一种运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法与流程

本发明属于发酵技术领域，涉及一种运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法。

背景技术：

生物胺是一类较为特殊且具有生物活性的有机物质，由微生物分泌的氨基酸脱羧酶催化氨基酸脱羧形成。当其适量存在于人体内时，可有效的促进生理代谢，但在人体内过量积累时，则会引发一系列诸如头痛、痉挛、恶心呕吐等中毒症状，严重时甚至会危及生命。它们广泛存在于食品，尤其是蛋白质含量较高的发酵食品中，常见的如发酵香肠，鱼制品，肉制品，乳制品及发酵酒类等。

鱼制品在加工、运输及贮藏期间易受微生物污染，从而导致生物胺积累。大量研究表明，鱼制品中的生物胺主要由摩根氏菌属、肠杆菌属和发光细菌产生，其中摩根氏菌属是主要的产组胺细菌，常见的包括morganellamorganii和morganellapsychrotolerans，发光细菌在一些鱼制品中产组胺，肠杆菌属是主要的产尸胺与腐胺细菌。因此，抑制产生物胺细菌的生长，能有效降低鱼制品中的生物胺含量，提高产品安全性。

栅栏因子理论认为，有效提高食品安全性，则在食品加工过程中其内部必须存在能够抑制微生物生长繁殖的因素，通过多个因素之间相互作用以保证食品质量，这些因素统称为栅栏因子。然而，目前通过不同栅栏因子组合的形式抑制产胺菌积累生物胺的实施例鲜有报道，运用栅栏技术，协同降低鱼制品生物胺含量的方法也未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，将产胺菌与植物乳杆菌同时接种于含有20～40g/l氯化钠的无菌液体培养基中共同培养；其中，所述产胺菌为摩氏摩根氏菌(morganellamorganii)或霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei)，所述产胺菌和植物乳杆菌的菌落数添加比例为1:1～1:2。

2019100254208的发明专利申请《一株植物乳杆菌及其在降低鱼茶生物胺含量中的应用》记载了一种植物乳杆菌yc-2；本发明涉及的植物乳杆菌可选用该菌体。

优选方式下，所述运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，包括步骤：

将液体培养基中加入氯化钠，所述氯化钠的添加量为20～40g/l，灭菌，得添加氯化钠的无菌液体培养基；向所述添加氯化钠的无菌液体培养基中加入浓度为10⁷～10⁸cfu/ml的植物乳杆菌菌悬液和浓度为10⁷～10⁸cfu/ml的产胺菌菌悬液，混合均匀，培养；其中，所述产胺菌菌悬液和植物乳杆菌菌悬液总菌落数的添加比例为1:1～1:2；所述添加氯化钠的无菌液体培养基、植物乳杆菌菌悬液和产胺菌菌悬液的体积比为8:1:1～7:2:1；所述产胺菌为摩氏摩根氏菌(morganellamorganii)或霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei)；所述液体培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，吡哆醛-5’-磷酸0.05g/l，苯丙氨酸1g/l，组氨酸1g/l，精氨酸1g/l，鸟氨酸1g/l，赖氨酸1g/l，色氨酸1g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水。

优选方式下，所述培养的温度为20～30℃、时间36～48h；

所述产胺菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的产胺菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁷cfu/ml～10⁸cfu/ml，所述产胺菌为摩氏摩根氏菌(morganellamorganii)或霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei)；所述生物胺显色培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉5g/l，nacl5g/l，碳酸钙1g/l，琼脂20g/l，溴甲酚紫0.06g/l，苯丙氨酸10g/l，组氨酸10g/l，精氨酸10g/l，鸟氨酸10g/l，赖氨酸10g/l，色氨酸10g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水；所述液体培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，吡哆醛-5’-磷酸0.05g/l，苯丙氨酸1g/l，组氨酸1g/l，精氨酸1g/l，鸟氨酸1g/l，赖氨酸1g/l，色氨酸1g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水。

所述植物乳杆菌菌悬液的制备方法如下：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃培养18h，用无菌mrs肉汤培养基稀释至10⁷cfu/ml～10⁸cfu/ml。

优选方式下，运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，包括步骤：

取液体培养基，添加nacl至浓度为40g/l，121℃、15min灭菌，得添加氯化钠的无菌液体培养基；向所述添加氯化钠的无菌液体培养基中加入10⁷cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁷cfu/ml的摩氏摩根氏菌菌悬液，混合均匀，30℃培养48h；所述加氯化钠的无菌液体培养基、植物乳杆菌yc-2菌悬液和摩氏摩根氏菌菌悬液的体积比为8:1:1；

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；

所述摩氏摩根氏菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的摩氏摩根氏菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁷cfu/ml；

所述生物胺显色培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉5g/l，nacl5g/l，碳酸钙1g/l，琼脂20g/l，溴甲酚紫0.06g/l，苯丙氨酸10g/l，组氨酸10g/l，精氨酸10g/l，鸟氨酸10g/l，赖氨酸10g/l，色氨酸10g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水；

所述液体培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，吡哆醛-5’-磷酸0.05g/l，苯丙氨酸1g/l，组氨酸1g/l，精氨酸1g/l，鸟氨酸1g/l，赖氨酸1g/l，色氨酸1g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水。

优选方式下，运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，包括步骤：

取液体培养基，加入nacl至浓度为20g/l，121℃、15min灭菌，得添加氯化钠的无菌液体培养基；向所述添加氯化钠的无菌液体培养基中加入10⁸cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁸cfu/ml的霍氏肠杆菌菌悬液，混合均匀，30℃培养48h；所述添加氯化钠的无菌液体培养基、植物乳杆菌yc-2菌悬液和霍氏肠杆菌菌悬液的体积比为8:1:1；

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁸cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；

所述霍氏肠杆菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的霍氏肠杆菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁸cfu/ml；

所述生物胺显色培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉5g/l，nacl5g/l，碳酸钙1g/l，琼脂20g/l，溴甲酚紫0.06g/l，苯丙氨酸10g/l，组氨酸10g/l，精氨酸10g/l，鸟氨酸10g/l，赖氨酸10g/l，色氨酸10g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水；

所述液体培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，吡哆醛-5’-磷酸0.05g/l，苯丙氨酸1g/l，组氨酸1g/l，精氨酸1g/l，鸟氨酸1g/l，赖氨酸1g/l，色氨酸1g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水。

其中，所述mrs琼脂培养基为培养乳酸菌专用，购于青岛海博生物技术有限公司；所述mrs肉汤培养基为培养乳酸菌专用，购于青岛海博生物技术有限公司。

空白对照组为：无菌液体培养基中不添加植物乳杆菌菌悬液及氯化钠，单独接种10⁷cfu/ml～10⁸cfu/ml的摩氏摩根氏菌菌悬液或霍氏肠杆菌菌悬液，混合均匀，30℃培养48h；

含有氯化钠的无菌液体培养基的制备：将氯化钠按照20g/l～40g/l的比例添加至液体培养基中，121℃、15min灭菌备用。

无菌液体培养基是将液体培养基121℃、15min灭菌所得。

生物胺含量测定方法：30℃培养48h后离心收集培养液，通过超高效液相色谱质谱联用仪测定生物胺含量。

本发明的有益效果是：与对照组相比，运用栅栏因子技术能够显著降低两株产胺菌的生物胺积累，其中摩氏摩根氏菌的组胺抑制率达到91.9％，总生物胺抑制率为95.6％；霍氏肠杆菌的总生物胺抑制率为75.3％，显著高于单一栅栏因子的抑制效果。

附图说明

图1是盐度及植物乳杆菌发酵剂组合对摩氏摩根氏菌积累生物胺的影响；

图2是盐度及植物乳杆菌发酵剂组合对摩氏摩根氏菌积累组胺的影响；

图3是盐度及植物乳杆菌发酵剂组合对霍氏肠杆菌积累生物胺的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

下述各例中所述mrs琼脂培养基为培养乳酸菌专用，购于青岛海博生物技术有限公司，商品号为hb0384；所述mrs肉汤培养基为培养乳酸菌专用，购于青岛海博生物技术有限公司，商品号为hb0384-1。

2019100254208的发明专利申请《一株植物乳杆菌及其在降低鱼茶生物胺含量中的应用》记载了一种植物乳杆菌yc-2，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称cgmcc，保藏号cgmccno.16616；下述实施例所述植物乳杆菌选用该菌体。

下述各例所述液体培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖1g/l，吡哆醛-5’-磷酸0.05g/l，苯丙氨酸1g/l，组氨酸1g/l，精氨酸1g/l，鸟氨酸1g/l，赖氨酸1g/l，色氨酸1g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水；所述生物胺显色培养基成分为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉5g/l，nacl5g/l，碳酸钙1g/l，琼脂20g/l，溴甲酚紫0.06g/l，苯丙氨酸10g/l，组氨酸10g/l，精氨酸10g/l，鸟氨酸10g/l，赖氨酸10g/l，色氨酸10g/l，酪氨酸0.4g/l，ph5.5，余量为水。

实施例1

运用栅栏技术抑制产胺菌积累生物胺的方法，即利用盐度及植物乳杆菌发酵剂组合抑制摩氏摩根氏菌积累生物胺的方法，具体步骤为：

取液体培养基，加入nacl至浓度为40g/l，121℃、15min灭菌，得添加氯化钠的无菌液体培养基；取0.8ml添加有40g/l氯化钠的无菌液体培养基，加入0.1ml10⁷cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁷cfu/ml的摩氏摩根氏菌菌悬液0.1ml，混合均匀，30℃培养48h后离心收集培养液a；

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；所述摩氏摩根氏菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的摩氏摩根氏菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁷cfu/ml；

同时，作为对照，在0.9ml无菌液体培养基中单独接种0.1ml10⁷cfu/ml的摩氏摩根氏菌菌悬液，混合均匀，30℃培养48h后离心收集培养液b；

利用超高效液相色谱质谱联用仪分别测定培养液a和培养液b中的生物胺含量，结果如图1所示。

本实施例还可以包括溶液配制、培养基配制及灭菌等其他前处理步骤。

实施例2

运用栅栏技术抑制中产胺菌积累生物胺的方法，即利用盐度及植物乳杆菌发酵剂组合抑制霍氏肠杆菌积累生物胺的方法，具体步骤为：

取液体培养基，加入nacl至浓度为20g/l，121℃、15min灭菌，得添加氯化钠的无菌液体培养基；取0.8ml添加有20g/l氯化钠的无菌液体培养基，加入0.1ml10⁸cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁸cfu/ml的霍氏肠杆菌菌悬液0.1ml，混合均匀，30℃培养48h，离心收集培养液c；

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁸cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；所述霍氏肠杆菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的霍氏肠杆菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁸cfu/ml；

同时，作为对照，在0.9ml无菌液体培养基中单独接种0.1ml10⁸cfu/ml的霍氏肠杆菌菌悬液，混合均匀，30℃培养48h，离心收集培养液d；

利用超高效液相色谱质谱联用仪测定培养液c和培养液d的生物胺含量，结果如图3所示。

本实施例还可以包括溶液配制、培养基配制及灭菌等其他前处理步骤。

对比例1

取0.8ml无菌液体培养基，加入0.1ml10⁷cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁷cfu/ml摩氏摩根氏菌菌悬液0.1ml，混合均匀后，30℃培养48h，离心收集培养液，测定生物胺含量，结果如图1所示。

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；所述摩氏摩根氏菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的摩氏摩根氏菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁷cfu/ml。

对比例2

取0.9ml添加40g/l氯化钠的无菌液体培养基，加入浓度为10⁷cfu/ml摩氏摩根氏菌菌悬液0.1ml，混合均匀后，30℃培养48h，离心收集培养液，测定生物胺含量，结果如图1所示。

所述摩氏摩根氏菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的摩氏摩根氏菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁷cfu/ml。

对比例3

取0.8ml无菌液体培养基，加入0.1ml10⁸cfu/ml的植物乳杆菌yc-2菌悬液和浓度为10⁸cfu/ml霍氏肠杆菌菌悬液0.1ml，混合均匀后，30℃培养48h,离心收集培养液，测定生物胺含量，结果如图3所示。

其中，所述植物乳杆菌yc-2菌悬液的制备方法为：从mrs琼脂培养基上挑取活化的植物乳杆菌yc-2接种至无菌mrs肉汤培养基，置于37℃有氧培养18h，用mrs肉汤培养基稀释至10⁸cfu/ml，得植物乳杆菌yc-2菌悬液；所述霍氏肠杆菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的霍氏肠杆菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁸cfu/ml。

对比例4

取0.9ml添加20g/l氯化钠的无菌液体培养基，加入浓度为10⁸cfu/ml霍氏肠杆菌菌悬液0.1ml，混合均匀后，30℃培养48h,离心收集培养液，测定生物胺含量，结果如图3所示。

所述霍氏肠杆菌菌悬液的制备方法为：从生物胺显色培养基上挑取活化的霍氏肠杆菌菌株接种至无菌液体培养基中，置于30℃培养18h，用无菌液体培养基稀释至10⁸cfu/ml。

图1、图2结果表明，本发明实施例1采用盐度与植物乳杆菌发酵剂组合的方式能够对摩氏摩根氏菌的生物胺积累起到一定的抑制作用。与对照组相比生物胺含量显著降低，总抑制率为95.6％，其中组胺的抑制率达到91.9％，尸胺，腐胺与苯乙胺的含量也呈下降趋势；对比例1植物乳杆菌组的生物胺抑制率为86.6％；对比例2盐度组的生物胺抑制率为63.9％，说明采用栅栏技术能有效降低生物胺的积累，抑制效果高于单一栅栏因素。

图3结果表明，实施例2添加20g/l盐度及植物乳杆菌发酵剂均能够对霍氏肠杆菌的生长起到一定的抑制作用，与对照组相比栅栏组合中生物胺含量受到显著抑制，总抑制率为75.3％；对比例3植物乳杆菌组的生物胺抑制率为39.9％；对比例4盐度组的生物胺抑制率为47.4％，说明采用栅栏技术能有效降低产胺菌的生物胺积累，且抑制效果显著高于单一栅栏因素。

以上所述内容，仅对本发明的目的、效果进行进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。