一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法与流程

本发明属于细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种培养cd90posi细胞的培养基及其培养方法。
背景技术：
：原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率高、死亡率高，病死率位居国内肿瘤第二位，严重威胁人民群众的生命健康。肝癌起病隐匿，临床表现缺乏特别性，就医时往往处于肝癌中晚期，肝癌早期患者难以发现，严重影响肝癌的治疗效果。目前肝癌的临床检测手段主要通过检测患者血清甲胎蛋白(afp)并结合影像学检查进行确诊，可分为以下几类：b超检查受肠气及周围脏器的影响，分辨率低，b超引导下进行肝脏病灶穿刺活检存在一定假阴性率；同时肝脏穿刺存在创面出血、针道转移等严重并发症。ct或mr仅能分辨直径1.0cm以上的病灶，且有一定的假阳性率与假阴性率。dsa技术虽可提高肝癌检测的准确率，但为侵入性检查，多用于肝癌治疗。由于血清afp显著升高一般出现在肿瘤进展期，且阳性率仅为60-70％，在准确率、检测效率、诊断扰动后对病人治疗风险性和诊断时间的滞后等方面都有明显的局限性，开发新的检测手段有其重要性与迫切性。中国专利申请cn108872603a公开了一种用于肝癌干细胞的鉴定方法，这种方法虽然可以保证标志物蛋白的稳定表达，且表达量与lcsc细胞含量呈现出良好的线性关系，实现lcsc细胞含量的相对定量分析；然而，并没有解决现有肝癌细胞如何大量获取的过程，只有实现肝癌细胞的体外大量增殖，才能更好的对其进行分析。综上所述，现有技术中，缺少培养肝癌细胞的有效方法，而采用现有培养基培养肝癌细胞具有容易聚集成团，不易控制，易发生突变等缺点。在对肝细胞癌微环境细胞群的分析中，我们筛选出cd90posi肿瘤细胞，发现cd90posi细胞促进肝癌细胞的增殖、迁移。同时cd90posi细胞表现出很强的增殖潜力和细胞干性。将cd90posi肝癌细胞注射于裸鼠皮下，发现随着cd90posi细胞所占比例增加，移植的肿瘤体积和重量越大，表明cd90posi细胞是肝细胞癌增殖和生长的关键因素。技术实现要素：针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一种培养cd90posi细胞的培养基及其培养方法。采用本发明提供的培养基培养cd90posi细胞不易聚集成团，培养速度易于控制，同时，还能保证培养过程中细胞的活性，且不会出现在培养过程中细胞继续发生突变的问题。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基94～97.5％，细胞生长抑制剂0.5～3％，突变抑制剂2～3％。优选地，所述的培养cd90posi细胞的培养基，由如下组分及其重量百分数组成：dmem/f-12基础培养基96％，细胞生长抑制剂1.5％，突变抑制剂2.5％。优选地，所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比6～8：2～4组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比2～4：1～3组成。优选地，所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比7：3组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。本发明还提供了一种利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法，包括如下步骤：s1、于无菌条件下，切取新鲜的肝癌组织，培养两代后，利用免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞，得cd90posi细胞；s2、用matrigel母液消化步骤s1所得cd90posi细胞，然后重悬于所述的培养基中，全程置于冰上处理，收集所述细胞悬液，得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液；s3、将步骤s2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1～2：3～5混合均匀，置于34～37℃，放置35～45min，使其成胶；得胶状混合培养物；s4、向步骤s3所得胶状混合培养物中加入所述的培养基，置于36℃，3％的co2培养箱中孵育，24h换液一次，培养，即得。优选地，步骤s1所述免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞的具体过程为：(1)将冻存的肝癌组织从-80℃冰箱中取出，置于37℃的温度下复温，然后用pbs冲洗，于1600rpm的转速下离心5min，收集上清液，重复洗2遍，然后加入15ml的dmem/f12+10％pbs培养液，轻轻吹打，重悬细胞使其分散均匀后转入100ml培养瓶中在37℃，5％的co2环境下培养，待细胞铺满瓶底80％进行传代培养，得原代培养细胞；(2)用0.25％的胰蛋白酶消化步骤(1)所得原代培养细胞，倒置显微镜下观察到细胞脱离瓶底后用胶头吸管将贴壁细胞吹下，加入适量fbs终止消化后转入离心管中，加入pbs除去残余酶，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，用1ml的培养液重悬，充分混匀后，加入培养瓶中，继续加入5ml培养液，于37℃，5％的co2环境下培养，得传代培养细胞；(3)用0.25％的胰蛋白酶消化步骤(2)所得原代培养细胞，充分吹打制备单细胞悬液，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，以10ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，然后用针管吸取细胞悬液后快速推出以将粘聚成团的细胞分散，加入1ml的anti-humancd90pe抗体，混匀后，于4℃，避光孵育30min，每10min取出摇匀一次，用磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与一抗结合的细胞，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，加入2ml的anti-pemicrobed抗体，同样于4℃，避光孵育30min，磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与二抗结合的细胞，加入1ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，将ms分选柱置入固定于分选器上的磁场中，先以1ml的磷酸盐缓冲液润柱，然后用移液枪将细胞悬液缓慢加入分选柱中，取离心管于磁柱下承接分选得到的cd90posi细胞，待细胞悬液通过磁柱后，加入1ml磷酸盐缓冲液，冲洗磁珠，使细胞全部脱离磁柱，加入2ml磷酸盐缓冲液，并用配套的活塞快速将磁柱中结合的cd90posi细胞充入离心管中，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，即得。优选地，步骤s2所述的matrigel母液的质量浓度为9～10mg/ml。优选地，步骤s3所述的matrigel溶液的质量浓度为10～11mg/ml。本发明中，在培养cd90posi细胞时，向培养基中加入由pd-1抑制剂与苦参碱按一定比例组成的细胞生长抑制剂，这样可以有效抑制癌细胞的无限生长，使得癌细胞的体外培养速度可以受控；同时，本申请中还加入了由松茸提取物和刺五加提取物按一定比例组成的突变抑制剂，防止cd90posi细胞在培养过程中突变，以提高细胞培养纯度；而在培养cd90posi细胞的过程中，采用三维培养方法，这样更接近于体内环境，保持癌细胞的增殖、分化能力，有助于人们模拟体内环境，对肝癌细胞的进一步深入研究。此外，申请人还意外发现，将细胞生长抑制剂与突变抑制剂同时加入培养基中，可以有效避免cd90posi细胞的聚集成团问题，使得培养的细胞容易分离成单层，方便对细胞进行计数及后续对肝癌的研究。与现有技术相比，本发明提供的培养cd90posi细胞的培养基及其培养方法具有以下优点：(1)本发明提供的培养cd90posi细胞的培养基，可以控制细胞培养速度，防治细胞在培养过程中发生突变；(2)本发明提供的培养cd90posi细胞的培养基，可以有效避免cd90posi细胞的聚集成团问题，使得培养的细胞容易分离成单层；(3)利用本发明提供的培养基培养cd90posi细胞时，采用三维培养方法，这样更接近于细胞内部环境，可以有效保持癌细胞的活力，有利于后续对肝癌的深入研究。附图说明图1为本发明实施例3组与对比例3组培养cd90posi细胞的聚集情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。所述pd-1抑制剂可购自北京百奥莱博科技有限公司；所述苦参碱可购自上海户实医药科技有限公司；所述松茸提取物、刺五加提取物可购自西安明朗生物科技有限公司；所述anti-humancd90pe抗体、anti-pemicrobed抗体可购自上海嵘崴达实业有限公司；其余试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。实施例1一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基97.5％，细胞生长抑制剂0.5％，突变抑制剂2％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比6：2组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比2：1组成。利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法，包括如下步骤：s1、于无菌条件下，切取新鲜的肝癌组织，培养两代后，利用免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞，得cd90posi细胞；所述免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞的具体过程为：(1)将冻存的肝癌组织从-80℃冰箱中取出，置于37℃的温度下复温，然后用pbs冲洗，于1600rpm的转速下离心5min，收集上清液，重复洗2遍，然后加入15ml的dmem/f12+10％pbs培养液，轻轻吹打，重悬细胞使其分散均匀后转入100ml培养瓶中在37℃，5％的co2环境下培养，待细胞铺满瓶底80％进行传代培养，得原代培养细胞；(2)用0.25％的胰蛋白酶消化步骤(1)所得原代培养细胞，倒置显微镜下观察到细胞脱离瓶底后用胶头吸管将贴壁细胞吹下，加入适量fbs终止消化后转入离心管中，加入pbs除去残余酶，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，用1ml的培养液重悬，充分混匀后，加入培养瓶中，继续加入5ml培养液，于37℃，5％的co2环境下培养，得传代培养细胞；(3)用0.25％的胰蛋白酶消化步骤(2)所得原代培养细胞，充分吹打制备单细胞悬液，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，以10ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，然后用针管吸取细胞悬液后快速推出以将粘聚成团的细胞分散，加入1ml的anti-humancd90pe抗体，混匀后，于4℃，避光孵育30min，每10min取出摇匀一次，用磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与一抗结合的细胞，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，加入2ml的anti-pemicrobed抗体，同样于4℃，避光孵育30min，磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与二抗结合的细胞，加入1ml的磷酸盐缓冲液重悬细胞，将ms分选柱置入固定于分选器上的磁场中，先以1ml的磷酸盐缓冲液润柱，然后用移液枪将细胞悬液缓慢加入分选柱中，取离心管于磁柱下承接分选得到的cd90posi细胞，待细胞悬液通过磁柱后，加入1ml磷酸盐缓冲液，冲洗磁珠，使细胞全部脱离磁柱，加入2ml磷酸盐缓冲液，并用配套的活塞快速将磁柱中结合的cd90posi细胞充入离心管中，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，即得；s2、用matrigel母液消化步骤s1所得cd90posi细胞，然后重悬于所述的培养基中，全程置于冰上处理，收集所述细胞悬液，得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液；所述的matrigel母液的质量浓度为9mg/ml；s3、将步骤s2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1：3混合均匀，置于34℃，放置35min，使其成胶；得胶状混合培养物；所述的matrigel溶液的质量浓度为10mg/ml；s4、向步骤s3所得胶状混合培养物中加入所述的培养基，置于36℃，3％的co2培养箱中孵育，24h换液一次，培养，即得。实施例2一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基94％，细胞生长抑制剂3％，突变抑制剂3％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比8：4组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比4：3组成；利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法，包括如下步骤：s1、于无菌条件下，切取新鲜的肝癌组织，培养两代后，利用免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞，得cd90posi细胞；所述免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞的具体过程与实施例相同；s2、用matrigel母液消化步骤s1所得cd90posi细胞，然后重悬于所述的培养基中，全程置于冰上处理，收集所述细胞悬液，得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液；所述的matrigel母液的质量浓度为10mg/ml；s3、将步骤s2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比2：5混合均匀，置于37℃，放置45min，使其成胶；得胶状混合培养物；所述的matrigel溶液的质量浓度为11mg/ml；s4、向步骤s3所得胶状混合培养物中加入所述的培养基，置于36℃，3％的co2培养箱中孵育，24h换液一次，培养，即得。实施例3一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基96％，细胞生长抑制剂1.5％，突变抑制剂2.5％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比7：3组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法，包括如下步骤：s1、于无菌条件下，切取新鲜的肝癌组织，培养两代后，利用免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞，得cd90posi细胞；所述免疫磁珠间接标记分离法分离cd90posi细胞的具体过程与实施例相同；s2、用matrigel母液消化步骤s1所得cd90posi细胞，然后重悬于所述的培养基中，全程置于冰上处理，收集所述细胞悬液，得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液；所述matrigel母液的质量浓度为9.5mg/ml；s3、将步骤s2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1.5：4混合均匀，置于36℃，放置40min，使其成胶；得胶状混合培养物；所述的matrigel溶液的质量浓度为10.5mg/ml；s4、向步骤s3所得胶状混合培养物中加入所述的培养基，置于36℃，3％的co2培养箱中孵育，24h换液一次，培养，即得。对比例1一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基96％，细胞生长抑制剂1.5％，突变抑制剂2.5％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比1：1组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。所述利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法与实施例3类似；与实施例3的区别在于，对比例1中的细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比1：1组成。对比例2一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基96％，细胞生长抑制剂1.5％，突变抑制剂2.5％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比7：3组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比1：1组成。所述利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法与实施例3类似；与实施例3的区别在于，对比例2中的突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比1：1组成。对比例3一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基97.5％，突变抑制剂2.5％；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。所述利用所述培养基培养cd90posi细胞的方法与实施例3类似；与实施例3的区别在于，对比例3中不包含细胞生长抑制剂。对比例4一种培养cd90posi细胞的培养基所述培养cd90posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：dmem/f-12基础培养基96％，细胞生长抑制剂1.5％，突变抑制剂2.5％；所述细胞生长抑制剂由pd-1抑制剂与苦参碱按重量比7：3组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。与实施例3的区别在于，对比例4利用所述培养基，采用常规的传代培养方法培养cd90posi细胞。试验例1细胞活力测定1.试验样品：实施例1-3组及对比例1组，对比例4组的培养基及培养cd90posi细胞的方法；2.试验方法：取实施例1-3及对比例1组，对比例4培养的细胞悬液各1ml，分别稀释至2×104，各取0.5ml加入试管中，然后向试管中加入0.5ml，4％的台盼兰染液，染色2～3min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片，于显微镜下任取几个视野计数死细胞数和活细胞数，计算细胞活力。细胞活力＝活细胞数/(死细胞数+活细胞数)×100％3.试验结果：具体试验结果见表1。表1不同细胞样品的活力比较试验样品细胞总数/个活细胞数/个细胞活力/％实施例1组1500140493.6实施例2组1500142294.8实施例3组1500145897.2对比例1组1500128485.6对比例4组1500115276.8由表1可知，本发明实施例1-3组培养的细胞活力可以达到90％以上，尤其是实施例3组的细胞活力达到97.2％，故实施例3组为本发明的最佳实施例；而对比例4采用常规的传代培养方法培养cd90posi细胞，活力为76.8％，由此可知，采用三维培养方法培养cd90posi细胞大大提高了细胞活力，而对比例1组由于改变培养基细胞活力也有所下降。试验例2细胞聚集性观察1.试验样品：实施例3组及对比例3组培养的细胞2.试验方法：分别取实施例3组，对比例3组的细胞悬液各10μl，加90μl生理盐水稀释，震荡混匀，取少许置于载玻片上，加上盖片，于显微镜下取一清晰视野，观察细胞聚集成团情况。3.试验结果：具体试验结果见图1。图1中，a表示本发明实施例3组培养的细胞，b表示对比例3组培养的细胞；由图1可知，本发明实施例3组的细胞无明显聚集成团现象，而对比例3组出现严重的聚集成团现象。试验例3细胞突变检测1.试验样品：实施例3组及对比例2组培养的细胞2.试验方法：各取少许实施例3组及对比例2组的细胞悬液，100倍稀释，混匀，然后滴一滴置于载玻片上，加上盖片，于电子显微镜下随机取几个视野，观察细胞的形态变化，及染色体，核仁等结构的变化。计算细胞突变率细胞突变率＝观察到的突变细胞/观察的细胞总数×100％3.试验结果：具体试验结果见表2。表2不同方法培养的细胞样品的突变结果对比试验样品细胞总数/个突变细胞数/个突变率/％实施例3组50030.6对比例2组5008717.4由表2可知，本发明实施例3组的培养基培养的cd90posi细胞突变率仅为0.6％，而对比例2组的细胞突变率高达17.4％，这是由于对比例2组改变了细胞突变抑制剂中各组分的比例。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12