本发明属于生物
技术领域：
中病毒的分子生物学检测方法，特别是涉及新型冠状病毒2019-ncov的环介导等温扩增检测专用引物组，及该引物组在检测新型冠状病毒2019-ncov中的应用。
背景技术：
：目前，世界卫生组织及国家推荐的方法是通过荧光定量rt-qpcr或者是基因测序的方法检测病毒的基因。测序方法由于检测速度慢、成本高，仅适用于科学研究，不适合作为筛查手段。而荧光定量rt-qpcr在一定程度上提高了疫情检测确诊的准确性，但需要配套专业设备、人员及实验室，无法应用于基层；检测时间较长，不利于疫情的早期防控；而且在扩增中产生的气溶胶具有传染性，存在感染风险。因此，研发速度快且准、操作简单的2019-ncov检测方法和产品，为基层密切接触者、疑似病例的快速筛查和处置提供方法和手段已迫在眉睫。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是2000年notomi等在pcr技术上发展起来的一种新型的恒温核酸扩增技术，其扩增不需要热循环即可在一个恒定温度下进行，相对其他方法可在非常低的检测限检测dna。此方法比传统pcr扩增更为高效，且基因扩增和检测可同时进行，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，无需使用大型或高价仪器，适用于实验室快速筛查检测，并可在基层实验室推广应用。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种新型冠状病毒2019-ncov的环介导等温扩增检测专用引物组。根据新型冠状病毒2019-ncov的orf1ab基因设计环介导等温扩增引物，利用lamp技术扩增基因的特定区域，从分子水平上实现新型冠状病毒2019-ncov的快速检测，为新型冠状病毒2019-ncov检测提供了有效且快速的筛查方法。本发明的另一目的在于提供新型冠状病毒2019-ncov环介导等温扩增检测专用引物组的应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测新型冠状病毒2019-ncov的lamp引物组，包括一对内引物和一对外引物；各引物核苷酸序列如下所示：内引物fip：gttggacaacaccatcaactttctttcacattaattggagaagccg；内引物bip：tacaagaatttaaacccaggagtcattcaatgaattcatccatagct；外引物f3：gtaggtcccaaacaagct；外引物b3：gcatagccttctaatttataccg。本发明还提供上述lamp引物组在检测新型冠状病毒2019-ncov中的应用。优选地，将上述引物组用于新型冠状病毒2019-ncov的lamp检测中，检测方法包括以下步骤：(1)提取待检样品的rna，所述待检样品可为咽拭子、肺泡液等；(2)将样品rna进行反转录反应，得到cdna，-20℃备用；(3)lamp扩增：采用25μl反应体系：内引物fip(20μmol/l)和内引物bip(20μmol/l)各2μl，外引物f3(20μmol/l)和外引物b3(20μmol/l)各0.25μl，10×buffer反应缓冲液2.5μl，100mmol/lmgso41.5μl，25mmol/ldntps0.5μl，bstdna聚合酶0.08μl，cdna模板1μl，用无核酸酶水补齐至25μl；加入适量密封液，将配制好的反应液于65℃扩增60min。(4)检测结果判定，采用下述三种方式之一：a.发生扩增反应时，从dntps析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：反应管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；b.每25μl体系的反应管中加入1μl1000×sybrgreeni，混匀后肉眼观察反应液的颜色：若呈现绿色则为阳性，橙色则为阴性；c.取扩增产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示lamp特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)灵敏度高、特异性好，能够检测到至少102拷贝的新型冠状病毒2019-ncov；(2)操作简单、快速高效，只需将待测样品和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中60min即可判断结果，非常适用于2019-ncov的现场快速检测；(3)不需要特殊试剂与设备，检测成本低；(4)结果判定简单，直接通过肉眼观察即可得出结果。使用本发明的引物或检测方法，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到新型冠状病毒2019-ncov，不需要复杂仪器，为新型冠状病毒2019-ncov的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测新型冠状病毒2019-ncov，适于大范围推广应用。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。实施例1：lamp引物的设计以新型冠状病毒2019-ncov的orf1ab基因作为靶基因，采用lamp引物设计软件primerexplorer4.0设计特异性引物，序列如下：内引物fip：gttggacaacaccatcaactttctttcacattaattggagaagccg；内引物bip：tacaagaatttaaacccaggagtcattcaatgaattcatccatagct；外引物f3：gtaggtcccaaacaagct；外引物b3：gcatagccttctaatttataccg。实施例2：新型冠状病毒2019-ncovlamp检测方法的建立1、提取待检样品的rna利用病毒rna提取试剂盒提取，所述待检样品可为咽拭子、肺泡液等。2、模板cdna的制备将样品rna进行反转录反应，得到cdna，-20℃备用。3、lamp检测方法的建立新型冠状病毒2019-ncovlamp反应体系见表1。表1新型冠状病毒2019-ncovlamp反应体系组分工作液浓度加样量/μl反应体系终浓度内引物fip20μmol/l21.6μmol/l内引物bip20μmol/l21.6μmol/l外引物f320μmol/l0.250.2μmol/l外引物b320μmol/l0.250.2μmol/lbuffer反应缓冲液10×2.51×mgso4100mmol/l1.56mmol/ldntps25mmol/l0.50.5mmol/lbstdna聚合酶8u/μl0.08—cdna模板—1—无核酸酶水—14.92—注：上述10×buffer反应缓冲液含：200mmol/ltris-hcl(ph8.8，25℃)，100mmol/lkcl，100mmol/l(nh4)2so4，20mmol/lmgso4，1％tritonx-100。在上述配制好的反应液上方覆盖适量密封液隔绝污染，所述密封液为灭菌液体石蜡。将25μllamp反应体系配制成反应液后，65℃扩增60min。4、结果判定在步骤3扩增完成后的反应体系中加入1μl1000×sybrgreeni，混匀后肉眼观察反应液的颜色，对检测结果进行判定。显色反应判定：在自然光下肉眼观察显色情况，待检样品呈绿色判为阳性，即检测样品中含有新型冠状病毒2019-ncov；待检样品呈橙色判为阴性，即检测样品中不含新型冠状病毒2019-ncov。实施例3：新型冠状病毒2019-ncovlamp检测方法敏感性试验在反应体系中添加不同拷贝数的模板，采用实施例2建立的lamp检测方法分别对其进行检测，通过显色反应和产物的琼脂糖凝胶电泳结果综合判断。结果显示，当模板拷贝数为102时即可呈现阳性反应，因此该lamp反应体系的灵敏度为102copies/μl。序列表<110>北京勤邦生物技术有限公司贵州安为天检测技术有限公司<120>一种检测新型冠状病毒2019-ncov的lamp引物组及应用<141>2020-04-09<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gttggacaacaccatcaactttctttcacattaattggagaagccg46<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tacaagaatttaaacccaggagtcattcaatgaattcatccatagct47<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtaggtcccaaacaagct18<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcatagccttctaatttataccg23当前第1页12