一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用与流程

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。

背景技术：

皮肤作为人体最大的器官，是人体与外界接触的第一道天然屏障，发挥着调节人体温度、提供感觉、维持内环境稳定、阻止微生物、化学物质进入以及避免脱水等作用。正常的皮肤组织分为表皮层、真皮层和皮下组织层。真皮是由成纤维细胞、细胞外基质、血管内皮细胞和皮肤附属物(毛囊、汗腺)组成的结缔组织。真皮成纤维细胞(dermalfibroblasts,dfl)分泌胶原蛋白和弹性蛋白分子，为皮肤提供机械强度和弹性。

烧烫伤主要是指由于热力、热液、放射线、电能、化学物质等引起的皮肤、黏膜甚至皮下组织的损伤。烧烫伤可以导致皮肤失去完整结构、丧失功能、破坏人体内环境、在受到辐射及创伤的情况下容易发生感染，是导致人类死亡的一个重要因素。在我国，每年大概有2000万人遭受不同程度的烧烫伤，发病率约为1.5％～2％，其中大概有5％的人需要住院治疗。

皮肤损伤修复是指皮肤受到不同程度的破坏和缺损时，机体通过再生、重建进行修复的一系列病理和生理过程，涉及到出血、凝固、炎症的发生发展、细胞迁移、增殖和分化、血管再生、细胞外机制的合成和重塑等，是一个动态和复杂的生物学过程。皮肤损伤修复一般可以概括为炎症期、组织细胞增殖期和组织结构重塑期这三个独特而又重叠的阶段。

早在1996年，lekic等人就提出了“真皮成纤维细胞是皮肤创面修复的工程师、建筑师和管理员”的观点。当皮肤组织受到损伤时，dfl可以通过增殖、迁移、分化、分泌多种细胞因子以及合成包括胶原蛋白在内的多种细胞外基质等方式来促进皮肤创面愈合。皮肤损伤后，dfl首先会以有丝分裂的方式大量增殖。损伤后4～5天，dfl开始和合成分泌细胞外基质成分(以胶原蛋白为主)和多种细胞因子。这些胞外基质和细胞因子与新生薄壁毛细血管功能形成肉芽组织，填满伤口，为创面愈合过程中细胞的增殖、分化、生长、黏附提供支撑结构因此，任何改变dfl增殖、迁移、生物学状态及功能的因素都会影响皮肤损伤修复。因此，在现有的研究中大量用到皮肤成纤维细胞进行实验。

到目前为止，在皮肤损伤相关研究中，往往用真皮成纤维细胞的细胞系进行研究。但是，细胞系由于长期在体外2d培养，细胞在形态和功能上与体内成纤维细胞相差甚远，导致获取的实验结果不可信。而现有的原代真皮成纤维细胞的分离、培养方法又存在细胞得率低、往往含有其它类型细胞污染、细胞增殖能力弱等缺点，极大的限制了其应用。因此，本申请提出一种简单、高效的人真皮成纤维细胞分离、培养及纯化的方法。此外，为了模拟体内皮肤细胞烧伤及烫伤，我们通过热水处理，构建了一种人真皮成纤维细胞热损伤的模型。

技术实现要素：

针对现有技术的上述不足之处，本发明的目的是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种从小孩包皮切除手术废弃皮肤中分离、培养、纯化真皮成纤维细胞的方法、并利用水浴锅加热处理构建了人真皮成纤维细胞人损伤模型。

本发明的目的之一是提供一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法，包括以下步骤：

1)将生长状态良好的高纯度真皮成纤维细胞胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时终止消化，进行离心并用pbs清洗获得细胞沉淀；

2)将步骤1)所述的细胞沉淀接种于六孔板，加入真皮成纤维细胞完全培养基进行培养；

3)细胞贴壁之后吸弃培养基，去除未贴壁细胞，添加新鲜真皮成纤维细胞完全培养基，将六孔板于53℃水浴中热处理50分钟，得到真皮成纤维细胞热损伤模型。

在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度大于95％；更优选地，所述高纯度真皮成纤维细胞的纯度为100％。

在优选地的实施方案中，步骤1)所述终止消化的方法为用含体积浓度5％-15％胎牛血清的dmem培养基处理细胞，优选地，采用10％胎牛血清的dmem培养基处理细胞。

在优选地的实施方案中，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：

30-35份的h-dmem基础培养基、5-7份的胎牛血清和0.3-0.5份的双抗溶液；

更优选地，所述真皮成纤维细胞完全培养基具有如下体积份数的各组分：

33.6份的h-dmem基础培养基、6份15％v/v胎牛血清以及0.4份1％v/v双抗溶液，所述双抗溶液含10,000u/ml苄青霉素钠和10,000μg/ml链霉素。在具体的实施方式中，该真皮成纤维细胞完全培养基按以下方法制备：所述真皮成纤维细胞完全培养基的制备方法为：在50ml无菌容器中加入33.6mlh-dmem基础培养基、6ml胎牛血清和0.4ml双抗(含10,000u/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。

在优选地的实施方案中，所述培养的条件为，在六孔板中每孔添加2ml真皮成纤维细胞完全培养基，然后置于5％co2、95％湿度、37℃培养箱中培养，培养时间为24h。

在优选地的实施方案中，步骤2)所述细胞沉淀在六孔板上的接种细胞密度为1.5×10⁵个/孔。

在优选地的实施方案中，步骤1)所述高纯度真皮成纤维细胞的制备为以人包皮作为细胞来源，进行分离培养后再进行细胞传代和纯化获得。

在优选地的实施方案中，所述分离培养包括如下步骤：

a.包皮组织的收集

将500ml蓝盖瓶送至手术房，蓝盖瓶预先装有200mlhank’s平衡盐溶液作为采集液；

儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集液中，0-4℃条件下进行保存24-48h；

b.分离真皮组织

于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，pbs清洗3次，每次3min；

将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；

用pbs清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；

第二天取出皮肤组织，pbs漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；

用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，真皮组织放入pbs中漂洗3次；

c、真皮成纤维细胞原代培养：

用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；

用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：

将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁；

1h后，在六孔板中加入1ml真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；

1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1ml真皮成纤维细胞完全培养基；

真皮组织块贴壁培养3-5天后，可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代；

所述hank’s平衡盐溶液的制备方法如下：在200ml的hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素b2-3μg/m及300-500单位肝素钠。

在优选地的实施方案中，所述细胞传代和纯化，包括以下步骤：

a.去除原代培养的真皮成纤维细胞的培养基；

b.用无钙镁的pbs洗涤液进行洗涤；

c.每孔中加入1ml0.05％胰酶/edta，37℃孵育箱(5％co2、95％湿度)中消化1-2min；

d.倒置显微镜下观察细胞消化情况，待长梭形的真皮成纤维细胞变圆之后(此时表皮细胞依旧未见明显形态变化，牢固的贴在培养板底部)，每孔中加入2ml消化终止液终止消化；

e.轻柔吹打，使真皮成纤维细胞脱落并形成单细胞状态；

f.将细胞悬液收集在15ml离心管中，100rpm离心5min；

g.弃上清，加入成纤维细胞完全培养基重悬细胞，按1:3的比例对细胞进行传代：从3ml的细胞悬液中取1ml至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；

h.放入到5％co2、95％湿度、37℃培养箱中培养。

在原代培养的真皮成纤维细胞中，主要存在真皮成纤维细胞及表皮角质细胞两种细胞。这两种细胞在形态上存在差异，真皮成纤维细胞为典型的长梭形，表皮角质细胞呈典型的“铺路石”样上皮细胞形态。在两种细胞对胰酶的敏感性存在较大差别，真皮成纤维细胞用0.05％胰酶/edta溶液消化1min即可变圆，轻柔吹打即可从细胞培养皿底部脱落。而表皮角质细胞需经0.05％胰酶/edta消化10min钟才可以扁圆，从培养皿底部吹打脱落。我们利用这两种细胞的对胰酶敏感性的差异可对其进行纯化。

本发明的另一目的在于提供所述的一种人真皮成纤维细胞体外热损伤模型构建的方法在皮肤损伤修复及相关治疗药物筛选上的应用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果包括：

1、皮肤组织经中性酶消化后，可以去除大部分的表皮组织，剩余的真皮组织可以通过组织块贴壁法培养得到成纤维细胞，本发明提供了一种简单高效的从皮肤组织中分离、培养真皮成纤维细胞的方法；

2、利用真皮成纤维细胞及表皮角质细胞对胰酶敏感性的差异，通过不同的消化时间可以去除真皮成纤维细胞原代培养中存在的表皮角质细胞，提供了一种真皮成纤维细胞纯化的方法；

3、体外用43℃热水处理真皮成纤维细胞50min，热处理24h及48h可使的真皮成纤维细胞出现大量死亡，但又有较多的细胞存活，而41℃热处理50min对细胞活性影响极小，45℃热处理50min使得细胞在短时间内全部死亡。为体外研究皮肤烫伤提供了一种稳定可靠的热损伤细胞模型。

综上所述，本发明通过中性酶消化可将表皮从真皮组织上剥离，随后将真皮组织剪碎，贴壁培养可以得到真皮成纤维细胞。通过不同的胰酶消化时间，可以将原代培养中可能存在的表皮细胞去除，纯化真皮成纤维细胞。体外通过在43℃水浴锅中热处理50min可得到热损伤真皮成纤维细胞模型。本发明可以得到纯度极高的真皮成纤维细胞及其热损伤模型，为皮肤热损伤的治疗提供了真皮成纤维细胞及其热损伤模型。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是人真皮成纤维细胞p0代细胞显微镜照片；

图2是人真皮成纤维细胞p1代细胞显微镜照片；

图3是人真皮成纤维细胞p2代细胞显微镜照片；

图4是人真皮成纤维细胞p3代细胞显微镜照片；

图5是对照组真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；

图6是实验组2真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；

图7是实验组1真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片；

图8是实验组3真皮成纤维细胞24h和48h后显微镜照片。

具体实施方式

以下结合实施例进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例并不构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，除非另有指明均为常规方法，本发明所涉及原料和试剂除非另有指明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。

实施例1：原代人真皮成纤维细胞分离与培养方法

在获得小孩家族口头同意的前提下，从医院获得小孩包皮切除术废弃皮肤组织。仔细去除皮肤组织中的脂肪、血管及系膜后，pbs清洗皮肤。0.25％dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜，pbs漂洗终止消化。用眼科镊将表皮和真皮分离，随后用眼科剪将真皮组织完全剪碎。将剪碎的真皮组织贴壁在六孔板中，37℃孵育箱中倒置贴壁1h后，每孔中加入1mldfl细胞培养基。3-5天后有细胞爬出，待细胞汇合度达到80％时，采用胰酶/edta进行消化传代。

具体操作规程如下：

一、真皮组织的分离：

招募2-6周岁年龄段需做包皮环切手术的儿童，在完全自愿的前提下捐献皮肤组织。具体操作规程如下：

1.包皮组织的收集

将500ml蓝盖瓶送至手术房。蓝盖瓶预先装有200mlhbss(hank’s平衡盐溶液，hanks'balancedsaltsolution)的采集液，其中含有万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素b2-3μg/m及300-500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液。

上述hbss(hank’s平衡盐溶液)采集液的制备方法如下：

在200ml的hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素b2-3μg/m及300-500单位肝素钠；然后再按照常规程序于高温下进行灭菌。

儿童进行包皮切除手术之后，将皮肤组织放入上述采集瓶中。在得到捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养。样品在送往实验室之前必须在低温(0-4℃)条件下进行保存(保存期一般为24-48h)。

2.分离真皮组织

1)于实验室无菌超净台中取出皮肤组织，pbs清洗3次，每次3min；

2)将皮肤组织置于无菌培养皿中，用眼科剪及眼科镊仔细去除皮下脂肪组织、血管及系膜；

3)用pbs清洗剩余皮肤组织1次后，加入0.25％dispase中性蛋白酶，4℃冰箱中消化过夜；

4)第二天取出皮肤组织，pbs漂洗3次去除中性蛋白酶溶液，终止消化；

5)用眼科镊分别夹住皮肤的真皮组织及表皮组织，将表皮从真皮组织上剥离，将真皮组织放入pbs的漂洗3次；

三、真皮成纤维细胞原代培养：

真皮成纤维细胞完全培养基的成分如下：

33.6mlh-dmem基础培养基；

6ml胎牛血清(15％v/v)；

0.4ml双抗(含10,000u/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)；

真皮成纤维细胞完全培养基的配置方法如下：在无菌容器中加入33.6mlh-dmem基础培养基、6ml胎牛血清和0.4ml双抗(含10,000u/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％v/v)。充分混匀，4℃保存待用。

1)用眼科剪将真皮组织充分剪碎，使得真皮组织的直径不超过1cm；

2)用眼科镊仔细的将真皮组织逐块夹起，滤干水分，将其均匀展开贴放在六孔板的底部：

3)将六孔板放入37℃孵育箱中，倒置贴壁1h后；

4)在六孔板中加入1ml真皮成纤维细胞完全培养基，轻柔的将六孔板放入37℃孵育箱中进行培养；

5)1-2天后，待组织块完全贴牢在六孔板底部之后，每个六孔板中补加1ml真皮成纤维细胞完全培养基；

6)真皮组织块贴壁培养3-5天后，显微镜下可以观察到有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞增殖到一定密度后对细胞进行传代，显微镜照片见图1，在图中可以看出原代贴壁培养培养的真皮组织块在贴壁3-5天后，可见有大量的成纤维样细胞爬出(p0)，同时伴有“铺路石”样上皮细胞爬出。

四、真皮成纤维细胞传代及纯化：

1)去除上述原代培养步骤6)所得物中的培养液；

2)用无钙镁的pbs洗涤液进行洗涤；

上述无钙镁离子的pbs洗涤液的配制如下：

定容至1l于高压蒸汽灭菌(常规程序)后放入4℃冰箱保存待用。

3)每孔中加入1ml0.05％胰酶/edta，37℃孵育箱(5％co2、95％湿度)中消化1-2min；

4)倒置显微镜下观察细胞消化情况，待长梭形的真皮成纤维细胞变圆之后(此时表皮细胞依旧未见明显形态变化，牢固的贴在培养板底部)，每孔中加入2ml消化终止液终止消化；

5)轻柔吹打，使真皮成纤维细胞脱落并形成单细胞状态；

6)将细胞悬液收集在15ml离心管中，100rpm离心5min；

7)弃上清，加入成纤维细胞完全培养基重悬细胞，按1:3的比例对细胞进行传代：从3ml的细胞悬液中取1ml至一新的10cm培养皿中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；

8)放入到5％co2、95％湿度、37℃培养箱中培养；

9)每天观察细胞状态、汇合度及是否有表皮细胞污染。每2-3天传代细胞一次(即从步骤1)至步骤7))。

每次传代之后在显微镜下观察细胞状态，p1代细胞显微镜下照片见图2，在图中可以看出，p1代成纤维细胞中存在少量上皮细胞。p2代细胞显微镜下照片见图3，在图中可以看出，p2代成纤维细胞中只有极少量上皮细胞。p3代细胞显微镜下照片见图4，在图中可以看出，当成纤维细胞传至第3代时，细胞纯度达到100％，无其它类型细胞污染，细胞生长状态良好，增长迅速。

上述消化终止液的配置方法如下：

在36mlh-dmem基础培养基中加入4ml小牛血清。

实施例2：真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建

为构建真皮成纤维细胞体外热损失模型，我们先将生长状态良好的p3代羊膜干细胞消化并按1.5×10⁵个/孔的密度接种六孔板中，37℃5％co2孵育箱中培养。第二天，待细胞完全贴壁之后，换液去除未贴壁细胞及死细胞。预先将水浴锅的温度分别调至41℃、43℃及45℃进行实验。完全密封含有细胞的六孔板并将其分别置于不用温度的水浴锅中，热处理50分钟。热处理结束后，将六孔板从水浴锅中取出，并在超净台中打开培养皿，对细胞进行换液。热处理24h及48h后分别观察细胞生长状态及死亡情况。筛选出最适合体外构建真皮成纤维细胞的条件。

实验组1的具体操作规程如下：

一、真皮成纤维细胞的复苏：

挑取生长状态良好、纯度为100％的p3代真皮成纤维细胞进行复苏。具体操作规程如下：

1)取一无菌15ml离心管，加入5ml真皮成纤维细胞完全培养基；

2)打开水浴锅，将其温度设置为37℃；

3)从液氮罐中取出p3代真皮成纤维细胞，迅速将其置于水浴锅中，快速摇晃冻存管，使其快速溶解；

4)待冻存管中冰块剩绿豆大小时，将冻存管从水浴锅中取出，转移至超净台中；

5)用移液器将冻存管中溶解后的细胞悬液转移到离心管中，1000rpm离心5min；

6)离心过程中，在10cm培养皿中加入5ml完全培养基；

7)离心结束后，弃冻存管中上清，加入2ml完全培养基，重悬细胞；

8)将细胞悬液转移至10cm培养皿中，十字交叉法轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分布；

9)将培养皿置于含5％co2的37℃细胞培养箱中培养。

二、真皮成纤维细胞的接种：

待真皮成纤维细胞的汇合度达到80％-90％时，消化细胞并将其接种在6孔板中。具体操作规程如下：

1)pbs清洗细胞2次，加入1ml胰酶/edta溶液，37℃细胞培养箱进行消化。显微镜下观察细胞变为圆形后加入2倍体积终止液终止消化；

2)用移液枪轻柔吹打培养皿底部，将细胞吹下。随后将细胞悬液转移至15ml离心管中；

3)1000rpm离心5min后，弃上清，往离心管中加入2ml真皮成纤维细胞完全培养基，重悬细胞；

4)细胞计数，将真皮成纤维细胞以1.5×10⁵个/孔的密度接种六孔板中，37℃5％co2细胞培养箱孵育箱中培养；

5)第2天，待细胞贴壁后换液，去除死细胞及未贴壁细胞。随后进行热损失模型构建。

三、真皮成纤维细胞体外热损伤模型的构建

1)将水浴锅内水位高度调到刚好可没过六孔板底部位置，水温调至43℃；

2)用封口膜将接种有真皮成纤维细胞的六孔板完全封闭，放入43℃的水浴锅中热处理50min；

3)热处理之后，将培养板从水浴锅中取出，75％乙醇充分擦拭干净，在超净台中打开培养板；

4)吸弃上清，每孔中加入2ml新鲜皮肤细胞培养基，24h及48h后观察真皮成纤维细胞的增殖及凋亡情况并拍照，验证模型是否构建成功。

实验同时设置正常培养组细胞(与实验组1的不同之处在于，细胞未放入水浴锅进行热处理)作为对照组，实验组2(与实验组1的不同之处在于，步骤3)中水浴锅的温度为41℃)和实验组3(与实验组1的不同之处在于，步骤3)中水浴锅的温度为45℃)。

上述实验获得的细胞显微镜下照片见图5-8，在图5中，i为正常培养组细胞培养24h后照片，ii为正常培养组细胞培养48h后照片。

在图6中，iii为实验组2细胞培养24h后照片，iv为正常培养组细胞培养48h后照片，与对照组相比，细胞的增殖能力未见明显降低且未发现明显的细胞凋亡。

在图7中，v为实验组1细胞培养24h后照片，vi为正常培养组细胞培养48h后照片；与对照组相比，细胞密度显著降低，可见大量凋亡细胞，但仍可见存在较多活细胞。表明41℃热损伤50min可明显抑制皮肤细胞增殖并促进其凋亡，该条件适合于体外构建真皮成纤维细胞热损伤模型；

在图8中，vii为实验组3细胞培养24h后照片，viii为正常培养组细胞培养48h后照片。与对照组相比，细胞完全死亡，未见存活细胞。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。