硝基咪唑类衍生物及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于药物学、药物化学和药理学领域，更具体而言，涉及一类新型硝基咪唑类化合物，及其制备方法，及将该类化合物用于治疗与结核杆菌引起的感染相关的疾病。


背景技术：

2.结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)感染引起的，是人类最古老的疾病之一，时至今日，结核仍严重危害着人类的健康。根据who的统计，世界约有1/3的人感染过结核杆菌,结核是导致死亡人数最多的感染性疾病(高于hiv)。
3.据世界卫生组织(who)发布的《2019年全球结核病报告》显示，2018年全球新发结核病患者约1000万，患者数量近几年比较稳定。2018年全球估计hiv阴性的结核病死亡数约为120万，另外还有hiv阳性的结核病死亡数约为25.1万。同时，2018年全球估计约有48.4万人为新发的耐利福平结核病(rr-tb)，而这些人中有78％为多重耐药结核病(mdr-tb)。在mdr-tb患者中，有6.2％估计为广泛耐药结核病(xdr-tb)。有三个国家占了全球一半的mdr/rr-tb病例：印度(27％)、中国(14％)和俄罗斯(9％)。
4.目前对于敏感性结核的一线治疗采用利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺四药联合治疗策略，虽然治疗成功率可达85％以上，但治疗周期长达6个月，且治疗副作用大，例如，如利福平和异烟肼联合用药有可能导致严重的肝毒性，乙胺丁醇可导致视神经损害等。部分人群未能得到正规治疗，部分人群则由于治疗不彻底或者治疗不当而发展成为耐药性结核(利福平耐药或多药耐药)。对于耐药性结核，治疗周期更长、治疗副作用更大、而其治疗成功率仅为55％左右。耐药性结核，尤其是多药耐药结核和广泛耐药结核是导致结核病人，特别是免疫缺陷人群病人,如艾滋病和结核病双重感染病人死亡的主要原因。
5.wo9701562公布了许多硝基咪唑类化合物，代表化合物pa-824(pretomanid)，具有全新的作用机制，可用于治疗结核。2019年8月，fda宣布批准由非盈利组织全球结核病药物开发联盟(tb alliance)开发的pretomanid上市，与贝达喹啉(bedaquiline)和利奈唑胺(linezolid)联用，治疗特定高度耐药肺结核(tb)患者。然而，pa-824由于其水溶解性小,生物利用度低,口服给药时需要制成复杂的片剂配方，且需要进一步提高其抗结核活性[bioorg.med.chem.lett,2008,18(7),2256-2262.]。
[0006]
日本大冢制药株式会社(otsuka pharmaceutical co.,ltd)的opc-67683[j.med.chem.,2006,49(26),7854-7860.]，作用机制类似于pa-824，用于治疗结核。该化合物于2014年5月获得欧盟委员会的上市批准，用于成人耐多药肺结核病(mdr-tb)患者的治疗。虽然化合物活性较强，但具有和pa-824同样的问题，该化合物在水中溶解度很小，血浆稳定性差，限制其药代动力学性质，需要每天服用2次。同时pa-824和opc-67683对herg钾电流抑制活性很强，临床产生qt-qtc间期延长的副作用，存在严重的心脏毒性问题。因此该靶点药物还有进一步优化和完善的空间。我们对该靶点药物进行了系统的研究，取得了不错的成果(专利公开号：cn105732659a)，但是代表化合物在进行毒理实验时，pk-pd研究显示代表化合物具有“封顶”现象，难以进一步研究，并且小鼠体内药效没有超过pa-824。
[0007][0008]
pa-824和opc-67683结构式
[0009]
鉴于以上情形，本领域目前仍然迫切需要开发出新型的抗结核药物。这种新型的药物应当具有以下特征：对耐药菌，特别是多药耐药菌有效；与目前使用的一线抗结核药物可以联合用药；具有理想的代谢性质，能够口服给药，并且做到一天一次；安全性比现有药物具有优势。


技术实现要素：

[0010]
本发明旨在提供一类新型的抗结核药物，对耐药菌，特别是多药耐药菌有效；具有理想的代谢性质，能够口服给药，并且做到一天一次；安全性比现有药物具有优势。
[0011]
在本发明的第一方面，提供一种抗结核化合物，其是如式(i)所示的化合物或其光学异构体、或其药学上可接受的盐：
[0012][0013]
式(i)中：m,n表示0-4之间的整数；
[0014]
x为氧或nh；
[0015]
r1选自氢，烷基,环烷基，或环烷基烷基，所述烷基，环烷基，或环烷基烷基是未取代的或任意被一至三个独立选自卤素，烷基的基团取代；
[0016]
r2选自氢，烷基，环烷基，烷氧基，烷硫基，环烷氧基，卤素，氰基，或硝基，所述烷基，环烷基，烷氧基，烷硫基，或环烷氧基是未取代的或任意被一至三个独立选自卤素，烷基，烷氧基的基团取代。
[0017]
在另一方式中，r1为氢或c
1-4
烷基，所述c
1-4
烷基是未取代的或任意被一至三个卤素取代。
[0018]
在另一方式中，r2为c
1-4
烷基，c
1-4
烷氧基，c
1-4
烷硫基，卤素，或氰基，所述c
1-4
烷基，c
1-4
烷氧基，或c
1-4
烷硫基是未取代的或任意被一至三个卤素取代。
[0019]
在另一方式中，所述药学上可接受的盐包括：通式(i)所示的化合物与酸形成的盐；其中，酸包括：无机酸、有机酸或酸性氨基酸；所述无机酸包括：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸；所述有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、对甲基苯磺酸、乙磺酸或苯磺酸；所述酸性氨基酸包括：天冬氨酸或谷氨酸。
[0020]
在另一优选例中，所述化合物为下述式1化合物，式2化合物，式3化合物，式4化合物，式5化合物，式6化合物，式7化合物，式8化合物，式9化合物，式10化合物，式11化合物，式
12化合物，式13化合物，式14化合物，式15化合物，式16化合物，式17化合物，式18化合物，式19化合物，式20化合物，式21化合物，式22化合物，式23化合物，式24化合物，式25化合物，式26化合物，式27化合物，式28化合物，式29化合物，式30化合物，式31化合物，式32化合物，或式33化合物：
[0021]
[0022]
[0023][0024]
在本发明的第二方面，提供一种如上所述本发明提供的抗结核化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
[0025]
(1)结构如式
ⅰ-
5所示的化合物经还原得到结构如式
ⅰ-
6所示的化合物；
[0026]
(2)结构如式
ⅰ-
6所示的化合物经氯化得到结构如式
ⅰ-
7所示的化合物；和
[0027]
(3)将结构如式
ⅰ-
7所示的化合物和结构如式
ⅰ-
8所示的化合物混合，反应得到结构如式ⅰ所示的化合物；
[0028][0029]
m，n，r1和r2的定义如前；x为氧。
[0030]
本发明还一种如上所述本发明提供的抗结核化合物的制备方法，所述方法包括步骤：使结构如式
ⅰ-
5所示的化合物和结构如式
ⅱ-
1所示的化合物混合后，在还原剂存在下反应，得到结构如式ⅰ所示的化合物；
[0031][0032]
m，n，r1和r2的定义如前；x为nh。
[0033]
在另一方式中，通过下述步骤得到结构如式
ⅰ-
5所示的化合物：
[0034]
(a)使结构如式
ⅰ-
3所示的化合物和三正丁基乙烯基锡进行偶联反应，得到结构如式
ⅰ-
4所示的化合物；和
[0035]
(b)使结构如式
ⅰ-
4所示的化合物的双键经氧化切断得到结构如式
ⅰ-
5所示的化合物；
[0036][0037][0038]
在本发明的第三方面，提供一种如上所述的本发明提供的抗结核化合物在制备治
疗与结核杆菌引起的感染相关的疾病的药物中的应用。
[0039]
在另一优选例中，本发明提供的抗结核化合物用于制备治疗多药耐药结核杆菌引起的感染性疾病的药物。
[0040]
在本发明的第四方面，提供一种用于治疗与结核杆菌引起的感染相关的疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的如上所述的本发明提供的抗结核化合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
[0041]
据此，本发明提供一种新型的抗结核药物，对耐药菌，特别是多药耐药菌有效；与目前使用的一线抗结核药物可以联合用药；具有理想的代谢性质，能够口服给药，并且做到一天一次；安全性比现有药物具有优势。
具体实施方式
[0042]
发明人经过广泛的研究，合成筛选了大量化合物，发现式(i)化合物在药代动力学和药效动力学方面都有出人意料的优势，对结核杆菌具有很强的抑制活性，对耐药菌，特别是多药耐药菌有效。在此基础上完成了本发明。
[0043]
本发明提供如式(ⅰ)结构所示的化合物，或或其光学异构体、或其药学上可接受的盐：
[0044][0045]
式(i)中m，n，x，r1和r2的定义如前。
[0046]
本发明的一些代表性化合物及其结构式如下表所列：
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051][0052]
除非有特别说明，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义：
[0053]“烷基”指饱和的脂肪烃基团，包括1至6个碳原子的直链和支链基团。优选含有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
[0054]“环烷基”指3至7元全碳单环脂肪烃基团或环中一个碳原子被氧、硫等杂原子取代，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己烷、环己二烯等。
[0055]“烷氧基”指通过醚氧原子键合到分子其余部分的烷基。代表性的烷氧基为具有1-4个碳原子的烷氧基，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。如本文所用，“烷氧基”包括未取代和取代的烷氧基，尤其是被一个或多个卤素所取代的烷氧基。优选的烷氧基选自och3，ocf3，chf2o，cf3ch2o，ipro，npro，ibuo，cpro，nbuo或tbuo。
[0056]“烷硫基”指通过硫原子键合到分子其余部分的烷基。代表性的烷硫基为具有1-4个碳原子的烷硫基，如甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基和叔丁硫基。如本文所用，“烷硫基”包括未取代和取代的烷硫基，尤其是被一个或多个卤素所取代的烷硫基。优选的烷硫基选自sch3，scf3，chf2s，cf3ch2s，iprs，nprs，ibus，cprs，nbus或tbus。
[0057]“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0058]“化学键”是指纯净物分子内或晶体内相邻两个或多个原子(或离子)间强烈的相互作用力的统称。
[0059]“任意取代”或“取代”指参考基团可以被一个或多个额外基团所取代，额外基团单
独地且独立的选自于，烷基，烷氧基和卤素。
[0060]“0-4之间的整数”是指0，1，2，3，4；“1-4之间的整数”是指1，2，3，4。
[0061]
本发明的化合物至少含有1个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物以及纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明意味着包括这些化合物的所有这种异构形式。
[0062]
本文所用“药学上可接受的盐”是指只要是药学上可以接受的盐就没有特别的限定，包括无机盐和有机盐。具体地可列举本发明化合物与酸形成的盐，适合成盐的酸包括(但不限于)盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、磷酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机酸以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0063]
本发明还提供了上述新型抗结核化合物或其药学上可接受的无机或有机盐的制备方法。
[0064]
下面具体地描述本发明通式(i)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。
[0065]
本发明通式(i)结构化合物可通过如下的方法制得，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
[0066]
本发明的抗结核抗菌化合物的制备方法，其流程可包括：
[0067]
流程1：x＝o时的流程
[0068]
第一步，使结构如式
ⅰ-
5所示的化合物经还原得到结构如式
ⅰ-
6所示的化合物；
[0069]
第二步，使结构如式
ⅰ-
6所示的化合物经氯化得到结构如式
ⅰ-
7所示的化合物；
[0070]
第三步，将结构如式
ⅰ-
7所示的化合物和结构如式
ⅰ-
8所示的化合物混合，反应得到结构如式ⅰ所示的化合物。
[0071]
上述第一步的还原反应可以选择在合适的溶剂中进行，并使用合适的还原剂；所述溶剂包括但不限于，醇类如甲醇、乙醇，醚类如四氢呋喃等；所使用的还原剂包括但不限于，硼氢化钠、硼氢化钾、硼氢化锂和四氢铝锂。
[0072]
上述第二步的氯化反应可以选择在合适的溶剂中进行，并使用合适的氯化试剂；所述溶剂包括但不限于，二氯甲烷，氯仿，甲苯；所使用的氯化试剂包括但不限于，氯化亚砜、三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷。
[0073]
在本发明的一种实施方式中，上述第三步中结构如式
ⅰ-
8所示的化合物先与合适的溶剂混合后置于低温(如-20-0℃)下，然后加入强碱反应一段时间(如：0.5-2h)后，再加入结构如式
ⅰ-
7所示的化合物继续反应；所述合适的溶剂选自二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺(dmac)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、四氢呋喃；所述强碱包括但不限于，氢化钠、氢化钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾。
[0074]
在本发明的一种实施方式中，上述第三步的反应结束后经常规处理分离得到结构如式ⅰ所示的化合物；所述常规处理方式包括但不限于，萃取、洗涤、干燥、浓缩、层析等。
[0075]
在本发明的一种实施方式中，可以经结构如式
ⅰ-
3所示的化合物得到结构如式
ⅰ-
5所示的化合物，过程可以包括步骤：
[0076]
第一步，使结构如式
ⅰ-
3所示的化合物和三正丁基乙烯基锡进行偶联反应，得到结构如式
ⅰ-
4所示的化合物；和
[0077]
第二步，使结构如式
ⅰ-
4所示的化合物的双键经氧化切断得到结构如式
ⅰ-
5所示的化合物。
[0078]
在本发明的一种实施方式中，上述第一步的偶联反应的催化剂包括但不限于，pd(pph3)4、pd(dppf)2cl2、pd2(dba)3；偶联反应的反应溶剂可以包括但不限于，二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺(dmac)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)；偶联反应可以在50-120℃之间进行。
[0079]
在本发明的一种实施方式中，上述第二步的氧化切断可使用的氧化剂包括但不限于，高碘酸钠、高碘酸钾；可作为催化剂的包括但不限于，锇酸钾、三氯化钌；所述氧化切断合适的溶剂包括但不限于，二氧六环和水的混合溶剂，合适的温度可以在0-50℃。
[0080]
在本发明的一种实施方式中，所述流程1可包括下述步骤：
[0081]
第一步，使结构如式
ⅰ-
3所示的化合物和三正丁基乙烯基锡进行偶联反应，得到结构如式
ⅰ-
4所示的化合物；
[0082]
第二步，使结构如式
ⅰ-
4所示的化合物的双键经氧化切断得到结构如式
ⅰ-
5所示的化合物；
[0083]
第三步，使结构如式
ⅰ-
5所示的化合物经还原得到结构如式
ⅰ-
6所示的化合物；
[0084]
第四步，使结构如式
ⅰ-
6所示的化合物经氯化得到结构如式
ⅰ-
7所示的化合物；
[0085]
第五步，将结构如式
ⅰ-
7所示的化合物和结构如式
ⅰ-
8所示的化合物混合，反应得到结构如式ⅰ所示的化合物。
[0086]
本发明以5-溴-2-氯嘧啶为起始原料，可以通过两条途径得到上述第一步中的结构如式
ⅰ-
3所示的化合物：
[0087]
一种途径是使5-溴-2-氯嘧啶和伯胺类化合物溶解在溶剂(例如但不限于，正丁醇、正丙醇、异丁醇)中，以合适的碱(例如但不限于，n，n-二异丙基乙胺(dipea)、三乙胺)做缚酸剂，在一定温度下(如：80-120℃)进行取代反应得到结构如式
ⅰ-
1所示的化合物；结构如式
ⅰ-
1所示的化合物先与合适的溶剂混合后置于低温(如-20-0℃)下，然后加入强碱反应一段时间(如：0.5-2h)后，再加入碘代物或溴代物继续反应得到结构如式
ⅰ-
3所示的化合物；所述合适的溶剂选自二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺(dmac)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)；所述强碱包括但不限于，氢化钠、氢化钾、lda、nahmds、lihmds。
[0088]
另一种途径是使5-溴-2-氯嘧啶和伯胺类化合物溶解在溶剂(例如但不限于，乙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇)中在一定温度下(如：80-100℃)进行取代反应得到结构如式
ⅰ-
2所示的化合物；结构如式
ⅰ-
2所示的化合物和卤代芳基在铜(例如但不限于，碘化亚铜、溴化亚铜)做催化剂，氨基酸(例如但不限于，l-脯氨酸、二甲基乙二胺、n,n
’-
二甲基-1,2-环己二胺)做配体的条件下发生偶联反应也可以得到结构如式
ⅰ-
3所示的化合物。
[0089]
在本发明的一种实施方式中，所述流程1可按下述反应式及其相关描述进行：
[0090][0091]
r1、r2、m、n和本文中式(ⅰ)定义的相同，其中r1不等于氢。
[0092]
(1)起始原料5-溴-2-氯嘧啶和伯胺类化合物溶解在溶剂(例如：正丁醇)中，以合适的碱(例如：dipea)做缚酸剂，在一定温度下(例如：80-120℃)进行取代反应得到中间体
ⅰ-
1；
[0093]
(2)中间体i-1在合适的溶剂(例如：dmf或dmac)，在低温(-20-0℃)加入强碱(例如：氢化钠)后反应一定的时间(例如：0.5-2h)，然后加入碘代物或溴代物，反应完毕后处理分离得到中间体i-3；
[0094]
(3)起始原料5-溴-2-氯嘧啶和伯胺类化合物溶解在溶剂(例如：乙醇)中在一定温度下(例如：80-100℃)进行取代反应得到中间体
ⅰ-
2。中间体
ⅰ-
2和卤代芳基在铜(例如：碘化亚铜)做催化剂，氨基酸(例如：l-脯氨酸)做配体的条件下发生偶联反应也可以得到中间体
ⅰ-
3；
[0095]
(4)中间体
ⅰ-
3和三正丁基乙烯基锡在钯催化剂(例如：pd(pph3)4)下在合适的溶剂(例如：dmf)和合适的温度下(例如：50-120℃)进行偶联反应，反应结束常规的柱层析分离得到中间体
ⅰ-
4；
[0096]
(5)中间体
ⅰ-
4的双键是以高碘酸钠为氧化剂，锇酸钾做催化剂，在合适溶剂(例如：二氧六环和水的混合溶剂)和合适的温度下(例如：0-50℃)氧化切断得到醛基中间体
ⅰ-
5；
[0097]
(6)中间体
ⅰ-
5在合适的溶剂(例如：甲醇)中经过合适的还原剂(例如：硼氢化钠)还原得到醇中间体
ⅰ-
6；
[0098]
(7)中间体
ⅰ-
6在合适的溶剂(例如：二氯甲烷)中经过合适的氯化试剂(例如：氯化亚砜)氯化得到氯代中间体
ⅰ-
7；
[0099]
(8)中间体
ⅰ-
8在合适的溶剂(例如：dmf或dmac)，在低温(-20-0℃)加入强碱(例如：氢化钠)后反应一定的时间(例如：0.5-2h)，然后加入氯代中间体
ⅰ-
7，继续反应。反应结束后经过常规后处理分离得到目标化合物(ⅰ)。
[0100]
流程2：x＝nh时的流程
[0101]
是将结构如式
ⅰ-
5所示的化合物和结构如式
ⅱ-
1所示的化合物混合后，在还原剂存在下反应，得到结构如式ⅰ所示的化合物。
[0102]
在本发明的一种实施方式中，结构如式
ⅰ-
5所示的化合物和结构如式
ⅱ-
1所示的化合物在有机碱的存在下先反应2-20小时得到中间体亚胺，然后加入还原剂反应1-22小时，得到结构如式ⅰ所示的化合物。所述有机碱包括但不限于，三乙胺、n，n-二异丙基乙胺(dipea)；所述得到中间体亚胺的反应溶剂包括但不限于，二氯甲烷、二氯乙烷；所述还原剂包括但不限于，三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化钠、氰基硼氢化钠。
[0103]
所述结构如式
ⅰ-
5所示的化合物可以通过如前所述的方法获得。
[0104]
在本发明的一种实施方式中，所述流程2可按下述反应式及其相关描述进行：
[0105][0106]
r1、r2、m、n和本文中式(ⅰ)定义的相同，其中r1不等于氢。
[0107]
在有机碱(例如：三乙胺)存在下，将中间体
ⅰ-
5和
ⅱ-
1在溶剂(例如：二氯甲烷)中先反应一段时间(例如：2-20h)生产中间体亚胺，然后加入还原剂(例如：三乙酰氧基硼氢化钠)反应合适的时间(例如：1-22h)得到亚胺还原的目标化合物(ⅰ)。
[0108]
在本发明的一种实施方式中，还提供按下述反应式及其相关描述进行的流程3：
[0109][0110]
(1)中间体
ⅰ-
1为原料，按照文献wo2017/176817的方法合成中间体
ⅲ-
1。
[0111]
(2)中间体
ⅲ-
1在合适的溶剂(例如：甲醇)中经过合适的还原剂(例如：硼氢化钠)还原得到醇中间体
ⅲ-
2；
[0112]
(3)中间体
ⅲ-
2在合适的溶剂(例如：二氯甲烷)中经过合适的氯化试剂(例如：氯化亚砜)氯化得到氯代中间体
ⅲ-
3；
[0113]
(4)中间体
ⅰ-
8在合适的溶剂(例如：dmf或dmac)，在低温(-20-0℃)加入强碱(例如：氢化钠)后反应一定的时间(例如：0.5-2h)，然后加入氯代中间体
ⅲ-
3，继续反应。反应结束后经过常规后处理分离得到目标化合物33。
[0114]
本发明提供的制备方法中涉及的结构通式如下表所示：
[0115][0116][0117]
其中，m，n，r1和r2的定义如前。
[0118]
本发明还提供上述新型抗结核化合物、或其光学异构体、或其药学上可接受的盐在治疗与结核杆菌引起的感染相关的疾病的用途。
[0119]
本发明通式(ⅰ)化合物有很强的抗结核分枝杆菌效果，特别是对多药耐药和广泛耐药结核分枝杆菌也具有优异的效果。
[0120]
本发明通式(ⅰ)化合物具较好的体外和体内活性、对herg钾电流没有抑制和较好药物药代动力学性质。这对本化合物提高抗结核分枝杆菌活性，提高药效，减少副作用，节省成本都有重要的意义。
[0121]
本发明中，本发明中，“活性成分”指通式(i)所示化合物，以及通式(i)化合物的药学上可接受的无机或有机盐。本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物以及纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明意味着包括这些化合物的所有这种异构形式。
[0122]
另外，根据需要，可以将本发明的部分化合物在极性质子性溶剂中，如甲醇、乙醇、异丙醇，和药学上可以接受的酸反应生成药学上可接受的盐制备得到。所述的药学上可接受的无机或有机酸可为：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙
二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、天冬氨酸或者谷氨酸等。
[0123]
术语“结核杆菌引起”，如本文所用，指由对临床结核药物敏感结核杆菌、对临床某一药物耐药结核杆菌、对临床多种药物耐药结核杆菌和广泛耐药结核杆菌引起。
[0124]
术语“由结核杆菌引起的感染的疾病”或“结核杆菌感染性疾病”可以互换使用，如本文所用，都是指肺结核、淋巴结核、肠结核、骨结核、结核性胸膜炎和结核性脑膜炎等。
[0125]
由于本发明化合物具有优异的抗结核杆菌活性，因此本发明化合物及药学上可接受的无机或有机盐，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗与结核杆菌相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗结核病及其他感染疾病。
[0126]
本发明还提供一种用于治疗与结核杆菌引起的感染相关的疾病的药物组合物，其中含有治疗有效量的上述硝基咪唑类化合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
[0127]
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明硝基咪唑类化合物及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-1000mg本发明化合物/剂，较佳地5-500mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。
[0128]
本发明的化合物及其药学上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明化合物或其药学上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
[0129]“药学上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0130]
施用本发明化合物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
[0131]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0132]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0133]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0134]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
[0135]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1-1000mg，优选10-500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0136]
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，只要这些特征的组合不存在矛盾，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0137]
本发明的主要优点包括：
[0138]
1.本发明化合物对结核分枝杆菌具有特异性效果，同时对多药耐药和广泛耐药结核分枝杆菌具有优异的效果。
[0139]
2.本发明化合物具较好药物药代动力学性质。这对本化合物提高抗结核分枝杆菌活性，提高药效，减少副作用，节省成本都有重要的意义。
[0140]
3.本发明化合物对herg钾电流无抑制，表明对心血管系统具有较好的安全性。
[0141]
4.本发明化合物在小鼠体内具有优异的杀菌效果，显著降低感染小鼠肺部的菌落数。
[0142]
在下面的说明中将会详细阐述上述化合物、方法、药物组合物的各个具体方面、特性和优势，使本发明的内容变得十分明了。在此应理解，下述的详细说明及实例描述了具体的实施例，仅用于参考。在阅读了本发明的说明内容后，本领域的技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形势同样落于本技术所限定的范围。
[0143]
在下述实施例中更具体地解释本发明。然而，应当理解，这些实施例是为了举例说明本发明，而并不是以任何方式限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。
[0144]
所有实施例中1h-nmr用varian mercury 400m或600m核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；ms的测定用岛津lc-ms-2020质谱仪。分离用硅胶未说明均为200-300目，洗脱液的配比均为体积比。
[0145]
实施例1：(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物1)
[0146]
[0147]
(1)将4-三氟甲氧基苯胺(26.7g，0.15mol)，5-溴-2-氯嘧啶(19.34g，0.1mmol)，dipea(25.85g，0.2mol)溶于正丁醇(180ml)中，120℃搅拌过夜。tlc检测(石油醚：乙酸乙酯＝10:1),反应完毕，旋干反应液，加入少量二氯甲烷溶解浓缩物，滴加石油醚，固体析出，过滤得淡黄色固体1-1(13.85g，收率：42％)。
[0148]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(s,2h),7.66-7.56(m,2h),7.37(s,1h),7.24-7.15(m,2h).esi-ms:233.9[m+1]+.
[0149]
(2)将1-1(6.68g，20mmol)溶于干燥的dmf(70ml)中，氩气保护、冰浴下向其中加入nah(1.2g，30mmol)，冰浴下搅拌30min，然后向其中加入碘甲烷(5.68g，40mmol)，缓慢升至室温，搅拌过夜反应。lc-ms监测，反应完毕。向体系中加乙酸乙酯，水，分液，乙酸乙酯萃取，合并的有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝20：1)得淡黄色固体1-3(5.46g，收率：78.5％)。
[0150]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.33(s,2h),7.36-7.30(m,2h),7.26-7.23(m,2h),3.50(s,3h).esi-ms:348.0[m+1]
+
.
[0151]
(3)将1-3(5.22g，15mmol)溶于干燥的dmf(60ml)中，加入三丁基乙烯基锡(7.13g，22.5mmol)，pd(pph3)4(0.87g，0.75mmol)后氩气保护，120℃反应过夜。lc-ms监测，反应完全。向体系中加kf，水，硅藻土抽滤，乙酸乙酯萃取，合并的有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝20：1)得白色固体1-4(2.82g，收率：63.8％)。
[0152]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.39(s,2h),7.36-7.30(m,2h),7.26-7.22(m,2h),6.50(dd,j＝17.2hz,0.4hz,1h),5.61(dd,j＝17.2hz,0.4hz,1h),5.17(dd,j＝11hz,0.4hz,1h),3.53(s,3h).esi-ms:296.1[m+1]
+
.
[0153]
(4)将1-4(2.36g，8.0mmol)溶于二氧六环/水(30ml，1：1)的混合溶液中，加入高碘酸钠(6.82g，32mmol)，k2oso4.2h2o(29mg，0.08mmol)后室温反应。lc-ms监测，反应完全。向体系中加水，乙酸乙酯萃取，合并的有机相，依次用稀盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，得白色固体1-5(2.80g)，不经纯化，粗品直接投下一步。esi-ms:298.1[m+1]
+
.
[0154]
(5)将1-5(2.80g)溶于甲醇(30ml)中，冰浴下向其中加入nabh4(0.45g，12mmol)，然后缓慢升至后室温，反应2小时。lc-ms监测，反应完全。向体系中加水淬灭，浓缩，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3：1)得白色固体1-6(1.48g，收率：62.1％)。
[0155]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.25(s,2h),7.35-7.29(m,2h),7.25-7.22(m,2h),4.48(s,2h),3.49(s,3h).esi-ms:300.1[m+1]
+
.
[0156]
(6)将1-6(598mg，2.0mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中，向其中加入5ml氯化亚砜(5ml)，室温反应。lc-ms监测，反应完全后，浓缩，加二氯甲烷，旋蒸socl2两次，得白色固体1-7(623mg)直接投下一步。esi-ms:318.1[m+1]
+
.
[0157]
(7)将中间体i-8(400mg,2.14mmol)加入到干燥的dmf(5ml)中，冰浴、氩气保护下向其中加入nah(340mg,8.5mmol)，冰浴下反应半小时，加入间体1-7(623mg)的dmf(5ml)溶液，冰浴升到室温后反应1h。lc-ms监测反应完全，向体系中加乙酸乙酯，水，分液，萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得淡黄色固体化合物1(191mg，收率：20.5％)。
[0158]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,2h),7.38(s,1h),7.34
–
7.29(m,2h),7.24-7.21
(m,2h),4.63-4.59(m,1h),4.56(d,j＝11.5hz,1h),4.44(d,j＝11.4hz,1h),4.34(d,j＝12.3hz,1h),4.19(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.12-4.07(m,2h),3.51(s,3h).esi-ms:467.1[m+1]
+
.
[0159]
实施例2：(s)-n-乙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物2)
[0160][0161]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物2。
[0162]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.20(s,2h),7.33(s,1h),7.19(s,4h),4.55(d,j＝11.8hz,1h),4.49(d,j＝11.6hz,1h),4.38(d,j＝11.3hz,1h),4.29(d,j＝12.2hz,1h),4.15(dd,j＝13.6,4.8hz,1h),4.08-4.03(t,j＝8.5hz,2h),3.95(q,j＝6.9hz,2h),1.15(t,j＝6.9hz,3h).esi-ms:481.1[m+1]
+
.
[0163]
实施例3：(s)-n-丙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物3)
[0164][0165]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物3。
[0166]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(s,2h),7.33(s,1h),7.21-7.17(m,4h),4.60
–
4.51(m,1h),4.48(d,j＝11.4hz,1h),4.37(d,j＝11.4hz,1h),4.30(d,j＝12.3hz,1h),4.15(dd,j＝13.4,4.6hz,1h),4.08-4.01(m,2h),3.87
–
3.80(m,2h),1.61-1.56(m,2h),0.85(t,j＝7.4hz,3h).esi-ms:494.2[m+1]
+
.
[0167]
实施例4：(s)-n-异丙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物4)
[0168][0169]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物4。
[0170]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.17(s,2h),7.32(s,1h),7.22(d,j＝8.7hz,2h),7.07(d,j＝8.7hz,2h),5.12-5.05(m,1h),4.53(d,j＝12.1hz,1h),4.46(d,j＝11.5hz,1h),4.36(d,j＝11.5hz,1h),4.29(d,j＝12.0hz,1h),4.14(dd,j＝13.5,4.4hz,1h),4.04(d,j＝10.9hz,2h),1.08(d,j＝6.7hz,6h).esi-ms:494.2[m+1]
+
.
[0171]
实施例5：(s)-n-三氟乙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物5)
[0172][0173]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物5。
[0174]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.25(s,2h),7.33(s,1h),7.23(d,j＝6.1hz,4h),4.66-4.60(m,2h),4.57(d,j＝11.6hz,1h),4.53(d,j＝10.9hz,1h),4.42(d,j＝10.8hz,1h),4.31(d,j＝11.6hz,1h),4.17(d,j＝10.3hz,1h),4.09(s,2h).esi-ms:535.1[m+1]
+
.
[0175]
实施例6：(s)-n-环丙基甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物6)
[0176][0177]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物6。
[0178]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.19(s,2h),7.33(s,1h),7.24(d,j＝8.8hz,2h),7.19(d,j＝8.7hz,2h),4.57
–
4.52(m,1h),4.48(d,j＝11.5hz,1h),4.37(d,j＝11.4hz,1h),4.30(d,j＝12.2hz,1h),4.15(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.05(d,j＝12.4hz,2h),3.77(d,j＝6.9hz,2h),1.08
–
1.03(m,1h),0.39-0.34(m,2h),0.10-0.06(m,2h).esi-ms:507.2[m+1]
+
.
[0179]
实施例7：(s)-n-环戊基甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物7)
[0180][0181]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物7。
[0182]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.20(s,2h),7.35(s,1h),7.24(d,j＝8.8hz,2h),7.19(d,j＝8.7hz,2h),4.56
–
4.52(m,1h),4.45(d,j＝11.8hz,1h),4.32(d,j＝11.6hz,1h),4.29(d,j＝12.0hz,1h),4.13(dd,j＝13.4,4.4hz,1h),4.06(d,j＝12.2hz,2h),3.75(d,j＝6.9hz,2h),1.88-1.72(m,2h),1.52-1.40(m,7h).esi-ms:535.2[m+1]
+
.
[0183]
实施例8：(s)-n-((4，4-二氟甲基环己基)甲基)-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物8)
[0184]
[0185]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物8。
[0186]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.18(s,2h),7.20(s,1h),7.22(d,j＝8.7hz,,2h),718(d,j＝8.8hz,2h),4.58-4.49(m,1h),4.48(d,j＝12.0hz,1h),4.34(d,j＝12.2hz,1h),4.0(d,j＝12.3hz,1h),4.18-4.14(m,1h),4.08(d,j＝12.0hz,2h),3.65(d,j＝7.0hz,2h),1.68-1.34(m,8h),1.42-1.37(m,1h).esi-ms:585.2[m+1]
+
.
[0187]
实施例9：(s)-n-环丙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物9)
[0188][0189]
(1)将环丙胺(11.1g，0.195mol)，5-溴-2-氯嘧啶(12.5g，65mmol)溶于乙醇(130ml)中，80℃搅拌3h。冷却，固体析出，过滤得白色固体9-2(5.67g，收率：68％),不再纯化，直接进行下一步。esi-ms:213.9[m+1]+.
[0190]
(2)将中间体9-2(4.27g,0.02mol)，cui(762mg,0.004mol),cs2co3(16.3g,0.05mol),l-脯氨酸(920mg,0.008mol),对三氟甲氧基碘苯(12.6g,0.045mol)溶于dmso(40ml)中，氩气保护，120℃反应过夜。lc-ms监测，反应完毕。向体系中加乙酸乙酯，水，分液，萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝4：1)得淡黄色固体9-3(1.5g，收率20％)。
[0191]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.32(s,2h),7.34-7.29(m,2h),7.24-7.20(m,2h),3.10-3.05(m,1h),1.06-0.93(m,2h),0.60-0.51(m,2h).esi-ms:374.0[m+1]
+
.
[0192]
(3)以中间体9-3为原料，后续采用和实施例1中相同的方法制备化合物9。
[0193]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.32(s,2h),7.38(s,1h),7.24
–
7.19(m,4h),4.62-4.58(m,1h),4.56(d,j＝11.7hz,1h),4.46(d,j＝11.6hz,1h),4.35(d,j＝12.3hz,1h),4.21(dd,j＝13.4,4.5hz,1h),4.15
–
4.08(m,2h),3.17
–
3.10(m,1h),0.96-0.91(m,2h),0.55
–
0.47(m,2h).esi-ms:492.1[m+1]
+
.
[0194]
实施例10：(s)-n-环戊基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物10)
[0195][0196]
采用和实施例9中相同的方法制备化合物10。
[0197]
化合物10：1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.23(s,2h),7.35(s,1h),7.23(m,-7.18(m,4h),4.60-4.56(m,1h),4.55(d,j＝11.8hz,1h),4.42(d,j＝12.0hz,1h),4.30(d,j＝12.1hz,1h),4.19(dd,j＝13.1,4.7hz,1h),4.14-4.06(m,2h),3.09-3.04(m,1h),1.82-1.52(m,8h).esi-ms:521.2[m+1]
+
.
[0198]
实施例11：(s)-n-(3-氯-4-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物11)
[0199][0200]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物11。
[0201]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.30(s,2h),7.44(d,j＝2.5hz,1h),7.39(s,1h),7.32(dd,j＝8.9,1.2hz,1h),7.25-7.22(m,1h),4.65
–
4.59(m,1h),4.57(d,j＝11.5hz,1h),4.46(d,j＝11.5hz,1h),4.35(d,j＝12.3hz,1h),4.20(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.14
–
4.08(m,2h),3.51(s,3h).esi-ms:501.1[m+1]
+
.
[0202]
实施例12：(s)-n-(3-溴-4-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物12)
[0203][0204]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物12。
[0205]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.30(s,2h),7.59(d,j＝2.1hz,1h),7.39(s,1h),7.34
–
7.26(m,2h),4.64
–
4.59(m,1h),4.57(d,j＝11.4hz,1h),4.46(d,j＝11.4hz,1h),4.35(d,j＝12.2hz,1h),4.21(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.15
–
4.07(m,2h),3.51(s,3h).esi-ms:544.0[m+1]
+
.
[0206]
实施例13：(s)-4-(甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺)苯甲腈(化合物13)
[0207][0208]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物13。
[0209]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,2h),7.46(d,j＝8.8hz,2h),7.40(d,j＝8.8hz,2h),7.38(s,1h),4.64-4.58(m,1h),4.57(d,j＝11.6hz,1h),4.45(d,j＝11.6hz,1h),4.34(d,j＝12.3hz,1h),4.19(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.12-4.08(m,2h),3.52(s,3h).esi-ms:408.1[m+1]
+
.
[0210]
实施例14：(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(3，4，5-三氟苯基)嘧啶-2-胺(化合物14)
[0211][0212]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物14。
[0213]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,2h),7.38(s,1h),7.23-7.17(m,2h),4.60-4.57(m,1h),4.56(d,j＝11.4hz,1h),4.43(d,j＝11.4hz,1h),4.34(d,j＝12.3hz,1h),4.19(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.12-4.06(m,2h),3.50(s,3h).esi-ms:437.1[m+1]
+
.
[0214]
实施例15：(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苄基)嘧啶-2-胺(化合物15)
[0215][0216]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物15。
[0217]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.22(s,2h),7.34(s,1h),7.19(j＝8.2hz,2h),7.08(d,j＝8.2hz,2h),4.82(s,2h),4.58
–
4.53(m,1h),4.49(d,j＝11.4hz,1h),4.38(d,j＝11.4hz,1h),4.31(d,j＝12.2hz,1h),4.16(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.12-4.07(m,2h),3.07(s,3h).esi-ms:481.1[m+1]
+
.
[0218]
实施例16:(s)-n-环丙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苄基)嘧啶-2-胺(化合物16)
[0219][0220]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物16。
[0221]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.27(s,2h),7.34(s,1h),7.16(d,j＝8.6hz,2h),7.05(d,j＝8.2hz,2h),4.83(s,2h),4.59
–
4.54(m,1h),4.51(d,j＝11.4hz,1h),4.39(d,j＝11.4hz,1h),4.30(d,j＝12.2hz,1h),4.15(dd,j＝13.5,4.7hz,1h),4.10
–
4.04(m,2h),2.73
–
2.67(m,1h),0.82-0.79(m,2h),0.63
–
0.58(m,2h).esi-ms:507.2[m+1]
+
.
[0222]
实施例17:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯乙基)嘧啶-2-胺(化合物17)
[0223][0224]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物17。
[0225]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.20(s,2h),7.34(s,1h),7.18(j＝8.6hz,2h),7.06(d,j＝8.6hz,2h),4.57
–
4.53(m,1h),4.48(d,j＝11.4hz,1h),4.36(d,j＝11.4hz,1h),4.30(d,j＝12.2hz,1h),4.15(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.03-4.07(m,2h),3.52(t,j＝7.2hz,2h),3.05(s,3h),2.82(t,j＝7.2hz,2h).esi-ms:495.2[m+1]
+
.
[0226]
实施例18:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(3-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物18)
[0227][0228]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物18。
[0229]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.30(s,2h),7.42
–
7.36(m,2h),7.25(d,j＝8.0hz,1h),7.19(s,1h),7.07(d,j＝8.2hz,1h),4.63
–
4.59(m,1h),4.57(d,j＝11.5hz,1h),4.45(d,j＝11.4hz,1h),4.35(d,j＝12.1hz,1h),4.20(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.14
–
4.07(m,2h),3.53(d,j＝0.4hz,3h).esi-ms:467.2[m+1]
+
.
[0230]
实施例19:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(2-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物19)
[0231][0232]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物19。
[0233]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.27(s,2h),7.38(s,1h),7.34(s,4h),4.60
–
4.52(m,2h),4.44(d,j＝11.6hz,1h),4.33(d,j＝12.1hz,1h),4.18(dd,j＝13.4,4.5hz,1h),4.13
–
4.05(m,2h),3.44(s,3h).esi-ms:467.2[m+1]
+
.
[0234]
实施例20:((s)-n-乙基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(3-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物20)
[0235][0236]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物20。
[0237]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(s,2h),7.42
–
7.36(m,2h),7.26(d,j＝8.0hz,1h),7.19(s,1h),7.06(d,j＝8.2hz,1h),4.64
–
4.59(m,1h),4.57(d,j＝11.5hz,1h),4.45(d,j＝11.4hz,1h),4.36(d,j＝12.1hz,1h),4.21(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.14
–
4.07(m,2h),3.93(q,j＝6.9hz,2h),1.13(t,j＝6.9hz,3h).esi-ms:481.1[m+1]
+
.
[0238]
实施例21:(s)-n-(4-甲氧苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-嘧啶-2-胺(化合物21)
[0239][0240]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物21。
[0241]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.24(s,2h),7.33(s,1h),7.23(d,j＝8.4hz,2h),7.17(d,j＝8.4hz,2h),4.54-4.43(m,2h),4.42(d,j＝12.1hz,1h),4.32(d,j＝11.2hz,1h),4.17
(dd,j＝13.5hz,4.6hz,1h),4.10-4.07(m,2h),3.92(s,3h),3.50(s,3h).esi-ms:413.1[m+1]
+
.
[0242]
实施例22:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物22)
[0243][0244]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物22。
[0245]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(s,2h),7.43(d,j＝8.6hz,2h),7.37(s,1h),7.35(d,j＝8.8hz,2h),4.64-4.55(m,2h),4.56(d,j＝11.4hz,1h),4.45(d,j＝11.4hz,1h),4.36(d,j＝12.2hz,1h),4.20(dd,j＝13.3hz,4.6hz,1h),4.13-4.09(m,2h),3.53(s,3h).esi-ms:451.1[m+1]
+
.
[0246]
实施例23:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲硫基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物23)
[0247][0248]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物23。
[0249]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.26(s,2h),7.42(d,j＝8.6hz,2h),7.38(s,1h),7.29(d,j＝8.8hz,2h),4.62-4.57(m,1h),4.56(d,j＝11.6hz,1h),4.44(d,j＝11.6hz,1h),4.32(d,j＝12.3hz,1h),4.17(dd,j＝13.3,4.6hz,1h),4.13-4.08(m,2h),3.51(s,3h).esi-ms:483.1[m+1]
+
.
[0250]
实施例24:(s)-n-(4-(二氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-嘧啶-2-胺(化合物24)
[0251][0252]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物24。
[0253]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.26(s,2h),7.36-7.33(m,2h),7.28(j＝8.6hz,2h),7.17(d,j＝8.6hz,2h),4.57
–
4.52(m,1h),4.47(d,j＝11.4hz,1h),4.35(d,j＝11.4hz,1h),4.30(d,j＝12.2hz,1h),4.17(dd,j＝13.5,4.6hz,1h),4.12-4.07(m,2h),3.50(s,3h).esi-ms:449.1[m+1]
+
.
[0254]
实施例25:(s)-n-(3-氟-4-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物25)
[0255][0256]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物25。
[0257]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.30(s,2h),7.39(s,1h),7.29(t,j＝8.7hz,1h),7.21(dd,j＝11.2,2.4hz,1h),7.13
–
7.08(m,1h),4.64
–
4.59(m,1h),4.57(d,j＝11.4hz,1h),4.46(d,j＝11.4hz,1h),4.35(d,j＝12.1hz,1h),4.21(dd,j＝13.4,4.6hz,1h),4.14-4.09(m,2h),3.51(s,3h).esi-ms:485.1[m+1]
+
.
[0258]
实施例26:(s)-n-(2-氯-4-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物26)
[0259][0260]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物26。
[0261]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,2h),7.38(s,1h),7.36(d,j＝1.8hz,1h),7.32(d,j＝8.7hz,1h),7.21
–
7.16(m,1h),4.63
–
4.57(m,1h),4.55(d,j＝11.5hz,1h),4.44(d,j＝11.5hz,1h),4.35(d,j＝12.2hz,1h),4.21(dd,j＝13.4,4.5hz,1h),4.14
–
4.07(m,2h),3.42(s,3h).esi-ms:501.1[m+1]
+
.
[0262]
实施例27:(s)-n-(2-甲基-4-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物27)
[0263][0264]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物27。
[0265]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(s,2h),7.40(s,1h),7.19-7.14(m,2h),7.11(d,j＝8.9hz,1h),4.66
–
4.59(m,1h),4.56(d,j＝11.4hz,1h),4.44(d,j＝11.4hz,1h),4.36(d,j＝12.0hz,1h),4.21(dd,j＝13.3,4.4hz,1h),4.15
–
4.08(m,2h),3.41(s,3h),2.14(s,3h).esi-ms:481.1[m+1]
+
.
[0266]
实施例28:(s)-n-(4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物28)
[0267][0268]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物28。
[0269]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.23(s,2h),7.35(s,1h),7.22(d,j＝5.5hz,1h),7.17-7.13(m,2h),4.56(d,j＝11.9hz,1h),4.50(d,j＝11.3hz,1h),4.41(d,j＝11.4hz,1h),4.32(d,j＝12.0hz,1h),4.19(dd,j＝13.0,4.6hz,1h),4.10(s,2h),3.44(s,3h).esi-ms:485.1[m+1]
+
.
[0270]
实施例29:(s)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧代)甲基)-n-苯基嘧啶-2-胺(化合物29)
[0271][0272]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物29。
[0273]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.26(s,2h),7.35(s,1h),7.33
–
7.26(m,4h),7.18-7.14(m,1h),4.62-4.57(m,1h),4.56(d,j＝11.5hz,1h),4.44(d,j＝11.5hz,1h),4.34(d,j＝12.3hz,1h),4.19(dd,j＝13.4,4.6hz,1h),4.14-4.07(m,2h),3.43(s,3h).esi-ms:383.1[m+1]
+
.
[0274]
实施例30:(s)-n-(4-环丙基苯基)-n-甲基-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)嘧啶-2-胺(化合物30)
[0275][0276]
采用和实施例1中相同的方法制备化合物30。
[0277]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.26(s,2h),7.36(s,1h),7.32(d,j＝8.6hz,2h),7.28(d,j＝8.7hz,2h),4.64-4.59(m,1h),4.55(d,j＝11.5hz,1h),4.43(d,j＝11.5hz,1h),4.34(d,j＝12.3hz,1h),4.19(dd,j＝13.3,4.5hz,1h),4.13-4.07(m,2h),3.46(s,3h),2.01
–
1.95(m,1h),1.59-1.52(m,2h),1.16-1.08(m,2h).esi-ms:423.2[m+1]
+
.
[0278]
实施例31:(s)-n-((2-(甲基(4-(三氟甲氧基)苯基)胺基)嘧啶-5-基)甲基)-2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-胺(化合物31)
[0279][0280]
将中间体1-5(148mg,0.50mmol)，三乙胺(66mg,0.65mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中，然后加入原料ii-1(84mg,0.50mmol)中，室温反应过夜，加入nabh(oac)3(424mg,2.0mmol)，继续室温反应过夜。加入碳酸氢钠溶液，分层，水层用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，浓缩，柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50:1)得到淡黄色粉末状化合物31(116mg,收率52.7％)。
[0281]1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(s,2h),7.46(s,1h),7.35(d,j＝8.6hz,2h),7.26(d,j＝8.6hz,2h),4.51(dd,j＝11.4,2.6hz,1h),4.43(dd,j＝11.4,5.6hz,1h),4.23(dd,j＝12.2,4.4hz,1h),3.98(dd,j＝12.2,4.4hz,1h),3.81(q,j＝13.4hz,2h),3.50
–
3.40(m,1h),3.20(s,3h).esi-ms:466.1[m+1]
+
.
[0282]
实施例32(s)-n-((2-(甲基(4-(三氟甲氧基)苄基)胺基)嘧啶-5-基)甲基)-2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-胺(化合物32)
[0283][0284]
采用和实施例31中相同的方法制备化合物32。
[0285]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.33(s,2h),7.45(s,1h),7.30(d,j＝8.2hz,2h),7.20(d,j＝8.2hz,2h),4.94(s,2h),4.50(dd,j＝11.6,2.6hz,1h),4.43(dd,j＝11.8,5.5hz,1h),4.24(dd,j＝12.2,4.3hz,1h),3.99(dd,j＝12.2,4.4hz,1h),3.81(q,j＝13.4hz,2h),3.50
–
3.41(m,1h),3.19(s,3h).esi-ms:480.2[m+1]
+
.
[0286]
实施例33:(s)-5-(((2-硝基-6,7-二氢-5h-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪-6-基)氧基)甲基)-n-(4-(三氟甲氧基)苯基)嘧啶-2-胺(化合物33)
[0287][0288]
以1-1为原料，按照文献wo2017/176817的方法合成中间体iiii-1，然后采用和实施例1中相同的方法制备化合物33。
[0289]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.32(s,2h),7.57(d,j＝9.0hz,2h),7.35(s,1h),7.13(d,j＝8.6hz,2h),4.62
–
4.58(m,1h),4.56(d,j＝11.4hz,1h),4.44(d,j＝11.4hz,1h),4.32(d,j＝12.2hz,1h),4.18(dd,j＝14.0,4.9hz,1h),4.12
–
4.06(m,2h).esi-ms:453.1[m+1]
+
.
[0290]
药理实施例
[0291]
实施例34：部分化合物对结核分枝杆菌h37rv菌株的体外药效实验
[0292]
将受试菌株h37rv转入液体培养基，于37℃培养2周，吸取培养菌液少许，置于4ml液体培养基中，加入直径2-3mm无菌玻璃珠10-20粒，振荡20-30s，静止沉淀l0-20 min，吸取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1
×
107cfu/ml备用。每种药物用适量dmso溶解至1mg/ml，0.22μm滤器过滤。再以液体培养基稀释至所需实验浓度。受试药物终浓度设置如下：0.0039μg/ml、0.0078μg/ml、0.0156μg/ml、0.03125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml，共11个浓度梯度。各取上述药物溶液100μl，加到96孔微孔板中，再加入1mg/ml浓度的菌液100μl，使药物浓度达到设置的终浓度，37℃培养。同一药物稀释度设三组平行对照，对照组不加药物，接菌量分别设置为100％、10％和1％。37℃培养14天后，观察各组菌落生长情况，以无菌落生长的药物组最低浓度作为测试化合物对该菌株的mic值。观察各化合物对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(mic)，同时和对照药pa-824的mic结果进行比较。结果如表1所示。
[0293]
表1.h37rv型结核分枝杆菌的体外活性-最小抑菌浓度(mic)
[0294][0295][0296]
从表1可以看出，本发明的化合物体外mic表现出明显优于对照药物pa-824的体外活性。例如，化合物1、化合物13、化合物18、化合物22、化合物23、化合物28、化合物31和化合物33的体外活性(mic)为0.03125μg/ml，其抗菌活性是对照药物pa-824体外药效的4倍。
[0297]
实施例35：部分化合物对耐药结核分枝杆菌菌株的体外药效实验
[0298]
将受试菌株(1146-14：链霉素耐药；4061-15：异烟肼耐药；3997-7：利福平耐药；b2，mdr-tb；b6，b29和b53,xdr-tb)结核分枝杆菌临床分离株，来自上海市肺科医院临床分离。步骤如下：a.采集上海市肺科医院结核科住院病人的痰标本，经碱处理后，接种到改良罗氏培养基上，培养2周；b.绝对浓度法测药敏：从培养基斜面上刮取新鲜培养物，用生理盐水磨菌比浊到1个麦氏单位(1mg/ml)，稀释到10-2mg/ml，取0.1ml接种于药敏培养基上，四周后观察结果。参考资料：《结核病诊断实验室检验规程》，中国防痨协会基础专业委员会编著，中国教育文化出版社，2006年1月)转入液体培养基，于37℃培养2周，吸取培养菌液少许，置于4ml液体培养基中，加入直径2-3mm无菌玻璃珠10-20粒，振荡20-30s，静止沉淀l0-20 min，吸取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1
×
107cfu/ml备用。每种药物用适量dmso溶解至1mg/ml，0.22μm滤器过滤。再以液体培养稀释至所需实验浓度。受试药物终浓度设置如下：0.0039μg/ml、0.0078μg/ml、0.0156μg/ml、0.03125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml，共11个浓度梯度检测时，各取上述药物溶液100μl，加到96孔微孔板中，再加入1mg/ml浓度的菌液100μl，使药物浓度达到设置的终浓度，37℃培养。同一药物稀释度设三组平行对照，对照组不加药物，接菌量分别设置为100％、10％和1％。观察各药对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度(mic)，
同时与pa-824的mic结果进行比较。结果如表2所示。
[0299]
表2.抗耐药结核分枝杆菌的体外活性-最小抑菌浓度(mic)
[0300][0301]
s:链霉素，h:异烟肼，r:利福平b2:mdr-tb，b53,b29,b6:xdr-tb.
[0302]
从表2可以看出，本发明化合物和对照化合物pa-824对链霉素耐药菌株、异烟肼耐药菌株、利福平耐药菌株、多耐药菌株(b2)和广泛耐药菌株(b53、b29和b6)均表现出优异的体外抗菌活性，同时也表明了本发明化合物对各种耐药菌株的体外活性优于对照药pa-824。这表明，本发明化合物与pa-824一样，可用于耐药结核杆菌、尤其是多耐药和广泛耐药结核杆菌引起的疾病治疗。
[0303]
同时，本发明的化合物和pa-824作用机理一致，是全新的作用机制，和现有药物不存在交叉耐药情况。因此，除去表2中所列的化合物，本发明中所述的其他化合物只要对h37rv菌株有抑制活性，其对各种耐药菌株均有抑制活性。
[0304]
实施例36：部分化合物的体内药代动力学实验
[0305]
使用0.5％cmc-na水溶液将测试化合物配制成终浓度为2mg/ml的均匀悬浮液，用于口服给药。口服灌胃给药，单次给药剂量10mg/kg，给药体积为10ml/kg.给药后15min、30min、1h、2h、4h、6h、10h、12h、24h经小鼠眼球后静脉丛取血0.15ml血液样本。
[0306]
配制终浓度为0.5mg/ml供试品用于静脉给药，供试品配制溶剂为5％dmso+20％ea+50％peg400+25％saline(生理盐水)水溶液，单次给药剂量2mg/kg.：给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h采集血样。
[0307]
选取cd-1小鼠，雄性，给药开始时周龄6-8周，给药开始时体重20-30g，记号笔编号。给药前测定动物体重，选择体重相近的健康动物纳入实验，不进行随机分组，实验期间所有动物自由饮水。
[0308]
采集后放置于标记好的离心管中，于3500转/分钟，10分钟，4℃下迅速分离出血浆，然后将血浆置于-40℃以下保存待测。用lc-ms/ms法测定血浆中的药物浓度，并计算其药代参数。
[0309]
表3.在cd-1小鼠中的药代动力学实验结果
[0310]
[0311]
由上述表3数据可以看出，小鼠单次口服给药后，本发明部分化合物均具有的较好药代动力学性质。表3只是部分化合物的代表，其余化合物也可能有优异的药代动力学性质。
[0312]
这些都表明本发明化合物有很好的成药性，很可能发展成为有效的结核治疗药物。另外由于本发明的部分化合物的体外活性明显高于对照药物，因此，有理由相信本发明的部分化合物会表现出优异的体内药效。
[0313]
实施例37:小鼠急性感染模型测试部分化合物的体内药效
[0314]
balb/c小鼠，雌性，体重约20克，使用吸入暴露系统通过气溶胶途径感染结核分枝杆菌h37rv(atcc strain 27274)，感染剂量约为5000cfu。在治疗当天安乐死5只未经治疗的小鼠来确定感染剂量。待测试药物使用0.5％w/v的羧甲基纤维素(cmc)配置成悬浮液。使用前置于4℃下保存。对照组小鼠仅使用0.5％cmc处理。
[0315]
对小鼠分组，称重，每组小鼠5只，开始灌胃给药，每周五天，每天一次，连续给药四周。最后一次给药后经过3天清除期，对实验小鼠实施安乐死，两肺无菌摘除后磨碎，于3ml hank's平衡盐溶液中(hbss)匀浆。hbss溶液十倍稀释后于middlebrook 7h11琼脂板上培养三周，计数菌落形成单位。结果以每组小鼠的平均logcfu值表示。
[0316]
表4.h37rv急性感染的balb/c雌性小鼠中的体内药效试验
[0317][0318]
a:因为爆发性感染，5只未给药小鼠在感染后第24天实施了安乐死。
[0319]
对于h37rv急性感染的balb/c雌性小鼠，给药结束后，pa-824、化合物1和化合物2三组中小鼠均没有死亡。从表4可以看出，化合物2给药结束时，每个剂量组的cfu数均比对照pa-824低，显著优于对照药物，特别是在30mg/kg剂量组时，化合物2对结核杆菌具有显著的杀菌效果，cfu减低0.73个log(和0天比较)，而pa-824的cfu数值增加(和0天比较)。在100mg/kg剂量组，化合物1比pa-824的cfu数多降低0.43个log单位。
[0320]
以上这些数据表明，本发明化合物相对于pa-824具有更加优异的体内杀菌活性，特别是化合物2在中剂量下优势更加明显，即较低剂量的化合物即可起到较佳的治疗效果，同时减轻了副作用。
[0321]
实施例38:化合物对herg钾离子通道抑制作用试验
[0322]
稳定表达herg的hek-293细胞(法国creacelltm)，在室温下，用全细胞膜片钳技术记录herg钾通道电流。全细胞膜片钳记录全细胞herg钾电流的电压刺激方案如下：当形成全细胞封接后细胞膜电压钳制于-80mv。钳制电压由-80mv除极至-50mv维持0.5s(作为漏电
流检测)，然后阶跃至30mv维持2.5s，再迅速恢复至-50mv维持4s可以激发出herg通道的尾电流。每隔10s重复采集数据，观察药物对herg尾电流的作用。以0.5s的-50mv刺激作为漏电流检测。试验数据由epc-10放大器(heka)进行采集并储存于patchmaster(heka)软件中。
[0323]
数据分析：首先将每一个药物浓度作用后的电流和空白对照电流标准化然后计算每一个药物浓度对应的抑制率制率对每一个浓度计算平均数和标准误，并用以下的方程计算每种化合物的半抑制浓度：
[0324][0325]
用以上方程对剂量依赖效应进行非线性拟合，其中c代表药物浓度，ic50为半抑制浓度，h代表希尔系数。曲线拟合以及ic50的计算利用igor软件完成。
[0326]
样品准备：1、将称量出的供试品，用dmso配制成相应浓度储液；2、用dmso将供试品储液依次稀释成为0.5mm，2mm，8mm的稀释液；3、用细胞外液将供试品稀释液依次稀释，配成0.5μm，2μm，8μμ和32μμ的液体，所有浓度超声20min；4、目测和镜检待测样品的溶解性，然后测试。
[0327]
表5部分化合物对herg的抑制：
[0328]
化合物ic
50
(μm)化合物2>32pa-8245.8
[0329]
表5表明，本发明化合物对herg钾电流是无抑制，提示本发明化合物对心血管系统具有很好的安全性，其安全性优于对照药物(pa-824)。
[0330]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。