一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法。
背景技术：
：呼吸道感染(respiratorytractinfection，rti)是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。上呼吸道感染分为病毒性(70-80％)、细菌性(占20-25％)。急性上呼吸道感染：以急性鼻咽炎为主要表现的普通感冒、急性鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、咽炎、会厌炎等。急性下呼吸道感染：急性气管支气管炎、细支气管炎、肺炎，其中肺炎是5岁以下儿童死亡的最主要原因。急性下呼吸道感染为气管、支气管、肺组织发生的急性感染，包括急性气管、支气管炎和肺炎等，多发于寒冷季节，常由上呼吸道感染、鼻炎、流行性感冒(流感)等病毒或细菌向下蔓延而引起。好发于住院患者、小儿及机体免疫力低下者。目前临床病原菌检测主要依靠传统细菌培养和血清学检测相关抗体的方法，但由于操作方法繁琐，获得结果周期较长，每次只能鉴定一种病原体，且阳性检出率低，仅有30％～40％，因此建立一种高效、敏感、快速、准确的病原学检测方法，对临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。本发明提供一种能同时检测11种常见下呼吸道感染的细菌量子点基因芯片，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点。技术实现要素：本发明的目的是在于针对常见的下呼吸道细菌感染引起的气管炎、支气管炎及肺炎，开发出一种能同时检测11种呼下吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法，为临床诊断提供实验室依据，预防社区或院内感染。为解决上述的问题，本发明采用以下技术方案：一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，包括反应液、阳性对照品、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜及偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01n-1.5n的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01n-1.5n盐酸溶液；所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒，所述的阴性对照品包括人基因组dna；所述的反应液包含以下检测引物：引物mcf：gtaggttataccgaaggtgc，即seqidno:1；引物mcr：attcaccgcaaagtttacattc，即seqidno:2；引物tuf：gaagaattgcttgaattggt，即seqidno:3；引物tur：ccacggtcgatacgtcctga，即seqidno:4；引物fkyf：acctgcggttggatcacc，即seqidno:5；引物ygr：ccatcgtagttatctctcta，即seqidno:6；引物fkr：gaagatgagttttgagataca，即seqidno:7；引物ecf：gtctgcaattgccaccactg，即seqidno:8；引物ecr：aagtcgcatccgtttgttgc，即seqidno:9；引物23sf：cacggtggatgccywggc，即seqidno:10；引物23sr：gtttgagattttgagagactc，即seqidno:11；引物icf：tatggttgggataaggctgg，即seqidno:12；引物icr：cgagcttagtgatacttgtg，即seqidno:13；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的捕获探针包含：探针mcp:gcttggtgtgagacacacc，即seqidno:14；探针hnp：attacaggtcgtggtacagtc，即seqidno:15；探针flp：tcagcacttaaagctcttgaag，即seqidno:16；探针fkp:agtgctcacacagattgtct，即seqidno:17；探针ygp：gctcaggtggttagagcgc，即seqidno:18；探针sap：tagcatatcagaaggcacacc，即seqidno:19；探针bmp：atgtatactttgtatacgtg，即seqidno:20；探针tlp：gtgtcacgtaagtgacgcg，即seqidno:21；探针smyp：tcgcgcagtaaagggtgat，即seqidno:22；探针lgp：ggaagcacaatcaaagagg，即seqidno:23；探针ecp：ggtcattagcgccactcactgca，即seqidno:24；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：icp：tttgctaatcatgttcatacc，即seqidno:25；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链dna，所述寡核苷酸单链dna的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链dna与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodt(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodt(n)中n为1～30的整数。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodt(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodt(n)中n为1～30的整数。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。优选的，上述的用于用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点为cdse/zns核壳量子点。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒(将序列seqidno:26进行t克隆进入pgmet载体即可)。所述的肺炎克雷伯菌dna片段序列为(seqidno:26)：actcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctccttaccttaaagaacctgcctttgtagtgctcacacagattgtctgatgaaagtaaagaagcaaggcgtcttgcgattgagacttcagtgtccccttcgtctagaggcccaggacaccgccctttcacggcggtaacaggggttcgaatcccctaggggacgccacttgctggttcgtgagtgaaagacgcgtgccgatgtatctcaaaactcatcttcgggtgatgtttgagatatttgctctttaaaaatctggatcaagctgaaaattgaaacgacacactgtttaagtgtgttcgagtctctcaaattttcgcaatcagaagtgaaacatcttcgggttgtgaggttaagcgactaagcgtacacggtggatgccctggcagtcagaggcgatgaaggacgtgctaatctgcgaa优选的，上述的用于同时检测24种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述反应液组分的含量为(每人份)：10*buffer2.5ul，20mmdn(u)tp0.25ul，2u/uludg0.5ul，10μm核苷酸序列如seqidno：1-13所示的引物各0.75μl，5u/ulhotstarttaq0.25ul，h2o补足到21ul。优选的，上述的用于同时检测11种下呼吸道呼病原菌量子点核酸检测检测方法，其特征在于，适用临床样本种类：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本等。其具体的检测步骤如下：1)每份待检样本反应体系为21ul反应液及核酸样本4ul；2)置于实时荧光pcr仪中进行pcr扩增检测；3)实时荧光pcr扩增程序设置如下：首先阶段1：50℃处理2min，阶段2：95℃处理3min，阶段3：95℃15s，56℃30-60s，72℃30s，进行45个循环。优选的，上述的用于同时检测11种下呼吸道呼病原菌量子点核酸检测检测方法，所检测的呼吸道病原菌为：金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌。与现有技术相比，本发明有如下特点：1)使用本发明试剂盒比现有的显色法基因芯片检测步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低(光源要求低)，并且现有的荧光基因芯片的载体为玻璃，其制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。2)本发明提供一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法，同时检测金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌，避免由于抗生素的滥用，同时对混合感染或者是早期临床表现不明显患者早期诊断提供依据。3)本发明同时采用一个独立竞争性内标从提取到扩增全程监控，防止每个反应管假阴性。4)本发明用于同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的检测可以使用简单的紫外成像仪器进荧光-信号的检测，最大程度地避免人为判读导致的误差。6)检测灵敏度为500copies/ml。附图说明图1为反应液扩增各个病原菌灵敏度检测结果。图2为痰液临床样本检测结果。具体实施方式本发明最关键的构思在于：利用量子点材料的光学特性及基因芯片特性建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的量子点核酸检测呼吸道病原菌的检测试剂盒，可同时检测常见的11种下呼吸道感染病原菌。本发明的11种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒检测谱为：金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌。实施案例1：本发明用于呼吸道病原菌的量子点核酸检测的试剂盒制备和使用一、量子点核酸检测原理：将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。捕获探针为寡核苷酸单链dna3’端或5’端标记有氨基，且氨基与寡核苷酸单链dna间有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodt(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodt(n)中n为1～30的整数。检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50um)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(cdse/zns)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm。所述量子点的尺寸1-200nm。所核酸扩增产物为5’端带有生物素标记，具体为核酸扩增的一条引物5’端被修饰有生物素标记，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodt(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodt(n)中n为1～30的整数。核酸扩增方法为聚合酶链式反应(如pcr等)、恒温扩增(如tma/rpa/lamp等)。量子点核酸检测流程：1)首先使用若干对引物进行核酸扩增，并且某一基因扩增的一对引物中其中一条引物5’端修饰有生物素，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodt(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodt(n)中n为1～30的整数。2)核酸扩增后，将产物进行核酸变性处理，所述核酸变性方法为碱变性。3)将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至一定温度(40-55度)的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*ssc与0.1％sds。4)杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至一定温度(40-55度)的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*ssc与0.1％sds。5)洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入到一定温度的孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述温度为20-37度，所述孵育液为2*ssc与0.1％sds中加入浓度为0.01nm-5nmsa-qd量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。6)孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*ssc与0.1％sds。7)洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。二、11种呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒引物及探针的设计根据genbank数据库中金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌公开的基因组序列，进行核酸序列比对，筛选保守区域用primerpremier5.0设计检测探针及引物，所有扩增引物的tm值尽可能相近；通过大量的试验测试筛选(单重扩增及多重组合扩增)灵敏度满足要求的引物。检测引物相关序列如下：引物mcf：gtaggttataccgaaggtgc(seqidno:1)引物mcr：attcaccgcaaagtttacattc(seqidno:2)引物tuf：gaagaattgcttgaattggt(seqidno:3)引物tur：ccacggtcgatacgtcctga(seqidno:4)引物fkyf：acctgcggttggatcacc(seqidno:5)引物ygr：ccatcgtagttatctctcta(seqidno:6)引物fkr：gaagatgagttttgagataca(seqidno:7)引物ecf：gtctgcaattgccaccactg(seqidno:8)引物ecr：aagtcgcatccgtttgttgc(seqidno:9)引物23sf：cacggtggatgccywggc(seqidno:10)引物23sr：gtttgagattttgagagactc(seqidno:11)引物icf：tatggttgggataaggctgg(seqidno:12)引物icr：cgagcttagtgatacttgtg(seqidno:13)每条反向引物均被修饰有生物素标记，并且生物素与寡核苷酸链间有oligodt5。三、扩增反应液体系的确认通过大量的多重组合测试及体系优化测试，确定各个反应液体系的组成，具体情况如下：反应液的反应体系(1人份)如表1：表110p/ul引物seqidno：1-130.75ul10*buffer2.5ul20mmdn(u)tp0.25ul2u/uludg0.5ul5u/ulhotstarttaq0.25ulh2oupto21ul每个扩增体系加入4ul提取的dna模板，总体积25ul。四、反应程序确定经过大量的试验测试，本扩增程序能有效使各个反应体系中的引物最大程度得到有效扩增，并且使各个病原体检测灵敏度达到500copies/ml。具体程序如下表2：表2五、捕获探针的设计在生物信息学网站ncbi数据库中查询并下载各个病原菌的核酸序列，经blast比对找出各个靶标特异性最高的区域，同时兼顾各个捕获探针能在同一杂交温度进行杂交测试设计探针，并经过大量的灵敏度试验测试及特异性测试，确定各个病原菌特异基因的探针序列，具体序列及编号如下：探针mcp:gcttggtgtgagacacacc(seqidno:14)探针hnp：attacaggtcgtggtacagtc(seqidno:15)探针flp：tcagcacttaaagctcttgaag(seqidno:16)探针fkp:agtgctcacacagattgtct(seqidno:17)探针ygp：gctcaggtggttagagcgc(seqidno:18)探针sap：tagcatatcagaaggcacacc(seqidno:19)探针bmp：atgtatactttgtatacgtg(seqidno:20)探针tlp：gtgtcacgtaagtgacgcg(seqidno:21)探针smyp：tcgcgcagtaaagggtgat(seqidno:22)探针lgp：ggaagcacaatcaaagagg(seqidno:23)探针ecp：ggtcattagcgccactcactgca(seqidno:24)探针icp：tttgctaatcatgttcatacc(seqidno:25)其中icp探针为扩增体系的内控探针，用于监控样本核酸提取及扩增反应出现的假阴性。所述的各条探针的5’端标记有氨基，并且氨基与寡核苷酸链间有oligodt5。六、膜条的制备每条捕获探针由引物合成单位进行合成，然后采用稀释液稀释成所需的浓度，再通过氨基与羧基的缩合反应固定在尼龙膜上，制备成检测膜条。检测膜条的布局图如下表3：表3膜条上位点对应的病原菌如表4：表4七、杂交条件的确定pcr扩增完成后，将扩增产物进行碱变性处理，然后进行杂交、洗涤、孵育、洗涤、荧光检测。在杂交步骤中，杂交温度对结果的判读有着很大的影响，杂交温度过低，会出现非特异捕获导致假阳性，杂交温度过高，会出现目的产物与捕获探针的结合率下降，最终到时灵敏度下降而导致误判阴性。后续的洗涤温度、孵育时间的长短、孵育液中sa-qd的浓度也会有对结果同样的影响。杂交：将变性后的pcr产物与检测膜条加入到预先孵育至48度的1ml杂交液中，48度轻摇杂交1.5h。同时将1ml洗涤液进行预热至48度。所述的杂交液为2*ssc与0.1％sds。所述的洗涤液为0.5*ssc与0.1％sds。洗涤：取出检测膜条，转移至预先预热至48度的洗涤液中，轻摇洗涤5min。孵育：按照1ml杂交液加入浓度为1umsa-qd配制孵育液。将检测膜条转移至孵育液中室温孵育轻摇30min。洗涤：取出检测膜条，转移至洗涤液中，室温轻摇洗涤5min。实施例2本发明用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒的性能检测：1、灵敏度检测按照实施例1中的反应体系分别按照21ul进行分装，并且向每个反应体系加入4ul的基因组dna，浓度为5000copies/ml，500copies/ml。pcr扩增程序按照实施例1中所述的程序进行pcr扩增，具体如下：量子点基因芯片检测流程按照实施例1中的试剂盒使用流程进行相关检测。检测结果参见图1。从荧光检测结果显示该试剂盒的检测靶标灵敏度均能达到500copies/ml。2、特异性检测使用杭州千基生物科技有限公司生产的循环游离核酸提取试剂盒提取化脓链球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌群、肺炎链球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、产酸克雷伯菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌核酸进行试剂盒特异性检测。扩增体系按照实施例1中进行配制，同时按照如下程序进行pcr扩增：量子点基因芯片检测流程按照实施例1中的试剂盒使用流程进行相关检测。结果显示只有相应检测点位点有荧光信号，说明捕获探针的特异性满足要求。实施案例3：痰液临床样本检测按照临床微生物样本采集规范采集疑似下呼吸道感染的痰液样本24例，并采用杭州千基生物科技有限公司生产的循环游离核酸提取试剂盒进行核酸的提取，然后使用实施例1种的反应体系进行核酸样本检测，具体扩增流程及检测流程参照实施例1。具体检测结果如下：注：nd标识为检测到相关病原菌。实施例检测样本同时采用一代测序进行分析，所有实施例检测结果与测序结果一致。序列表<110>杭州千基生物科技有限公司杭州博芯生物技术有限公司<120>一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法<160>26<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtaggttataccgaaggtgc20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2attcaccgcaaagtttacattc22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaagaattgcttgaattggt20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccacggtcgatacgtcctga20<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acctgcggttggatcacc18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ccatcgtagttatctctcta20<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaagatgagttttgagataca21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtctgcaattgccaccactg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aagtcgcatccgtttgttgc20<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cacggtggatgccywggc18<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gtttgagattttgagagactc21<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tatggttgggataaggctgg20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cgagcttagtgatacttgtg20<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gcttggtgtgagacacacc19<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15attacaggtcgtggtacagtc21<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tcagcacttaaagctcttgaag22<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17agtgctcacacagattgtct20<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gctcaggtggttagagcgc19<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19tagcatatcagaaggcacacc21<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20atgtatactttgtatacgtg20<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gtgtcacgtaagtgacgcg19<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22tcgcgcagtaaagggtgat19<210>23<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23ggaagcacaatcaaagagg19<210>24<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24ggtcattagcgccactcactgca23<210>25<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25tttgctaatcatgttcatacc21<210>26<211>639<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26actcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatac60gttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtag120gtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgt180aacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctccttaccttaaagaacctgcc240tttgtagtgctcacacagattgtctgatgaaagtaaagaagcaaggcgtcttgcgattga300gacttcagtgtccccttcgtctagaggcccaggacaccgccctttcacggcggtaacagg360ggttcgaatcccctaggggacgccacttgctggttcgtgagtgaaagacgcgtgccgatg420tatctcaaaactcatcttcgggtgatgtttgagatatttgctctttaaaaatctggatca480agctgaaaattgaaacgacacactgtttaagtgtgttcgagtctctcaaattttcgcaat540cagaagtgaaacatcttcgggttgtgaggttaagcgactaagcgtacacggtggatgccc600tggcagtcagaggcgatgaaggacgtgctaatctgcgaa639当前第1页12