一种稳定同位素13C标记的Cry蛋白的制备方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种稳定同位素13c标记的cry蛋白的制备方法。
背景技术：
：2019年全球转基因作物的种植面积到2亿公顷，转cry基因作物是居耐除草剂转基因作物之后的第二大类转基因作物。目前cry基因已经成为转基因植物育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因，cry基因己被成功导入水稻、烟草、玉米和棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性状的转基因植物品种和种质资源。cry蛋白是由苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis，bt)在芽孢形成初期表达产生的原毒素(protoxin)被蛋白酶水解生成的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白(crystallineprotein)。其中，cry1a是一个对鳞翅目害虫有高活性的杀虫蛋白家族，目前已知的cry1a类基因有10个模式种类，112个杀虫基因，其中cry1ab/1ac应用最为广泛。转cry1ab/1ac基因抗虫水稻“华恢1号”于2009年8月17日获得了农业转基因生物安全证书，2014年12月11安全证书获得续签。随着转bt基因作物种植面积的迅速增加，其潜在的环境安全性问题引起广泛关注。转bt基因作物的根、茎、叶中均可表达cry蛋白，转cry基因作物会通过根系分泌、花粉飘落和秸秆还田等方式向环境中释放cry蛋白，然而，这些cry蛋白的代谢转化过程尚不清楚。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种稳定同位素13c标记的cry蛋白的制备方法，制备出由稳定同位素13c标记的cry蛋白，其具有较强的杀虫活性，纯度达到99％，适用于采用稳定同位素质谱技术分析cry蛋白的环境行为和生态效益，为转cry基因植物的环境安全评价提供参考和依据。为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种稳定同位素13c标记的cry蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)合成、克隆cry基因合成cry基因，将其连接至克隆载体，得到重组质粒，转化至大肠杆菌进行培养，挑取菌落摇菌培养并提取重组质粒dna，对其进行cry基因定性pcr检测；2)制备包含质粒表达载体的工程菌对重组质粒和表达载体pet28a分别进行双酶切，连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物，得到质粒表达载体pet28a-cry，热激转化至大肠杆菌，挑取转化子进行液体培养，提取质粒，经双酶切鉴定连接正确后转化到感受态细胞，得到包含质粒表达载体的工程菌；3)原核表达将包含质粒表达载体的工程菌接种到以葡萄糖为唯一碳源的m9培养基中，培养菌体至od6000.6-0.8，添加iptg进行诱导培养，收集全菌菌液进行sds-page分析，确认蛋白表达正确；其中，作为碳源的葡萄糖中，添加了13c标记葡萄糖；4)变性、纯化及复性超声处理细胞菌液，离心，得沉淀即包涵体，再进行变性溶解，离心、收集变性液上清得到变性包涵体，用镍柱对变性包涵体进行纯化，得到变性的13c标记cry蛋白，再进行复性，获得稳定同位素13c标记的cry蛋白。优选地，步骤3)中，作为碳源的葡萄糖中，13c标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt％。又，步骤2)中连接表达载体与重组质粒的酶切回收产物时，表达载体酶切片段与重组质粒酶切片段的摩尔数比为1：3-5。优选地，步骤1)的pcr检测方法中，退火温度为55-58℃。又，步骤1)中所述的cry基因为cry1ab基因或cry1ac基因。进一步，步骤2)中，双酶切时使用的内切酶为ncoi和xhoi。又进一步，步骤2)中双酶切的反应体系为：重组质粒或表达载体10μl，ncoi1-2μl，xhoi1-2μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。优选地，步骤3)中的诱导条件为：iptg的用量为0.2-0.4mm，诱导培养时间4-6h。又，步骤3)的m9培养基中na2hpo4·7h2o12-13g/l，kh2po43.0-4.0g/l，nacl0.5-0.6g/l，nh4cl0.6-1.0g/l，mgso4·7h2o0.4-0.5g/l，cacl2·6h2o0.02-0.03g/l，葡萄糖0.04-0.08g/l。又，步骤4)中，变性溶解时，利用浓度为8m的尿素变性液对得到的包涵体进行溶解，包涵体：尿素＝1：3-5，质量比。采用稳定同位素质谱技术可以示踪和定量分析cry蛋白在土壤环境中代谢转化过程，同时有效规避土壤中原有cry蛋白的影响，本发明在原核表达过程中，使用葡萄糖为唯一碳源，在作为唯一碳源的葡萄糖中，添加了13c标记的葡萄糖，其中13c标记葡萄糖占葡萄糖总量的1-10wt％，获得13c标记的cry蛋白，若13c标记葡萄糖占比过高，得到的13c标记的cry蛋白的δ13c值会超过稳定同位素比质谱仪测量上限，若13c标记葡萄糖占比过低，不仅配制含有13c标记葡萄糖的葡萄糖混合物难度增加，且会造成标记量少，δ13c值过低，在示踪时难以检测。本发明中，进行cry基因的pcr检测时，退火温度设为55-58℃，目的基因能够进行特异性扩增，若退火温度过低，会造成pcr非特异性扩增；若退火温度过高，目的基因无法扩增。本发明在双酶切时，在cry1ab/ac基因中引入ncoi和xhoi的酶切位点，cry1ab/ac基因可以完整表达，限定两种内切酶的用量ncoi1-2μl，xhoi1-2μl，可以充分的对目的片段进行双酶切。本发明在进行连接酶反应时候，控制pet28a表达载体酶切片段与puc57-cry1ab/ac重组质粒的摩尔数比为1：3-5的反应比例，连接效果最好，可以形成更多的质粒表达载体pet28a-cry。本发明采用尿素变性溶解cry包涵体时，利用8m尿素的变性液溶解包涵体时，控制粗制包涵体：尿素＝1：3-5，质量比，反应效果最佳，在此控制下尿素可以重复变性溶解包涵体，低于这个比例，包涵体无法溶解，高于这个比例，尿素就会剩余，对后续的纯化不利；在变性后采用一步纯化的ni柱纯化方法，去除了杂质蛋白后，有助于后续的透析复性试验，得到了纯度较高、总量较高的蛋白，制备的cry蛋白量可为12.6mg/lm9培养基。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明在原核表达过程中，使用葡萄糖为唯一碳源，使cry蛋白中含有稳定同位素13c标记，获得的13c标记cry杀虫蛋白纯度均达到99％，检出率高，其活性未到不良影响，适于对外源cry蛋白在土壤中的代谢进一步进行研究，为评价转cry基因植物和释放的cry蛋白的环境安全和生态学效应提供物质基础和技术支持。本发明在制备13c标记的cry蛋白时，成功对原核表达的包涵体进行一步ni柱纯化和复性，得到了纯度较高、总量较高的蛋白，每升培养基中获得的cry蛋白量可达12.6mg，具有生物活性，制备的13c标记的cry蛋白具有较强的杀虫活性，其半致死量lc50为5.44μg蛋白/g饲料。附图说明图1为本发明实施例1中纯化后的cry蛋白sds-page分析结果。图2为本发明实施例1中纯化后的cry蛋白的westernblot检测结果。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例11、制备稳定同位素13c标记cry1ab/ac蛋白，步骤如下：在ncbi数据库中检索转bt基因水稻“华恢1号”cry1ab/ac基因序(eu816953.1)，去除终止密码子序列，分别在5’和3’端引入了ncoi和xhoi的酶切位点。利用两步法合成cry1ab/ac基因，连接到载体puc57得到克隆载体puc57-cry1ab/ac，转化大肠杆菌jm109，lb培养基中过夜培养，挑取菌落摇菌培养并提取质粒，进行cry1ab/ac基因的pcr检测。pcr反应体系为：10×pcrbuffer3μl，2mmol/ldntp3μl，正、反向引物cry1ab/ac-f/r(10μmol/l)各2μl，5u/μltaqdnapolymerase0.3μl，模板dna1-2μl，加蒸馏水补充至30μl。其中，cry1ab/ac基因扩增引物序列如表1所示：表1cry1ab/ac基因扩增引物序列使用内切酶ncoi和xhoi对重组质粒puc57-cry1ab/ac和表达载体pet28a进行双酶切，采用t4连接酶连接表达载体与重组质粒的回收产物，22℃连接过夜，得到质粒表达载体pet28a-cry1ab/ac，将其热激转化至大肠杆菌jm109，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过ncoi和xhoi双酶切鉴定，然后将重组质粒转到bl21(de3)感受态细胞中，得到bl21(de3)/pet28a-cry1ab/ac工程菌。挑取单克隆，将工程菌接种于13c标记葡萄糖为唯一碳源的m9培养基中，37℃培养至菌体od600为0.6-0.8，加入iptg至终浓度为0.2mm，于37℃诱导培养4h，收集全菌菌液进行sds-page(8％分离胶)分析。其中，m9培养基中：na2hpo4·7h2o12.8g/l，kh2po43.0g/l，nacl0.5g/l，nh4cl0.6-1.0g/l，mgso4·7h2o0.492g/l，cacl2·6h2o0.02191g/l，葡萄糖总量0.04-0.08g/l。收集菌液，用1×pbs重悬，超声处理细胞重悬液，离心得到沉淀(沉淀即为包涵体)，采用清洗缓冲液清洗包涵体去除杂质，利用8m尿素变性液将洗涤后包涵体溶解于变性液中，离心收集变性液上清，采用镍柱纯化目的蛋白。采用梯度透析法对变性的13c标记cry1ab/ac蛋白进行复性，纯化后包涵体用含4m尿素的透析缓冲液稀释cry1ab/ac蛋白，从4m、2m、1m、0.5m依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均于4℃透析，4-6h换新鲜透析液，高速离心去除沉淀，最后用1×pbs(ph7.2)4℃透析过夜，获得稳定同位素13c标记的cry1ab/ac杀虫蛋白，制备的cry蛋白量为12.6mg/lm9培养基。本实施例中，cry1ab/ac基因的pcr检测方法的反应程序为：94℃预变性，5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸min，35个循环；72℃延伸7min。本实施例中，重组质粒puc57-cry1ab/ac和表达载体pet28a分别进行双酶切的反应体系为：质粒pet28a10μl，ncoi1μl，xhoi1μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h；重组质粒puc57-cry1ab/ac10μl，ncoi1μl，xhoi1μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。本实施例中，重组质粒与表达载体的连接反应条件为：表达载体pet28a酶切片段与重组质粒puc57-cry1ab/ac酶切片段的摩尔数比为1：5，其中t4连接酶1μl，10×t4dna连接酶缓冲液2.5μl，无菌水补充至25μl，16℃连接过夜。本实施例中，稳定同位素13c标记的葡萄糖占葡萄糖总量的5wt％。本实施例中，13c标记cry1ab/ac蛋白的原核表达的诱导条件为：施加0.2mmiptg，37℃诱导培养时间4h。本实施例中，利用8m尿素的变性液溶解包涵体的质量比为包涵体：尿素＝1：4。2.对制备的13c标记cry1ab/ac蛋白作进一步检测分析2.1westernblot分析对获得的13c标记的cry1ab/ac蛋白进行sds-page分析，在相对分子量66.2kd左右呈单一蛋白条带(参见图1)，说明获得了具有较高纯度的cry1ab/ac蛋白。用凝胶图像分析仪的灰度扫描测得纯化后的13c标记的蛋白条带所占的比例均达到99％，westernblotting实验进一步证实获得的纯化蛋白是cry1ab/ac蛋白(参见图2)。2.2测定杀虫活性将原核表达的13c标记cry蛋白按梯度分别掺入二化螟常规饲料，使各组饲料中蛋白含量分别为1μg/g、5μg/g、10μg/g、15μg/g、20μg/g、25μg/g。每个梯度设置三个重复，每个重复接二化螟初孵幼虫20头，置于玻璃试管中，加塞，以常规饲料接虫作为对照，27±1℃培养，试管顶端用黑布遮光，使试管整体只有底部向光，4天后检查幼虫的死亡率，结果见表2。表2cry1ab/ac蛋白杀虫试验分析剂量/(μg/g)重复次数接虫数平均死亡数1(13c标记的cry蛋白)3203.25(13c标记的cry蛋白)3207.510(13c标记的cry蛋白)32012.215(13c标记的cry蛋白)32015.520(13c标记的cry蛋白)32019.525(13c标记的cry蛋白)32020.0根据杀虫试验结果，通过spss16.0计算13c标记的cry蛋白的半致死浓度(lc50)为5.44μg/g。实施例2本实施例中，除特别说明外，其余步骤与实施例1相同。本实施例中，cry1ab/ac基因的pcr检测的反应程序为：94℃预变性，5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸min，35个循环；72℃延伸7min。本实施例中，重组质粒puc57-cry1ab/ac和表达载体pet28a分别进行双酶切的反应体系为：质粒pet28a10μl，ncoi2μl，xhoi2μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。重组质粒puc57-cry1ab/ac10μl，ncoi2μl，xhoi2μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。本实施例中，重组质粒与表达载体的连接反应条件为：表达载体pet28a酶切片段与重组质粒puc57-cry1ab/ac酶切片段的摩尔数比为1：4，其中t4连接酶1μl，10×t4dna连接酶缓冲液2.5μl，无菌水补充至25μl，16℃连接过夜。本实施例中，稳定同位素13c标记的葡萄糖占葡萄糖总量的1％。本实施例中，13c标记cry1ab/ac蛋白的原核表达的诱导条件为：施加0.4mmiptg，37℃诱导培养时间4h。本实施例中，利用8m尿素的变性液溶解包涵体的质量例为包涵体：尿素＝1：5。利用本实施例制备的13c标记的cry1ab/ac蛋白sds-page结果与图1一致；westernblot分析结果与图2一致，半致死浓度(lc50)为5.62μg/g，说明采用本发明方法制备的13c标记的cry1ab/ac蛋白纯度较高。实施例3本实施例中，除特别说明外，其余步骤与实施例1相同。本实施例中，cry1ab/ac基因的pcr检测方法的反应程序为：94℃预变性，5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸min，35个循环；72℃延伸7min。本实施例中，重组质粒puc57-cry1ab/ac和表达载体pet28a分别进行双酶切的反应体系为：质粒pet28a10μl，ncoi1μl，xhoi2μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。重组质粒puc57-cry1ab/ac10μl，ncoi1μl，xhoi2μl，10×buffer2μl，无菌水补充至20μl，37℃酶切3h。本实施例中，重组质粒与表达载体的连接反应条件为：表达载体pet28a酶切片段与重组质粒puc57-cry1ab/ac酶切片段的摩尔数比为1：3，其中t4连接酶1μl，10×t4dna连接酶缓冲液2.5μl，无菌水补充至25μl，16℃连接过夜。本实施例中，稳定同位素13c标记的葡萄糖占葡萄糖总量的10wt％。本实施例中，13c标记cry1ab/ac蛋白的原核表达的诱导条件为：施加0.2mmiptg，37℃诱导培养时间4h。本实施例中，利用8m尿素的变性液溶解包涵体的质量比为包涵体：尿素＝1：3。利用本实施例制备的13c标记的cry1ab/ac蛋白sds-page结果与图1一致；westernblot分析结果与图2一致，半致死浓度(lc50)为5.47μg/g，说明采用本发明方法制备的13c标记的cry蛋白纯度较高。当前第1页12