葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体为葡萄早熟相关gdsl型酯酶/脂肪酶标志基因。

背景技术：

葡萄是世界上栽培最为广泛的果树之一，葡萄是世界性的水果，用途很广，不仅大量用以鲜食，还用来酿造不同类型的葡萄酒，加工成葡萄干、葡萄汁等。早熟葡萄是蒴果作物的一个重要属性，发展早熟葡萄生产促使葡萄提早上市，不仅迎合消费者喜好，更能提高葡萄经济效益推动农业生产发展。因此，研究葡萄早熟机制具有重要意义,早熟葡萄新品种“峰早”是“巨峰”的芽变，该品种果穗圆锥形、穗形中大，于河南省洛阳地区发现，浆果7月上旬成熟，成熟期比“巨峰”早30天左右。通过对葡萄品种“巨峰”与“峰早”发育特征比较分析，发现芽变与亲本间果胶甲酯酶(pe)活性和多聚半乳糖醛酸酶(pg)活性变化模式相一致，且芽变的pg酶活性增长速率均明显大于其亲本，这种变化幅度也与早熟芽变性状变化的幅度相关，所以pg酶活性增加加快了芽变品种的成熟软化，这可能是芽变比亲本早熟的原因之一，基于以上生理研究，我们用5-ac和h2o2处理“巨峰”葡萄，5-ac和h2o2都是已知可以有效促进果实成熟的试剂。通过比较这两种处理的转录组数据，分析结果表明gdsl型酯酶/脂肪酶(gelp)基因表达在这两种处理中均差异显著。可见，gelp基因家族在葡萄果实发育成熟中发挥重要作用。

gdsl酯酶/脂肪酶(gelp)广泛存在于各种生物当中，主要参与植物发育、形态发生、次生代谢产物合成和防御反应的调控。成熟的gelp与不同底物(包括酰基辅酶a、多种酯类和氨基酸衍生物)具有广泛的水解活性,并且gdsl酯酶与木聚糖去乙酰化和次生壁模式有关。在桃中报道2个gelp基因参与果实发育成熟，葡萄中与果实发育相关的gelp基因尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供葡萄早熟相关gdsl型酯酶/脂肪酶(gelp)标志基因，本发明通过对过氧化氢(h2o2)促早熟处理的后“巨峰”葡萄和未处理的“峰早”葡萄进行实时荧光定量处理，同时对葡萄果实发育相关的候选vvgelp基因的筛选，表明vvgelp76有可能发挥胞壁降解酶的功能在葡萄早熟机制中发挥重要作用，为深入了解葡萄中gdsl酯酶/脂肪酶(gelp)基因家族的功能和对葡萄早熟的深入研究提供理论依据。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：葡萄早熟相关gdsl型酯酶/脂肪酶(gelp)标志基因，包括如下步骤：

s1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄；

s2、实验组处理：将300mmol/l的h2o2均匀喷涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次喷施为开花后25天，第二次为开花后35天，每个过程重复三次，每次重复五棵树；

s3、收集材料：每次采样从上午9点开始，用锡纸包起来，立即放入液氮罐中；

s4、采集样本：每棵树随机抽取30个样本，记录果实发育的物候期数据，其中采样时间为葡萄果实发育关键时间点分别是2017年6月12日、6月21日、7月1日、7月12日；

s5、葡萄中gdsl型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定；

s6、多序列比对和系统发育分析；

s7、葡萄中gelp基因的表达分析；

s8、rna提取和实时荧光定量(qrt-pcr)；

s9、与葡萄果实发育相关的候选vvgelp基因的筛选：

(1)采用tiangen试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总rna；

(2)回收pcr产物；

(3)构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌；

(4)利用expasy在线分析工具对vvgelp76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。

优选的，s5中，从pfam网站中，下载gdsl型酯酶/脂肪酶结构域序列，利用隐马尔可夫模型软件hmmer进行比对搜索葡萄中的gelp基因，将得到的gelp基因蛋白序列用clustalx进行比对建立新的hmm文件，然后利用hmmer软件搜索葡萄中gelp基因，将得到的基因提交到smart和cdd网站进行结构认证，保留其中含有gelp保守结构域的的基因，数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“n”的个数大于全长的30％的基因，并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列，利用expasy在线分析工具对葡萄gelp基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。

优选的，s6中，用鉴定出的vvgelp基因蛋白序列与23个其他物种功能已知的gelp基因蛋白序列在mega7.0中构建系统发育树，并将参数设置为：homogeneouspattern；pairwisedeletion；bootstrap值1000。23个功能已知的gelp蛋白序列从uniprot数据库下载。

优选的，s7中，vvgelp基因的fpkm值来自rna-seq数据，数据处理过程：计算每次生物学重复平均fpkm值，并取值log10，利用软件r将数据可视化。

优选的，s8中，用多糖多酚植物总rna提取试剂盒对h2o2处理和对照的“巨峰”以及未处理“峰早”果实提取rna，随后用takara反转录试剂盒，反转录合成cdna，作为模板用于pcr扩增。

优选的，在采用tiangen试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总rna中，以总rna为模版，反转录合成cdna，利用primer3设计特异性引物，克隆vvgelp76基因全长的引物序列为：vvgelp76forward：aactgtggtcgtcttctcg，vvgelp76reverse：ccacgcatttctggatgatc，以反转录生成的cdna为模板与基因的简并引物进行pcr扩增，pcr扩增，反应程序为：95℃预变性3min；95℃20s，58℃30s，72℃30s，35个循环；最后，72℃延伸5min。

优选的，在回收pcr产物中，pcr扩增目的基因片段采用50μl体系，每个基因扩增两管，之后将相同两管pcr产物点进同一个胶孔内，切下目的基因位置凝胶，使用康为世纪胶回收试剂盒，回收胶之后立即进行t-a克隆。

优选的，在构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌中，大肠杆菌转化需预先配置lb培养基，实际用量：细菌培养用胰蛋白胨0.5g、细菌培养用酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、琼脂粉0.75g，50ml蒸馏水。

优选的，在利用expasy在线分析工具对vvgelp76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析中，用signalp-5.0进行信号肽分析，利用psortprediction进行亚细胞定位预测，用tmhmmserverv.2.0进行跨膜结构域分析。

本发明提供了葡萄早熟相关gdsl型酯酶/脂肪酶(gelp)标志基因，具备以下有益效果：

本发明通过对过氧化氢(h2o2)促早熟处理的后“巨峰”葡萄和未处理的“峰早”葡萄进行实时荧光定量展示vvgelp76基因在不同发育时期h2o2处理前后基因表达比对照显著上升，并且基因表达趋势与对照趋势一样且与转录组表达模式一致，说明vvgelp76基因在葡萄果实生长发育起到关键作用，可能参与葡萄早熟发育机制，同时对葡萄果实发育相关的候选vvgelp基因的筛选，表明vvgelp76有可能发挥胞壁降解酶的功能在葡萄早熟机制中发挥重要作用，为深入了解葡萄中gdsl酯酶/脂肪酶(gelp)基因家族的功能和对葡萄早熟的深入研究提供理论依据。

附图说明

图1为本发明的83个vvgelps基因和23个功能已知的其它物种的gelp基因聚类树；

图2为本发明的83个vvgelps基因rna-seq数据热图；

图3为本发明的vvgelp76与23个功能已知的其它物种的gelp基因聚类树；

图4为本发明的“巨峰”在不同发育时期h2o2处理前后vvgelp76基因相对表达量图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

如图1-4所示，本发明提供一种技术方案：葡萄早熟相关gdsl型酯酶/脂肪酶(gelp)标志基因，包括如下步骤：

s1、选取对照组：选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄，其中蒸馏水中包含0.03％silicon-wet-77表面活性剂；

s2、实验组处理：将300mmol/l的h2o2均匀喷涂在“巨峰”葡萄上，其中，第一次喷施为开花后25天，第二次为开花后35天，每个过程重复三次，每次重复五棵树；

s3、收集材料：每次采样从上午9点开始，用锡纸包起来，立即放入液氮罐中；

s4、采集样本：每棵树随机抽取30个样本，记录果实发育的物候期数据，其中采样时间为葡萄果实发育关键时间点分别是2017年6月12日、6月21日、7月1日、7月12日；

s5、葡萄中gdsl型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定：

从pfam网站(http://pfam.xfam.org/)中，下载gdsl型酯酶/脂肪酶结构域序列(pf00657，pf13472)，利用隐马尔可夫模型软件hmmer进行比对搜索葡萄中的gelp基因。将得到的gelp基因蛋白序列用clustalx进行比对建立新的hmm文件，然后利用hmmer软件搜索葡萄中gelp基因，将得到的基因提交到smart(http://smart.emblheidelberg.de/smart/batch.pl)和cdd(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)网站进行结构认证，保留其中含有gelp保守结构域的的基因，数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“n”的个数大于全长的30％的基因，并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列，葡萄基因组序列从ensembleplants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)下载，利用expasy在线分析工具(https://web.expasy.org/protparam/)对葡萄gelp基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析；

s6、多序列比对和系统发育分析：

用鉴定出的vvgelp基因蛋白序列(葡萄中gelp基因)与23个其他物种功能已知的gelp基因蛋白序列在mega7.0中构建系统发育树，参数设置为：homogeneouspattern,；pairwisedeletion；bootstrap值1000，23个功能已知的gelp蛋白序列从uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)下载；

s7、葡萄中gelp基因的表达分析：

vvgelp基因的fpkm值来自rna-seq数据(登录号，sra：prjna541089)。数据处理过程：计算每次生物学重复平均fpkm值，并取值log10。利用软件r将数据可视化；

s8、rna提取和实时荧光定量(qrt-pcr)：

用多糖多酚植物总rna提取试剂盒(tiagen)对h2o2处理和对照的“巨峰”以及未处理“峰早”果实提取rna，随后用takara反转录试剂盒，反转录合成cdna，作为模板用于pcr扩增，并运用软件primer5设计引物，引物见表1，以葡萄ubiquitin1基因(ca808925)为内参；ubiquitin1forward：gtggtattattgagccatcctt,ubiquitin1reverse：aacctccaatccagtcatctac；qrt-pcr反应使用takara公司生产的rr820a试剂盒；反应体系为：12.5μl的sybrpremixextaqii，正向引物反向引物各1μl，ddh2o9.5μl，cdna模板1μl；反应程序：95℃，30s；95℃，5s，56℃，30s，40个循环；

表1

s9、与葡萄果实发育相关的候选vvgelp基因的筛选：

根据s6和s8的系统发育树图和热图以及荧光定量可筛选出vvgelp76为参与葡萄果实发育成熟的候选基因，用vvgelp76与23个其他物种功能已知的gelp基因蛋白序列在mega7.0中构建系统发育树，对vvgelp76(id号：vit_18s0001g14800)基因全长cdna进行分离；

(1)采用tiangen试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”果实总rna；以总rna为模版，反转录合成cdna，利用primer3设计特异性引物；克隆vvgelp76基因全长的引物序列为：vvgelp76forward：aactgtggtcgtcttctcg，vvgelp76reverse：ccacgcatttctggatgatc；以反转录生成的cdna为模板与基因的简并引物进行pcr扩增；pcr扩增，反应程序为：95℃预变性3min；95℃20s，58℃30s，72℃30s，35个循环；最后，72℃延伸5min；

(2)回收pcr产物；pcr扩增目的基因片段采用50μl体系，每个基因扩增两管，之后将相同两管pcr产物点进同一个胶孔内，切下目的基因位置凝胶，使用康为世纪胶回收试剂盒，回收胶之后立即进行t-a克隆；(t-a克隆试剂用量：凝胶回收产物4.5μl、vector0.5μl、solutioui5μl)；

(3)构建载体并与目的基因连接，将重组后的载体质粒转入大肠杆菌；大肠杆菌转化需预先配置lb培养基，实际用量：细菌培养用胰蛋白胨0.5g、细菌培养用酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、琼脂粉0.75g，50ml蒸馏水；使用上海唯地生物技术有限公司生产的感受态细胞进行大肠杆菌转化实验，摇菌培养后进行pcr扩增阳性克隆，pcr扩增产物做凝胶电泳实验，如图4，确定大肠杆菌转化结果是否为目的基因条带，最后将最终菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到“巨峰”和“峰早”vvgelp76基因的编码序列seqidno.1和seqidno.2；

(4)利用expasy在线分析工具(http://www1expasy1ch/tools/pi_tool.html)对vvgelp76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析；用signalp-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)进行信号肽分析，利用psortprediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)进行亚细胞定位预测，用tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/)进行跨膜结构域分析。

结果

vvgelp76在“巨峰”和“峰早”测序长度分别为1066bp和1114bp，且两品种序列相似度为99.24％。在两品种中，预测vvgelp76编码的蛋白质的分子量为39.91kda，等电点(pi)为5.42。信号肽分析没有信号肽为非分泌型蛋白，亚细胞定位分析vvgelp76在内质网膜上，跨膜结构域分析vvgelp76不含有跨膜结构。实时荧光定量展示vvgelp76基因在不同发育时期h2o2处理前后基因表达比对照显著上升，并且基因表达趋势与对照趋势一样(图2，图4)且与转录组表达模式一致。说明vvgelp76基因在葡萄果实生长发育起到关键作用，可能参与葡萄早熟发育机制。同时系统发育树(图1，图3)表示vvgelp76与exl4聚类在同一枝上，bootstrap值为99％，exl4为拟南芥花粉外壳蛋白胞外脂肪酶，说明vvgelp76有可能发挥胞壁降解酶的功能在葡萄早熟机制中发挥重要作用。为深入了解葡萄中gdsl酯酶/脂肪酶(gelp)基因家族的功能和对葡萄早熟的深入研究提供理论依据。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>河南科技大学

<120>葡萄早熟相关gdsl酯酶/脂肪酶标志基因

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1066

<212>dna

<213>k-76gene

<400>1

aactgtggtcgtcttcttcgattattgttttctttctttctgtttttattattttatgta60

ccacagaagctctcgtaaagctaccgaggaacgaaacaattccagcagtgctagttttcg120

gagattcgatagtggatccgggcaataacaacaatcttaatactctgattaagtgcaatt180

ttccaccgtatgggagggacttaatgggaggagttccaactggaagatttagcaatggaa240

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