酶(无需加入酚红、edta)进行处理；经两次酶消化后的细胞经dmem高糖培养液重悬后再次进行co2培养，可高效分离人滑膜组织中的滑膜细胞，并大大缩短组织块贴壁时间，获得纯度高、数量足的滑膜细胞，且获得的滑膜细胞活性强，形态完整，更接近体内滑膜细胞的生物学特性。本发明所述分离方法，通过提高人滑膜细胞原代培养的得率，显著提高临床人体滑膜标本的使用效率，并能够后续稳定培养，为骨关节的研究奠定实验基础，提高科研效率。

本发明所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，由于滑膜细胞可分泌透明质酸、粘蛋白等，且滑膜组织具有一定的粘弹性，选用含ⅱ型胶原酶和糖苷酶的消化液进行处理，可水解糖苷键，降低滑膜组织的粘弹性，促进组织消化，进一步提高消化处理的效果，提高细胞分离的数量和质量。

本发明所述高效分离人滑膜原代细胞的方法，简化传统原代培养方法，操作简单，污染率低，成功率高，有助于降低成本，可得到大量的滑膜细胞，是一种高效、稳定、便捷的分离人滑膜原代细胞的培养方法，具有较好的工业应用前景。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为实施例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；

图2为实施例2中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；

图3为实施例3中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；

图4为对比例1中分离培养的滑膜原代细胞的显微镜照片图；

图5为所述组织剪碎器皿的结构示意图；

图6为所述组织剪碎器皿的优选结构示意图；

图7为所述组织剪碎器皿适配支物架的结构示意图。

具体实施方式

本发明下述实施例中：

所述hank′s平衡盐混合液包括如下成分：

称量上述药品后，准备1000ml的烧杯，加入1000ml超纯水溶解上述药品，以磁力搅拌器助溶，使用前用蒸馏水和超纯水分别洗一次磁珠；上述药品充分溶解后，用50ml的离心管分装，在超净台内用滤膜进行过滤，以封口膜进行保存。

所述dmem培养液成分包括(mg/l)：无水氯化钙200、硝酸铁.9h2o0.10、氯化钾400、无水硫酸镁97.67、氯化钠6400、无水磷酸二氢钠125、l-盐酸精氨酸84、l-盐酸胱氨酸63、l-谷氨酰胺584、甘氨酸30、l-盐酸组氨酸42、l-异亮氨酸105、l-亮氨酸105、l-盐酸赖氨酸146、l-加硫氨酸30、l-苯丙氨酸66、l-丝氨酸42、l-苏氨酸95、l-色氨酸16、l-酪氨酸钠盐104、l-缬氨酸94、d-泛酸钙4、氯化胆碱4、叶酸4、肌醇7.20、烟酰胺4、核黄素0.40、盐酸硫胺4、盐酸吡哆辛4、葡萄糖1000、丙酮酸钠110。

所述dmem高糖培养基成分包括(mg/l)：无水氯化钙200、硝酸铁.9h2o0.10、氯化钾400、无水硫酸镁97.67、氯化钠6400、无水磷酸二氢钠125、l-盐酸精氨酸84、l-盐酸胱氨酸63、l-谷氨酰胺584、甘氨酸30、l-盐酸组氨酸42、l-异亮氨酸105、l-亮氨酸105、l-盐酸赖氨酸146、l-加硫氨酸30、l-苯丙氨酸66、l-丝氨酸42、l-苏氨酸95、l-色氨酸16、l-酪氨酸钠盐104、l-缬氨酸94、d-泛酸钙4、氯化胆碱4、叶酸4、肌醇7.20、烟酰胺4、核黄素0.40、盐酸硫胺4、盐酸吡哆辛4、葡萄糖4500、丙酮酸钠110、青链霉素1wt％、澳洲胎牛血清10wt％。

传统方法中进行组织剪碎时，通常是在平底的培养皿中剪碎，组织剪碎过程中比较分散，效率低，且接触空气面积大，组织容易干。本发明下述各实施例中，所述步骤(1)中的剪碎步骤优选以如附图5-7所示的小型组织剪碎器皿进行剪碎操作。如图5所示结构的组织剪碎器皿，其具有漏斗形状且封底的结构；进一步的，如图6所示的结构，所述组织剪碎皿还可以包括皿盖，方便实验等待消化时盖上盖子，避免污染；优选涉及皿盖直径大于组织剪碎皿直径，使得皿盖具有边沿儿，方便手拿，减少污染率；进一步的，所述组织剪碎器皿还包括如图7所示的支物架，所述支物架上至少设置一排能够放置组织剪碎器皿的插孔，每排设置若干个插孔，方便组织剪碎皿的放置。本发明采用的组织剪碎器皿由于组织剪碎过程中比较集中，剪碎效率高，与空气接触面积小，组织不易发干，且漏斗状方便手拿。

实施例1

取人体新鲜滑膜组织6.7g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用hank′s平衡盐混合液反复冲洗4-5次，直至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，采用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，剪碎呈泥状、无颗粒感且体积尺寸不大于1mm³；用3ml无菌巴氏管移入ep管中，再用hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入ep管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，加入3ml含有1％青链霉素混合液的dmem培养液，并加入300μl含0.5u/mlii型胶原酶和0.5u/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％co2培养箱中消化反应6h。消化结束后取出培养物，在超净台内加入3ml胰蛋白酶(0.25％，无酚红无edta)，使胰蛋白酶的含量为0.2u/每ml组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀用dmem高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％co2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后做换液处理。

本实施例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图1所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型且、数量较多且细胞较纯。

本发明所述方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。

实施例2

取人体新鲜无菌滑膜组织5.2g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用hank′s平衡盐混合液反复冲洗45次，至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，呈泥状、无颗粒感，且体积尺寸不大于1mm³；用3ml无菌巴氏管移入ep管中，再用hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入ep管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，沉淀物加入3ml含有1％青链霉素混合液的dmem培养液，并加入300μl含0.1u/mlii型胶原酶和1u/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％co2培养箱中消化培养6h。培养结束后取出培养物在超净台内加入3ml胰蛋白酶(0.25％，无酚红无edta)，使胰蛋白酶的含量为0.2u/每ml组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀物用dmem高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％co2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后换液处理。

本实施例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图2所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型、数量较多且细胞较纯。

本发明所述方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。

实施例3

取人体新鲜无菌滑膜组织5.6g(观察疏松结缔组织，淡红色，表面平滑闪光，薄而柔润，边缘有绒毛刷状)放于直径为10cm的无菌培养皿中，采用hank′s平衡盐混合液反复冲洗4-5次，至残留血液漂洗干净。将组织转移到直径为3.5cm的无菌培养瓶中，用无菌剪刀剪碎滑膜组织40-60min，呈泥状、无颗粒感，且体积尺寸不大于1mm³；用3ml无菌巴氏管移入ep管中，再用hank′s平衡盐混合液冲洗培养皿后移入ep管中，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后的沉淀去上清，沉淀物加入3ml含有1％青链霉素混合液的dmem培养液，并加入300μl含1u/mlii型胶原酶和0.1u/ml糖苷酶的消化液，用无菌巴氏管重悬滑膜细胞沉淀，将培养皿盖无菌消毒后盖上，置于37℃、5％co2培养箱中消化培养6h。培养结束后取出在超净台内加入3ml胰蛋白酶(无酚红无edta)，使胰蛋白酶的含量为0.2u/每ml组织，吹打成浆状(约20min左右)。用70μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤，滤液收集至10ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清。收集沉淀物用dmem高糖培养基重悬沉渣，并均匀分至细胞培养瓶中，每瓶不超过5ml，置于37℃、5％co2且湿度适宜的恒温细胞孵育箱中，待细胞贴壁，并于48h后换液处理。

本实施例中分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图3所示，可见，分离的细胞生长状态良好，形态以长梭形为主，形态典型、数量较多且细胞较纯。

本发明所述方法可有效去除非滑膜细胞，得到大数量的滑膜细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏，而后续研究也表明，高效分离的滑膜细胞不仅生长状态良好，数量较多，且增殖较快，较易达到实验所需数量。

对比例1

本对比例所述细胞的分离方法同实施例1，其区别仅在于，在所述消化液中不添加糖苷酶。本对比分离得到的滑膜原代细胞的显微镜照片图见附图4所示(与附图1-3相同倍数)，可见分离细胞比较少，且分离细胞也并不纯。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。