与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用。

背景技术：

育种过程中最重要的环节之一就是目标性状的选择，选择目标性状的过程其实就是选择基因型的过程。然而在常规育种过程中，育种家通常都是根据肉眼观察到的表型来进行选择，很难获知后代的基因型，且耗时较长、选择效率低下。随着分子生物学的飞速发展，利用分子标记辅助选择结合常规杂交育种来进行新品种选育已得到广泛应用。分子标记辅助选择具有准确、快速、不受环境干扰的优点，可以快速检测到与目标性状基因紧密连锁的基因或位点，进而选择出目标性状，大大缩短育种进程。

花椰菜属于十字花科芸薹属(brassica)甘蓝类蔬菜，由于其营养丰富、质地柔嫩、味道鲜美，深受广大消费者的喜爱，近年来栽培面积和消费量迅速增长，目前花椰菜已成为国内外蔬菜市场的主要蔬菜种类之一。随着生活水平的提高，人们对高营养、高品质蔬菜的需求逐渐提高，对品种类型也要求多样化。受表皮蜡质的影响，甘蓝类作物的茎、叶等地上部组织表现为绿色、深绿色或灰绿色等，蜡缺失突变体是由正常材料突变而来，其茎、叶等组织表皮覆盖蜡质极少，表现为有光泽的亮绿色，商品性好。此外前人还报道蜡质缺失突变体叶片薄，脆嫩，口感更好，可生食，vc含量高，食用品质佳。所以在育种过程中得到蜡质缺失的花椰菜材料具有十分重要的意义。

本发明的发明人在生产实践的过程中发现1份花椰菜蜡质缺失的突变体材料cagl-1，通过表型来看，其叶片、茎、荚等器官表面缺乏蜡质，表现为油绿，同时其表现为湿度敏感不育：常规条件下高度不育，高湿(＞80％)度条件下育性恢复，类似于拟南芥cer1、cer3、cer6等蜡质缺失突变体，可用于培育商品性较好的花椰菜芽菜品种，或用于基于雄性不育的杂交制种体系。

开发与花椰菜蜡质相关的分子标记，可以为利用分子标记辅助选择培育蜡质缺失的花椰菜新品种提供有效支撑，同时大大缩短育种进程并提高选择的准确性，为蜡质缺失花椰菜分子育种奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与花椰菜蜡质相关的分子标记，该标记特异性强、稳定性好，能够快速有效地鉴定有/无蜡质材料。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种与花椰菜蜡质相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为gactc，其存在于蜡质正常花椰菜8号染色体，与蜡质正常/缺失紧密连锁。

上述分子标记的pcr引物为：

上游引物cagl1-f：5’-gacgtacctgggaagaccaa-3’，

下游引物cagl1-r：5’-agtaactcgacgggatcagc-3’。

本发明还公开了上述分子标记在分子标记辅助育种中的应用以及在鉴定花椰菜蜡质是否缺失中的应用。

当花椰菜基因型为gactc/gactc时，其为蜡质正常的纯合株；当花椰菜基因型为-/-时，其为蜡质缺失的纯合株；当花椰菜基因型为gactc/-时，其为蜡质正常的杂合株。

其中鉴定花椰菜蜡质是否缺失的方法，具体为：

(1)取待测花椰菜叶片组织，提取基因组dna，稀释至约40ng/μl；

(2)以步骤⑴所获得的基因组dna为模板，利用引物对cagl1-f、cagl1-r进行pcr反应，获得pcr产物；

(3)使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测获得的pcr产物，使用快速银染法检测产物是包含gactc/gactc还是gactc/-还是-/-；

如果能扩增出如seqidno.1所示的160bp的特征条带，则所检测材料为纯合的蜡质正常花椰菜；如果能扩增出如seqidno.2所示的155bp的特征条带，则所检测材料为纯合的蜡质缺失花椰菜。

并且在试验中还发现，表型为蜡质正常花椰菜材料，还存在上述两个特征条带的情况，所以还存在，如果既能扩增出如seqidno.1所示的160bp的特征条带也能扩增出如seqidno.2所示的155bp的特征条带，则所述材料为杂合的蜡质正常花椰菜。

上述方法中，所述pcr反应的体系为：pcr反应总体积为20μl，其中10μmol/l的上下游引物各1.0μl，北京全式金生物pcrsupermixforpage(货号as112-11)10μl，40ng/μl的模板dna4μl，ddh2o4μl。

上述方法中，所述pcr反应的条件为：所述pcr反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

上述方法中，所述8％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法为：按每块胶加入6ml40％acr-bis、3ml10×tbe、21mlddh2o、250μl、10％aps、25μltemed；将配好的胶混匀，从凹槽处小心灌入玻璃板，插好梳子；聚丙烯酰胺凝胶凝固后，装入电泳槽，用夹子固定；向电泳槽中加入0.5×tbe缓冲液，将梳子拔出；用微量移液枪将pcr样本加入点样孔；插上电源，在160v条件下电泳70分钟。

上述方法中，所述银染方法为：将胶放入固定液中，固定液包含450ml蒸馏水、50ml无水乙醇和2.5ml冰醋酸，摇床上摇晃12min；倒掉固定液，在500ml蒸馏水中加入1gagno3混匀，银染12min；倒掉银染液，加入500ml蒸馏水清洗30s,重复清洗1次；倒掉蒸馏水，加入显色液，包含500ml蒸馏水、7.5gnaoh和1.5ml甲醛，显色8min。

上述方法或pcr标记检测应用中，所述花椰菜包括如下品种中的任一种：

cagl-1、c-8、shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8、优松60、津松75、津品56、津品70。

另外，包含所述的分子标记引物对的试剂盒也落入本发明的保护范围之内。

本发明具有如下优点：

本发明开发了用于蜡质有无花椰菜辅助筛选的pcr引物，具有共显性、特异性强、稳定性好等优点，在58℃不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测花椰菜材料是否表现为蜡质缺失。采用本发明的引物cagl1-f/cagl1-r进行蜡质缺失花椰菜的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系，并且与田间表型吻合率达到100％。

本发明可以用于蜡质缺失花椰菜辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测花椰菜的基因组dna，采用引物cagl1-f/cagl1-r进行pcr反应，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr产物特征条带的长短，即可判断出待测植株中是否为蜡质缺失花椰菜。

利用本发明提供的pcr标记进行花椰菜蜡质有无的筛选，操作简单易行，能大大缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1表示在不同花椰菜自交系中引物的扩增情况，其中，m：dnamarker；cagl-1，蜡质缺失花椰菜突变体；wt，野生型亲本c-8；花椰菜ca1-ca15：蜡质正常花椰菜材料，分别为：shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8、优松60、津松75、津品56、津品70。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。

一、本发明所选用的材料如下：

花椰菜材料：cagl-1、c-8、shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8、优松60、津松75、津品56、津品70。其中优松60、津松75、津品56、津品70为公知公用品种；shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8记载于文献：张小丽,单晓政,顾宏辉,等.甘蓝类蔬菜品种(系)苗期根肿病抗性鉴定,植物保护,2019,doi:10.16688/j.zwbh.2019366；自交系c-8记载于文献：sund,wangc,zhangx,etal.draftgenomesequenceofcauliflower(brassicaoleraceal.var.botrytis)providesnewinsightsintothecgenomeinbrassicaspecies.horticultureresearch,2019,6:82；cagl-1是在自交系c-8中发现的突变体材料，保存在天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所。

以上生物材料在申请人单位的实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。

二、开发用于花椰菜蜡质缺失材料辅助筛选的标记及其特异性引物：

本发明的发明人基于bsa-seq对控制蜡质的基因进行了初步定位，利用蜡质正常花椰菜材料jhc-5和蜡质缺失花椰菜材料cagl-1，作为亲本，构建了f2群体，取群体中蜡质正常单株30株，提取高质量dna，等量混合，构建ngl池；取群体中蜡质缺失单株30株，提取高质量dna，等量混合，构建gl池。对这两个池进行重测序：委托北京诺禾致源科技股份有限公司建库，并在hiseq2500平台上测序，各获得了约15gb的双端reads，经过滤矫正后，将其比对到“hdem”参考基因组上，所述“hdem”全基因组序列记载于网址(http://www.genoscope.cns.fr/projet_bkl/cgi-bin/gbrowse/boleracea/)中。筛选出的合适的变异位点，在两个池中分析并计算每个位点的snp-index，绘制snp-index图；计算f池和s池在每个位点的δ(snp-index)，以1mb长度为一个窗口，计算平均δ(snp-index)，绘制δ(snp-index)图，选取99％置信水平的阈值，找到候选区间为8号染色体49.5mb至染色体末端约1.5mb的区间。

对区间内的核苷酸变异进行分析，找到一个合适的插入缺失gactc，根据该indel变异及其上下游序列，使用primer5.0软件设计如下引物：上游引物cagl1-f：5’-gacgtacctgggaagaccaa-3’；下游引物cagl1-r：5’-agtaactcgacgggatcagc-3’。

利用该引物对待测样本进行pcr扩增，结果发现，纯合的蜡质正常花椰菜样品的pcr产物只有160bp条带；纯合的蜡质缺失花椰菜样品的pcr产物只有155bp条带；杂合的蜡质正常花椰菜pcr产物有160bp和155bp两个条带。

三、本发明所述pcr引物筛选蜡质正常/缺失花椰菜的准确性验证

步骤1、提取基因组dna

用ctab(十六烷基三乙基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide)法提取花椰菜cagl-1、c-8、shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8、优松60、津松75、津品56、津品70基因组dna。

dna提取方法参见murraymg,thompsonwf(1980)rapidisolationofhighmolecularweightplantdna.nucleicacidsres8:4321-4325。

步骤2、鉴定引物cagl1-f/cagl1-r在花椰菜材料中的扩增情况

为鉴定引物在花椰菜中的扩增情况，选取了蜡质缺失材料cagl-1、蜡质正常材料c-8、shc-1、shc-2、shc-3、shc-4、shc-5、shc-6、shc-7、shc-8、jhc-1、jhc-2、jhc-3、jhc-4、jhc-5、jhc-6、jhc-7、jhc-8、优松60、津松75、津品56、津品70。以步骤1得到的基因组dna为模板，按照下列反应体系和反应程序进行pcr反应。pcr反应总体积为20μl，其中10μmol/l的上下游引物各1.0μl，北京全式金生物pcrsupermixforpage(货号as112-12)10μl，40ng/μl的模板dna4μl，ddh2o4μl。所述pcr反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，具体为：按每块胶加入6ml40％acr-bis、3ml10×tbe、21mlddh2o、250μl、10％aps、25μltemed；将配好的胶混匀，从凹槽处小心灌入玻璃板，插好梳子；聚丙烯酰胺凝胶凝固后，装入电泳槽，用夹子固定；向电泳槽中加入0.5×tbe缓冲液，将梳子拔出；用微量移液枪将pcr样本加入点样孔；插上电源，在160v条件下电泳70分钟。

电泳完成后，银染步骤为：将胶放入固定液中，固定液包含450ml蒸馏水、50ml无水乙醇和2.5ml冰醋酸，摇床上摇晃12min；倒掉固定液，在500ml蒸馏水中加入1gagno3混匀，银染12min；倒掉银染液，加入500ml蒸馏水清洗30s,重复清洗1次；倒掉蒸馏水，加入显色液，包含500ml蒸馏水、7.5gnaoh和1.5ml甲醛，显色8min。

结果如图1所示：将引物cagl1-f/cagl1-r用于花椰菜材料扩增时，有蜡质材料都出现160bp的特征条带，而蜡质缺失材料出现155bp的特征条带。

上述实验数据表明，本发明提供的引物cagl1-f/cagl1-r能够准确鉴定蜡质正常/蜡质缺失花椰菜。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>天津科润农业科技股份有限公司

<120>与花椰菜蜡质相关的分子标记及应用

<130>2020

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>160

<212>dna

<213>brassicaoleracea

<400>1

gacgtacctgggaagaccaaatcatcttacacactctccttatgtacctcgcaacatgaa60

gctcccagactcacacaccttcccctatatatatggagactagaaggagccagcctcatg120

gctcattggctctgcttcacgctgatcccgtcgagttact160

<210>2

<211>155

<212>dna

<213>gacgtacctgggaagaccaaatcatcttacacactctccttatgtacctcgcaacatgaagctcccagactcacacaccttcccctatatatatggagactagaaggagccagcctcatggctcattggctctgcttcacgctgatcccgtcgagttact

<400>2

gacgtacctgggaagaccaaatcatcttacacactctccttatgtacctcgcaacatgaa60

gctcccaacacaccttcccctatatatatggagactagaaggagccagcctcatggctca120

ttggctctgcttcacgctgatcccgtcgagttact155