靶向HLA-A的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途与流程

本发明涉及分子基因
技术领域：
，具体涉及一种靶向hla-a的嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、car-tregs细胞及制备方法、用途。
背景技术：
：我国现存大约有30万实体器官移植受者，其术后有面临排斥反应的巨大风险。现阶段免疫抑制剂的使用虽然可以有效降低排斥风险，提高移植物存活率，但由于其是降低机体整体免疫功能，特异性不高，因此导致肿瘤、感染等发病风险增高。同时，由于免疫抑制剂均具有一定的药物毒性，长期使用容易引发一些慢性疾病，如慢性肾损伤，高尿酸血症等。技术实现要素：有鉴于此，本申请提供一种靶向hla-a的嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、car-tregs细胞及其制备方法、用途，本发明car-tregs细胞为靶向hla-a11或hla-a33的嵌合抗原受体修饰的treg细胞，可抑制特异性免疫反应，可用于实体器官移植术后排斥反应的抑制。为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种靶向hla-a的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合域为抗hla-a11抗体或抗hla-a33抗体的结合结构域。优选的，所述抗hla-a11抗体为靶向hla-a11的单链抗体，其包括串联的hla-a11单链抗体重链vh、hla-a11单链抗体轻链vl；hla-a11单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a11的单链抗体的n端，hla-a11单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a11的单链抗体的c端；hla-a11单链抗体重链vh编码基因如seqidno.1所示的核苷酸序列，hla-a11单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.2所示的核苷酸序列；所述抗hla-a33抗体为靶向hla-a33的单链抗体，其包括串联的hla-a33单链抗体重链vh、hla-a33单链抗体轻链vl；hla-a33单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a33的单链抗体的n端，hla-a33单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a33的单链抗体的c端；hla-a33单链抗体重链vh编码基因如seqidno.3所示的核苷酸序列，hla-a33单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.4所示的核苷酸序列；hla-a11单链抗体重链vh和hla-a11单链抗体轻链vl，hla-a33单链抗体重链vh和hla-a33单链抗体轻链vl均通过连接肽连接。优选的，所述连接肽为本领域常用的连接肽。优选的，所述连接肽编码基因如seqidno.5所示的核苷酸序列。优选的，所述信号肽选自cd8信号肽、cd28信号肽和cd4信号肽中的任意一种；所述铰链区选自cd8α铰链区、igd铰链区、igg1fcch2ch3铰链区、igg4fcch2ch3铰链区和4-1bb铰链区中的一种或多种；所述跨膜区选自cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区、dap10跨膜区和4-1bb跨膜区中的一种或多种；所述共刺激因子选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40和icos中的一种或多种；所述胞内信号传导域为cd28信号传导域或cd3ζ信号传导域。优选的，所述信号肽为cd8信号肽，所述铰链区为cd8α铰链区和4-1bb铰链区，所述跨膜区为cd8跨膜区和4-1bb跨膜区，所述共刺激因子为4-1bb胞内信号域，所述胞内信号传导域为cd3ζ胞内信号域。优选的，从n端到c端，所述嵌合抗原受体依次包括cd8信号肽、抗原结合结构域、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb铰链区、4-1bb跨膜区、4-1bb胞内信号域和cd3ζ信号传导域；所述抗原结合域为抗hla-a11抗体或抗hla-a33抗体的结合结构域。优选的，cd8信号肽编码基因如seqidno.6所示的核苷酸序列；cd8α铰链区如seqidno.7所示的核苷酸序列；cd8跨膜区如seqidno.8所示的核苷酸序列；4-1bb铰链区如seqidno.9所示的核苷酸序列；4-1bb跨膜区如seqidno.10所示的核苷酸序列；4-1bb胞内信号域如seqidno.11所示的核苷酸序列；cd3ζ信号传导域如seqidno.12所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种编码基因，其编码上述的嵌合抗原受体。优选的，所述编码基因的核苷酸序列如seqidno.13或seqidno.14所示。本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述的编码基因。优选的，所述重组表达载体为慢病毒表达质粒。本发明还提供了一种car-tregs细胞，所述的car-tregs细胞是上述的嵌合抗原受体修饰的treg细胞。本发明还提供了一种上述car-tregs细胞的制备方法，包括：所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到treg细胞中表达。优选的，所述制备方法具体包括：(1)靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒表达质粒的构建；(2)靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒的制备；(3)用步骤(2)制备好的靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒转染treg细胞。本发明提供了上述car-tregs细胞在用于制备治疗或预防移植排斥、移植物抗宿主病症的药物中的应用，或在用于制备诱导移植耐受的药物中的应用。优选的，所述移植排斥为急性移植排斥、慢性移植排斥、肝移植排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肺移植排斥。本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本发明提供了一种嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体、car-tregs细胞及制备方法、用途，本发明car-tregs细胞为靶向hla-a11或hla-a33的嵌合抗原受体修饰的treg细胞，treg细胞是一类控制体内免疫反应性的t细胞亚群，其通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的反应性t细胞的活化与增殖，本发明通过基因工程的方法，将普通treg细胞改造成car-tregs细胞，使其具有抑制体内特异性免疫反应的功能。且hla-a基因的位点众多，本发明选择的hla-a11、hla-a33这两个位点用于治疗或预防移植排斥、移植物抗宿主病症，诱导移植耐受。同时，抗体序列设计的差异直接影响car-tregs的结合效果，进一步影响其治疗相关病症的效果，本发明针对hla-a11、hla-a33抗原设计的单链抗体序列，得到的car-tregs的结合效果好。本发明car-tregs可以特异性激活treg细胞，通过treg细胞对t细胞的抑制作用，明显特异性抑制t细胞针对hla-a11、hla-a33抗原刺激引起的活化和增殖反应，可用于实体器官移植术后排斥反应的抑制，提高移植受者生存质量和时间，可用于用于制备治疗或预防移植排斥、移植物抗宿主病症的药物中的应用，或在用于制备诱导移植耐受的药物中的应用。附图说明图1为本发明慢病毒表达质粒结构图；图2为实施例3细胞体外实验结果图；图3为实施例4细胞体外实验结果图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本申请提供的技术方案是一种靶向hla-a的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号传导域；所述抗原结合域为抗hla-a11抗体或抗hla-a33抗体的结合结构域。优选的，所述抗hla-a11抗体为靶向hla-a11的单链抗体，其包括串联的hla-a11单链抗体重链vh、hla-a11单链抗体轻链vl；hla-a11单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a11的单链抗体的n端，hla-a11单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a11的单链抗体的c端；hla-a11单链抗体重链vh编码基因如seqidno.1所示的核苷酸序列，hla-a11单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.2所示的核苷酸序列；所述抗hla-a33抗体为靶向hla-a33的单链抗体，其包括串联的hla-a33单链抗体重链vh、hla-a33单链抗体轻链vl；hla-a33单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a33的单链抗体的n端，hla-a33单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a33的单链抗体的c端；hla-a33单链抗体重链vh编码基因如seqidno.3所示的核苷酸序列，hla-a33单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.4所示的核苷酸序列；hla-a11单链抗体重链vh和hla-a11单链抗体轻链vl，hla-a33单链抗体重链vh和hla-a33单链抗体轻链vl均通过连接肽连接。优选的，所述连接肽为本领域常用的连接肽。优选的，所述连接肽编码基因如seqidno.5所示的核苷酸序列。优选的，所述信号肽选自cd8信号肽、cd28信号肽和cd4信号肽中的任意一种；所述铰链区选自cd8α铰链区、igd铰链区、igg1fcch2ch3铰链区、igg4fcch2ch3铰链区和4-1bb铰链区中的一种或多种；所述跨膜区选自cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区、dap10跨膜区和4-1bb跨膜区中的一种或多种；所述共刺激因子选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40和icos中的一种或多种；所述胞内信号传导域为cd28信号传导域或cd3ζ信号传导域。优选的，所述信号肽为cd8信号肽，所述铰链区为cd8α铰链区和4-1bb铰链区，所述跨膜区为cd8跨膜区和4-1bb跨膜区，所述共刺激因子为4-1bb胞内信号域，所述胞内信号传导域为cd3ζ胞内信号域。优选的，从n端到c端，所述嵌合抗原受体依次包括cd8信号肽、抗原结合结构域、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb铰链区、4-1bb跨膜区、4-1bb胞内信号域和cd3ζ信号传导域；所述抗原结合域为抗hla-a11抗体或抗hla-a33抗体的结合结构域。优选的，cd8信号肽编码基因如seqidno.6所示的核苷酸序列；cd8α铰链区如seqidno.7所示的核苷酸序列；cd8跨膜区如seqidno.8所示的核苷酸序列；4-1bb铰链区如seqidno.9所示的核苷酸序列；4-1bb跨膜区如seqidno.10所示的核苷酸序列；4-1bb胞内信号域如seqidno.11所示的核苷酸序列；cd3ζ信号传导域如seqidno.12所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种编码基因，其编码上述的嵌合抗原受体。优选的，所述编码基因的核苷酸序列如seqidno.13或seqidno.14所示。本发明还提供了一种重组表达载体，包括上述的编码基因。优选的，所述重组表达载体为慢病毒表达质粒。本发明还提供了一种car-tregs细胞，所述的car-tregs细胞是上述的嵌合抗原受体修饰的treg细胞。本发明还提供了一种上述car-tregs细胞的制备方法，包括：所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到treg细胞中表达。优选的，所述制备方法具体包括：(1)靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒表达质粒的构建；(2)靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒的制备；(3)用步骤(2)制备好的靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒转染treg细胞。本发明提供了上述car-tregs细胞在用于制备治疗或预防移植排斥、移植物抗宿主病症的药物中的应用，或在用于制备诱导移植耐受的药物中的应用。优选的，所述移植排斥为急性移植排斥、慢性移植排斥、肝移植排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肺移植排斥。实施例1一、慢病毒表达质粒的构建1、制备嵌合抗原受体的编码基因序列制备cd8信号肽、靶向hla-a11的单链抗体、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb铰链区、4-1bb跨膜区、4-1bb胞内信号域和cd3ζ信号传导域的编码基因；靶向hla-a11的单链抗体包括串联的hla-a11单链抗体重链vh、连接肽、hla-a11单链抗体轻链vl；hla-a11单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a11的单链抗体的n端，hla-a11单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a11的单链抗体的c端；hla-a11单链抗体重链vh编码基因如seqidno.1所示的核苷酸序列，hla-a11单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.2所示的核苷酸序列；所述连接肽编码基因如seqidno.5所示的核苷酸序列；所述cd8信号肽编码基因如seqidno.6所示的核苷酸序列；所述cd8α铰链区编码基因如seqidno.7所示的核苷酸序列；所述cd8跨膜区编码基因如seqidno.8所示的核苷酸序列；所述4-1bb铰链区编码基因如seqidno.9所示的核苷酸序列；所述4-1bb跨膜区编码基因如seqidno.10所示的核苷酸序列；所述4-1bb胞内信号域编码基因如seqidno.11所示的核苷酸序列；所述cd3ζ信号传导域编码基因如seqidno.12所示的核苷酸序列。通过pcr的方法将kozak序列、上述cd8信号肽、靶向hla-a11的单链抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb铰链区、4-1bb跨膜区、4-1bb胞内信号域和cd3ζ信号传导域序列的编码基因序列依次从n端到c端连接到一起，得到靶向hla-a的嵌合抗原受体car-hla-a的编码基因序列，所述car-hla-a的编码基因包括如seqidno：13所示的核苷酸序列。kozak序列如seqidno.15所示的核苷酸序列。2、构建入门克隆pentr-car-hla-aecori和bamhi双酶切car-hla-a的编码基因序列(bamhⅰ酶切位点---kozak序列---cd8αsp----hla-a11vl----linker----hla-a11vh---cd8αhinge---cd8αtm---4-1bbhinge---4-1bbtm---4-1bb胞内信号域---cd3ζ---ecorⅰ酶切位点)，经t4dna连接酶连接插入入门载体pentr载体的bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间(pentr载体为骨架，利用限制性内切酶ecori和bamhi消化去除其上的gus基因)，入门克隆pentr-car-hla-a。将入门克隆转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选转化后的阳性单菌落进行pcr鉴定，然后提取质粒，对入门克隆pentr-car-hla-a进行ecori和bamhi酶切鉴定及序列测定，测序反应鉴定序列正确无误，成功构建入门克隆pentr-car-hla-a。3、利用lr重组反应构建慢病毒表达质粒plenti6/v5-car-hla-a3.1、lr反应(1)入门克隆pentr-car-hla-a与目的载体plenti6.3/v5-dest载体(带gfp荧光蛋白marker)在lrqonasetmuplus酶混合物作用下进行体外重组反应lr重组体系如表1所示，在10～30℃下将表1成分添加到15ml微量离心管中。且设一个单独的反应，但不使用lrclonasetmiiplus酶混合物。表1componentsampleentryclone(50-150ng/reaction)1-7μldestinationvector(150ng/μl)iμltebuffer,ph8.0to8μlentryclone为入门克隆pentr-car-hla-a，destinationvector为目的载体plenti6.3/v5-dest载体,tebuffer为缓冲液.(2)在-20℃以下的温度下取出lrclonasetmiiplus酶混合物，在冰上融化(约2分钟)。(3)将lrclonasetmiiplus酶混合物短暂涡旋两次，每次两次(每次2秒)。(4)在上述样品中，添加lrclonasetmiiplus酶混合物。通过上下移液均匀混合。注意：lrclonasetmuplus酶在使用后立即恢复至-20℃。(5)将反应液在25℃孵育1小时。注意：将孵育时间延长至18小时通常会产生更多的菌落。(6)在加入1μl蛋白酶k溶液至上述反应体系,37℃下孵育10分钟。3.1、lr反应产物的转化步骤(1)在冰上将一管e.coli感受态细胞(invitrogen,cat.no.c7373-03)解冻；(2)加入2-3μllr反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液枪吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min；(3)加入225μl室温下预温的s.o.c.培养基；(4)将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h；(5)取出100μl转化产物均匀涂布到预热的lb平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养箱中孵育过夜。3.2、阳性克隆的筛选得到表达质粒plenti6/v5-car-hla-a(1)用枪头蘸取1个菌落后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打；重复上述步骤，挑取5-10个菌落进行后续pcr验证(2)吸取1μl菌液用于pcr，扩增片段为car-hla-a的编码基因序列长度(3)pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.6kb(car-hla-a的编码基因序列长度)处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的lb培养液中进行扩大培养；(4)用质粒dna纯化试剂盒(promega，cat.no.a7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒dna即为慢病毒表达质粒plenti6/v5-car-hla-a，质粒结构图如图1所示，同时保存菌种。二、靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒(plenti6/v5-car-hla-a慢病毒)的制备1.1、试剂盒：市售试剂盒：thermofisher公司的lv-maxtmlentiviralproductionsystem1.2制备方法：以慢病毒表达质粒plenti6/v5-car-hla-a作为慢病毒表达载体，使用市售试剂盒，按照其说明书操作获得plenti6/v5-car-hla-a慢病毒。三、treg细胞分离1、分选pbmc：将50ml外周血分成5份，每份10ml，小心加入到等体积的淋巴细胞分离液的液面上，注意加血液过程中不要冲破液面，然后用离心机慢升慢降(速率调为1)，2000rpm离心20分钟。吸取pbmc(中间白膜层)到新离心管中，用pbs洗涤2次即可2、从pbmc中分选treg细胞2.1试剂盒：市售试剂盒：美天旎公司的cd4+cd25+cd45ra+regulatorytcellisolationkit；2.2分选方法：pbmc细胞采用美天旎公司的磁珠分选treg细胞，按照人cd4+cd25+cd45ra+调节性t细胞分离试剂盒(美天旎公司的cd4+cd25+cd45ra+regulatorytcellisolationki)说明书内容分选treg细胞。四、靶向hla-a的嵌合抗原受体慢病毒(plenti6.3-car-hla-a慢病毒)转染treg细胞1、采用plenti6/v5-car-hla-a慢病毒转染分离得到的treg细胞得到hla-a11-car-tregs。(1)按照moi＝10计算所需要的病毒量，加入到分离得到的treg细胞中；(2)培养24h后，更换不含病毒的新的细胞培养液，继续培养；(3)在第5-6天，通过荧光显微镜观察(病毒质粒上带有gfp荧光蛋白)来评估感染效率-，感染效率>80％视为合格。以未感染的treg细胞作为阴性对照。实施例2本实施例和实施例1的仅区别在于：采用靶向hla-a33的单链抗体替换靶向hla-a11的单链抗体，最后得到hla-a33-car-tregs。其中，靶向hla-a33的单链抗体包括串联的hla-a33单链抗体重链vh、连接肽、hla-a33单链抗体轻链vl；hla-a33单链抗体重链vh位于所述靶向hla-a33的单链抗体的n端，hla-a33单链抗体轻链vl位于靶向所述hla-a33的单链抗体的c端；hla-a33单链抗体重链vh编码基因如seqidno.3所示的核苷酸序列，hla-a33单链抗体轻链vl编码基因如seqidno.4所示的核苷酸序列；所述连接肽编码基因如seqidno.5所示的核苷酸序列；制备得到的car-hla-a的编码基因如seqidno：14所示的核苷酸序列。实施例3效果验证1.收集人外周血50ml，分离成熟dc细胞和t细胞2、采用市售hla-a11(abcam)抗原，加入到dc细胞培养瓶中，让dc细胞摄食抗原3、进行淋巴细胞混合培养(mlr)实验，分成四组：第一组为t细胞，第二组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞，第三组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞+未转染的正常treg细胞，第四组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞+慢病毒转染后的treg细胞(实施例1得到的hla-a11-car-tregs细胞)4、使用cck8方法(试剂盒)检测t细胞增殖情况5、试验结果见图2，图2横坐标为培养时间，纵坐标为t细胞相对增殖率。其中，第一组和第四组的t细胞没有明显细胞增殖，而第二组的t细胞明显增殖，第三组的t细胞增殖受到一定抑制，培养72h后，第一组、第二组，第三组和第四组的相对平均增殖率为143％，320％，216％，128％，证实慢病毒转染后的treg细胞可以明显特异性抑制t细胞针对hla-a11抗原刺激引起的活化和增殖反应，说明了本发明car-tregs细胞发挥了很好的t细胞活性抑制功能，具有排斥反应的抑制能力。实施例4效果验证1.收集人外周血50ml，分离成熟dc细胞和t细胞2、采用市售hla-a33(abcam)抗原，加入到dc细胞培养瓶中，让dc细胞摄食抗原3、进行淋巴细胞混合培养(mlr)实验，分成三组：第一组为t细胞，第二组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞，第三组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞+未转染的正常treg细胞，第四组为t细胞+摄食抗原后的dc细胞+慢病毒转染后的treg细胞(实施例2得到的hla-a33-car-tregs细胞)4、使用cck8方法(试剂盒)检测t细胞增殖情况5、试验结果见图3，图3横坐标为培养时间，纵坐标为t细胞相对增殖率。其中，第一组和第四组的t细胞没有明显细胞增殖，而第二组的t细胞明显增殖，第三组的t细胞增殖受到一定抑制，培养72h后，第一组、第二组、第三组和第四组的相对平均增殖率为147％，347％，226％，133％，证实慢病毒转染后的treg细胞可以明显特异性抑制t细胞针对hla-a33抗原刺激引起的活化和增殖反应，说明了本发明car-tregs细胞发挥了很好的t细胞活性抑制功能，具有排斥反应的抑制能力。本发明实施例中编码基因的核苷酸序列：表2以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>靶向hla-a的嵌合抗原受体、编码基因、car-tregs细胞及其制备方法、用途<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>276<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gttctcacaccatccagataatgtatggctgcgacgtggggccggacgggcgcttcctcc60gcgggtaccggcaggacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgc120gctcttggaccgcggcggacatggcagctcagatcacccagcgcaagtgggaggcggccc180atgtggcggagcagttgagagcctacctggagggccggtgcgtggagtggctccgcagat240acctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcgcgg276<210>2<211>269<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gctcccactccatgaggtatttctacacctccgtgtcccggcccggccgcggggagcccc60cttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgc120gagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattggga180ccaggagacacggaatgtgaaggcccagtcacagactgaccgagtggacctggggaccct240gcgcggctactacaaccagagcgaggcag269<210>3<211>276<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gttctcacaccatccagatgatgtatggctgcgacgtggggtcggacgggcgcttcctcc60gcgggtaccagcaggacgcctacgacggcaaggattacatcgccttgaacgaggacctgc120gctcttggaccgcggcggacatggcggctcagatcacccagcgcaagtgggaggcggccc180gtgtggcggagcagttgagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtggctccgcagac240acctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacgg276<210>4<211>270<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gctcccactccatgaggtatttcaccacatccgtgtcccggcccggccgcggggagcccc60gcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccg120cgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattggg180accggaacacacggaatgtgaaggcccactcacagattgaccgagtggacctggggaccc240tgcgcggctactacaaccagagcgaggccg270<210>5<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgt57<210>6<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccg63<210>7<211>135<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg60tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg120gacttcgcctgtgat135<210>8<211>72<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatc60actctttactgt72<210>9<211>120<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccatt60atccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc120<210>10<211>81<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtg60gcctttattattttctgggtg81<210>11<211>126<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcag60actactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgc120gaactg126<210>12<211>346<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggcca60gaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaa120gagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaagg180cctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaa240aggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccac300caaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc346<210>13<211>1555<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ccatggtggcgttctcacaccatccagataatgtatggctgcgacgtggggccggacggg60cgcttcctccgcgggtaccggcaggacgcctacgacggcaaggattacatcgccctgaac120gaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcagctcagatcacccagcgcaagtgg180gaggcggcccatgtggcggagcagttgagagcctacctggagggccggtgcgtggagtgg240ctccgcagatacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcgcggatggagtttgggct300gagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgtgctcccactccatgagg360tatttctacacctccgtgtcccggcccggccgcggggagcccccttcatcgccgtgggct420acgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggagc480cgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattgggaccaggagacacggaatg540tgaaggcccagtcacagactgaccgagtggacctggggaccctgcgcggctactacaacc600agagcgaggcagatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctc660cacgccgccaggccgaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatc720gcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtg780cacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatttgggcccctctggctggtact840tgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtgcaattgaagttatgtat900cctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaa960cacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtg1020gttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgg1080gtgaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtg1140cagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggc1200tgcgaactgctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacca1260gcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgt1320tttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccc1380tcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagat1440tgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcag1500tacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc1555<210>14<211>1556<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ccatggtggcgttctcacaccatccagatgatgtatggctgcgacgtggggtcggacggg60cgcttcctccgcgggtaccagcaggacgcctacgacggcaaggattacatcgccttgaac120gaggacctgcgctcttggaccgcggcggacatggcggctcagatcacccagcgcaagtgg180gaggcggcccgtgtggcggagcagttgagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtgg240ctccgcagacacctggagaacgggaaggagacgctgcagcgcacggatggagtttgggct300gagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgtgctcccactccatgagg360tatttcaccacatccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgccgtgggc420tacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgacgccgcgagccagaggatggag480ccgcgggcgccgtggatagagcaggaggggccggagtattgggaccggaacacacggaat540gtgaaggcccactcacagattgaccgagtggacctggggaccctgcgcggctactacaac600cagagcgaggccgatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgct660ccacgccgccaggccgaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccat720cgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagt780gcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatttgggcccctctggctggtac840ttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtgcaattgaagttatgta900tcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaa960acacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggt1020ggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctg1080ggtgaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgt1140gcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcgg1200ctgcgaactgctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacc1260agcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatg1320ttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaacc1380ctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgaga1440ttgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctca1500gtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc1556<210>15<211>10<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ccatggtggc10当前第1页12