本发明涉及法医学技术领域，更具体地，涉及一种用于无创产前亲权关系判定的微单倍型遗传标记组合及方法。
背景技术：
目前，产前的胎儿遗传诊断主要基于有创取样，包括绒毛膜绒毛取样(chorionicvillussampling，cvs)和羊水穿刺(amniocentesis)，这些诊断方法虽然准确率高，但其操作有创伤性，可导致宫内感染、流产和死胎等多种妊娠不良反应，且其取样时间均不可早于10周。1997年在孕妇血浆中游离胎儿dna(cffdna，fetalcell-freedna)的发现，使无创产前检测成为可能，对避免有创取样带来的风险，有效保障母胎健康有重要的意义。
在法医遗传学研究中，研究者一直致力于利用孕妇血浆cffdna进行产前亲权关系的分析，以实现无创父权鉴定。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是第三代dna遗传标记，与传统法医遗传学标记短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)相比，具有分布广泛、突变率低、扩增片段短等特点。近年来，越来越多的研究者开始采用多种snp分型技术开展无创产前亲权判定的研究。然而，作为一种二态性的遗传标记，snp多态性不高，往往需要多达上千个snp才能有较好的鉴定效能，低浓度的早孕期cffdna往往由于检测系统效能不足而未能得到明确的结果，甚至影响鉴定结论的准确性。在这种情况下，如无限制的增加遗传标记的数量，大量的遗传标记之间将不可避免地存在连锁不平衡现象，进一步增加数据分析的难度。因此，亟需找寻一种可针对低浓度的早孕期cffdna进行无创父权鉴定的遗传标记物。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于无创产前亲权关系判定的微单倍型遗传标记组合。
本发明的另一目的在于提供利用所述微单倍型遗传标记组合进行无创产前亲权关系判定的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一组用于无创产前亲权关系判定的微单倍型遗传标记组合，包括60个微单倍型位点，所述60个微单倍型位点的信息如表1所示。
微单倍型是2013年由kiddk教授在墨尔本第24届国际法医遗传大会上首次提出，是指在一定长度的dna片段内，包含2个以上snps位点，并构成单倍型多态性的dna片段。作为一种新型的遗传标记，微单倍型既具有接近甚至超过str的多态性程度，也保留了snp片段长度短、突变率低、基因组内分布广泛、不产生stutter伪峰、等位基因长度一致且杂合子扩增较均衡等优势，在法医降解检材、混合dna检验、复杂亲缘关系鉴定及生物地理学祖先推断等方面都有很大应用前景。由于微单倍型是2个以上snp位点的线性组合，因此其分型必须以单链分析为基础。目前还未见有用于无创产前亲权关系判定的微单倍型遗传标记。本发明开发了一组可针对低浓度的早孕期cffdna进行亲权关系检测分析的微单倍型遗传标记组合，以实现无创产前亲权关系判定，可避免有创取样带来的风险，有效保障母胎健康。本发明发现，所述微单倍型遗传标记组合需要满足以下的基本条件：(1)位于常染色体上；(2)符合hardy-weinberg平衡定律(p＜0.001)；(3)组成微单倍型的snps≥3个，且位点内的snp最小等位基因频率>0.05；(4)单倍型数目不少于4个，且至少有3个单倍型频率>0.1；(5)目标片段长度小于150bp，利于片段化的游离胎儿dna检。
本发明还请求保护所述微单倍型遗传标记组合在进行无创产前亲权关系判定中的应用。
本发明还请求保护用于检测所述60个微单倍型遗传标记组合的引物，或可以获取微单倍型遗传标记组合目标片段信息的捕获探针。所述的引物或者捕获探针可以根据表1给出的微单倍型遗传标记组合的序列信息，利用本领域常规的引物或探针设计方法设计得到。
近年来，基于单链测序原理的下一代测序技术的成熟化为单倍型高通量分型提供了完美的解决方案。新一代测序(next-generationsequencing，ngs)技术，又称大规模平行测序(massivelyparallelsequencing，mps)技术，是传统测序技术基础上的一次革命性的改变，可一次对几百万条甚至更多的dna分子进行单分子平行测序；结合标签技术，能以理想的覆盖深度同时对多个样本进行测序分析，大大提高测序效率。但是，基于微单倍型测序进行无创产前亲权关系判定也未见相关报道。
因此，本发明还提供一种利用微单倍型测序进行无创产前亲权关系判定的方法，包括如下步骤：
s1.提取孕妇和被控父基因组dna及该孕妇血浆游离dna样本；
s2.针对上述所述的60个微单倍型位点，设计目标区域捕获探针；
s3.利用目标区域捕获探针，构建dna样本于60个微单倍型位点区域的高通量测序文库；
s4.高通量测序；
s5.基于测序数据，获得父、母基因组和母血浆的微单倍型分型；
s6.建立数学模型，进行结果判断：
s61.建立两个检验假设：
原告假设(hp)：被控父(af)是胎儿的生物学父亲；
被告假设(hd)：某随机男子(rm)是胎儿的生物学父亲；
s62.计算在原告假设下，未知胎儿(u)为各种可能基因型的概率，用p(gaf,gm,gu|hp)来表示；
s63.计算在被告假设下，未知胎儿为各种可能基因型的概率，用p(gaf,gm,gu|hd)来表示；
s64.计算当未知胎儿为各种可能基因型，且在特定的胎儿等位基因丢失率d和非特异等位基因插入率c下，母血浆游离dna(p)出现当前分型(x)的概率，用p(gp＝x|gm,gu,d,c)来表示；
s65.使用以下公式计算每个位点的父权指数pi值：
s66.计算总的cpi值，假设各微单倍型位点之间处于连锁平衡
cpi＝∏i＝1pii
s67.判断父权：当cpi>10000时，支持被控父为胎儿的生物学父亲；当cpi<0.0001时，不支持被控父为胎儿的生物学父亲。
所述父权指数pi值即为亲权指数(paternityindex，pi)，是亲权关系鉴定中中判断遗传证据强度的指标。它是两个条件概率的似然比例：pi＝概率(检测到当事人的遗传表型|假设被检测男子是孩子的生物学父亲)/概率(检测到当事人的遗传表型|假设一个随机男子是孩子的生物学父亲)。
优选地，所述孕妇和被控父基因组dna为血细胞基因组dna。
优选地，所述微单倍型分型为根据微单倍型位点上等位基因的snp组合和覆盖深度统计结果，分析微单倍型分型。
优选地，对于分析母血浆cfdna样本时，需要过滤掉母血浆cfdna中非母成分中的测序噪音，以保留胎儿的生父基因。
本发明还提供一种用于无创产前亲权关系判定的产品，其包含检测上述60个微单倍型位点的扩增引物，或获取该60个微单倍型遗传标记组合目标片段信息的捕获探针。
优选地，所示产品还包括用于孕妇和被控父基因组dna提取试剂盒、文库构建试剂盒和/或测序试剂盒。
优选地，所述产品为试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组用于无创产前亲权关系判定的微单倍型遗传标记组合，结合illumina高通量测序技术进行双胎妊娠产前亲权关系的判定。本方法只需提供母亲外周血10ml，在母亲外周血浆中提取的游离dna已经包含了胎儿的游离dna，所以母亲和胎儿只需要一份样品即可。由于只需抽取孕妇的静脉血，操作简便，因此不会对孕妇和胎儿造成创伤，且孕7周后即可鉴定，检测结果与常规str分型方法一致，实现了无创产前亲权关系判定，具有较大的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
利用微单倍型测序进行无创产前亲权关系判定的方法的建立，包括如下步骤：
1、筛选符合条件的微单倍型位点：本发明在人类基因组中试图筛选出可用于进行无创产前亲权关系判定的微单倍型，筛选标准如下：
(1)位于常染色体上；
(2)符合hardy-weinberg平衡定律(p＜0.001)；
(3)组成微单倍型的snps≥3个，且位点内的snp最小等位基因频率>0.05；
(4)单倍型数目不少于4个，且至少有3个单倍型频率>0.1；
(5)目标片段长度小于150bp，利于片段化的游离胎儿dna检测；最终通过创造性劳动，筛选得到表1所示的60个微单倍型位点；
表1
2、探针设计与合成：按照安捷伦公司的suredesignplatform(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/index.htm)客户定制序列捕获芯片的要求，以每个微单倍型及包括其上下游约10bp的序列作为目标区域(regionofinterest，roi)(表1)并转换成bed格式文件上传至suredesignplatform进行线上探针设计。设计好的探针由安捷伦公司合成。
3、样品的采集和dna提取：在穿刺前抽取孕妇外周血5ml，存放于edta抗凝管内，8h内在4℃条件下，以1600g离心10min后，上清部分再以16000g离心10min收获母血浆；沉淀血细胞部分10000g离心5min，吸弃残余上清部分。同时收集被控父外周血1ml，收获血细胞。使用qiaampminikit(qiagen)提取父、母血细胞基因组dna(gdna)；使用mapurecirculatingdnaisolationkit(magen)提取母血浆游离dna(cfdna)。采用qubit2.0定量平台测定提取dna的浓度；采用安捷伦2100生物分析仪检测提取的游离dna片段长度分布情况。
4、文库构建
(1)在1.5ml的lobind管内将3μg的高质量gdna用1×的lowtebuffer稀释到130μl。
(2)使用covarise-series或s-series将稀释后的基因组dna打碎，打碎后的dna片段长度在150bp-200bp之间。由于血浆cfdna本身为片段化游离片段，因此不需要打碎。
(3)使用agilentngsworkstation进行末端修复，加a后与接头连接。
(4)加入pre-capturepcrmastermix，扩增文库。
(5)使用ampurexpbeads纯化扩增后的dna文库。
(6)使用agilent2100bioanalyzer与applied
(7)将捕获探针与文库杂交，然后捕获杂交后的文库。
(8)捕获后的文库加上index，然后用agencourtampurexpbeads进行纯化。
(9)文库检测：使用agilent2100bioanalyzer与applied
5、高通量测序：将获得的每个合格文库稀释到2nm，将多个文库混合在illuminahiseq2000测序仪上进行双向测序，读长为150bp。
6、数据预处理：经过质控过滤，除去不可靠读序(reads)后产生可信读序(cleanreads)。
7、序列比对：通过bwa比对软件包(burrows-wheeleralignermulti-visionsoftwarepackage)和mem(maximumentropy)算法，将上步预处理后的序列与人类基因组序列(hg19)进行比对。(可用其他比对软件，参考基因组也可用其他版本)。
8、初步数据分析：根据比对结果及微单倍型中各snp位点的位置，统计被检测gdna和cfdna样本中每个微单倍型位点上等位基因的snp组合和覆盖深度(depth)
9、对单一的父母血细胞gdna样本进行微单倍型分型：根据微单倍型位点上等位基因的snp组合和覆盖深度统计结果，分析微单倍型分型。例如某微单倍型位点检测到aag和gaa两种序列，当aag_depth/(aag_depth+gaa_depth)或gaa_depth/(aag_depth+gaa_depth)的比值大于0.90时，判为aag/aag或gaa/gaa纯合子；当aag_depth/(aag_depth+gaa_depth)或gaa_depth/(aag_depth+gaa_depth)的比值小于0.8且大于0.2时，判为aag/gaa杂合子。其他为未分型位点。
10、分析母血浆cfdna样本中的生母成分和非母成分：一般认为母血浆cfdna中的生母成分约占90％左右或以上，为cfdna的主要组分；非母成分为cfdna的次要组分，可能来源于测序噪音或胎儿的生父基因。为过滤一部分测序噪音，我们以1.0％为阈值，选择组分比例高于1.0％的非母成分进行下一步的分析。
11、建立数学模型计算父权指数pi值和cpi值。
(1)建立两个检验假设：
原告假设(hp)：被控父(af)是胎儿的生物学父亲；
被告假设(hd)：某随机男子(rm)是胎儿的生物学父亲；
计算在原告假设下，未知胎儿(u)为各种可能基因型的概率，用p(gaf,gm,gu|hp)来表示；
计算在被告假设下，未知胎儿为各种可能基因型的概率，用p(gaf,gm,gu|hd)来表示；
计算当未知胎儿为各种可能基因型，且在特定的胎儿等位基因丢失率d和非特异等位基因插入率c下，母血浆游离dna(p)出现当前分型(x)的概率，用p(gp＝x|gm,gu,d,c)来表示；
(2)根据似然比法，pi的公式为：
(3)以不同被控父、生母、血浆dna的分型组合为例，举例说明p(gaf,gm,gu|hp)、p(gaf,gm,gu|hd)、p(gp＝x|gm,gu,d,c)以及pi值的计算方法(1～4代表某微单倍型位点上的四个等位基因，为化简公式用数字代替snp组合，p1～p4代表等位基因1～4在人群中的频率)；示例结果如表2-1～2-6所示。
表2-1生母(m)：1/2，被控父(af)：1/3，血浆(p)：1/2/3时，相关参数的计算表
表2-2m＝1/2，af＝1/3，p＝1/2/3/4时，相关参数的计算表
表2-3m＝1/2，af＝1/3，p＝1/2时，相关参数的计算表
表2-4m＝1/2，af＝1/3，p＝1/2/4时，相关参数的计算表
表2-5m＝1/2，af＝3/3，p＝1/2时，相关参数的计算表
表2-6m＝1/2，af＝3/3，p＝1/2/4时，相关参数的计算表
12、在各微单倍型位点之间处于连锁平衡的假设下，计算总的cpi值
cpi＝∏i＝1pii
13、判断父权：当cpi>10000时，支持被控父为胎儿的生物学父亲；当cpi<0.0001时，不支持被控父为胎儿的生物学父亲。
应用例1
利用实施例1建立的方法，以下列具体案例来对本发明做进一步的说明。
(1)检材信息，如表3所示。
表3相关检材信息
(2)采用dna提取试剂盒提取样本dna，包括1号样本的cfdna，以及2～4号样本的白细胞gdna。
(3)针对60个筛选出来的微单倍型位点(表1)，使用定制的目标区域捕获探针和建库试剂盒进行dna文库构建；使用测序试剂盒进行上机测序，得到样本数据，然后进行样本分析。
(4)将上步获得的原始数据进行预处理，即进行质控过滤，产生可信读序(cleanreads)。将过滤后的序列用bwa比对软件比对到参考序列人类基因组hg19。
(5)通过python脚本确定微单倍型分型，统计等位基因的覆盖深度(depthofcoverage，doc；单位：reads)。1～3号样本获得微单倍型分型见表4。
表4被控父(af)黄先生、生母(m)黄小姐、母血浆(p)在各位微单倍型位点的分型和在不同d值下的lr值(c＝0.05)
粗体：母血浆分型中的非母组分(比例≥1.0％)
(6)建立检验假设。
(7)使用公式(1)，根据各位单倍型位点在中国人群中的等位基因频率(http://phase3browser.1000genomes.org/)(表5)，分别计算每个位点在d值取0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50时pi值并计算总的cpi值(表4)。
表5微单倍型位点的等位基因频率
(8)由于被控父黄先生与黄小姐胎儿之间的cpi在所选择的11个不同d值中均大于10000，支持李先生是黄小姐所怀胎儿生物学父亲的假设。
(9)利用常规str分型，对2～4号样本进行有创胎儿父权鉴定，根据cpi结果，支持李先生是黄小姐所怀胎儿生物学父亲。与上述无创父权鉴定结果一致。
上述结果表明，本发明建立的基于微单倍型测序进行无创产前亲权关系判定方法是可行的，只需抽取孕妇的静脉血，操作简便，不会对孕妇和胎儿造成创伤，且检测结果与常规str分型方法一致，实现了无创产前亲权关系判定，具有较大的应用前景。
上述仅为本发明的一个具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。