本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种新型幽门螺杆菌培养方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是1983年由澳大利亚学者巴里·马歇尔(barryj.marshall)和罗宾·沃伦(j.robinwarren)首次从胃黏膜组织中分离得到的一种革兰氏阴性杆菌，在胃黏膜定植，与上消化道疾病，如十二指肠溃疡、胃溃疡、消化不良、胃非霍奇金氏淋巴瘤甚至胃癌的发生有关。因此，有效根除幽门螺杆菌对治疗消化道疾病、预防胃癌发生非常重要。但幽门螺杆菌治疗存在耐药问题，临床根除治疗的效果受到抗生素耐药的影响，这个问题严重困扰临床医生。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种全新的培养幽门螺杆菌的方法，为研究幽门螺杆菌的抗生素耐药性测试提供活体菌株。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
一种新型幽门螺杆菌培养方法，包括以下步骤：
s1，将1-1000mg磁微粒、1-100ml缓冲液与0.1-100mg抗体溶液充分混合后，加入交联剂，于室温下反应2-4h，获得包被抗体的磁微粒溶液；
s2，将0.01-1g携带有幽门螺杆菌的样本加入至0.01-100ml所述磁微粒溶液，混合1-20min，震荡离心，弃上清液，得到待培养物；
s3，将所述待培养物均匀涂于培养基表面，在35-38℃、co2体积分数为,1-15％的环境下，培养2-7天，得到样本菌落；
s4，对所述样本菌落进行细菌鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功；
所述缓冲液浓度为10-100mm。
在其他实施例中，也可以通过离心或磁力吸引方式沉淀下来，
其进一步地技术方案为，所述磁微粒携带羧基。
其进一步地技术方案为，所述缓冲液选自mes、mopso、mops、hepes、pbs缓冲液中的至少一种，ph3.0～10.0。
其进一步地技术方案为，所述交联剂选自edc/edac、n-羟基琥珀酰亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾中的一种或多种的组合。
其进一步地技术方案为，所述样本选自胃粘膜组织、胃液或粪便的一种或多种。
其进一步地技术方案为，所述抗体溶液可识别幽门螺杆菌表面的抗原，所述抗原包括尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶中的至少一种。
其进一步地技术方案为，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
其进一步地技术方案为，所述培养基为液体培养基或固体培养基。
其进一步地技术方案为，所述步骤s4中，对所述样本菌落进行细菌鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功，具体采用以下方法进行细菌鉴定：对样本菌落同时进行尿素酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验，三个试验结果都呈阳性，则说明所述样本菌落为幽门螺杆菌，判定幽门螺杆菌培养成功。
其进一步地技术方案为，所述步骤s4中，对所述样本菌落进行细菌鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功，还包括对所述样本菌落进行形态学鉴定。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
本发明首次利用偶联抗体的磁微粒捕获样本中的幽门螺杆菌，并保持幽门螺杆菌的活性状态进行培养，与现有技术相比，本申请采用特异性识别幽门螺杆菌表面抗原的单抗/多抗和磁微粒富集技术，显著提高了活体幽门螺杆菌的聚集数量，有利于后续的扩增培养和其他检测，具有一定的临床应用前景。
具体实施方式
下面将结合对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
本发明提供一种新型幽门螺杆菌培养方法，包括以下步骤：
s1，将1-1000mg磁微粒、1-100ml缓冲液与0.1-100mg抗体溶液充分混合后，加入交联剂，于室温下反应2-4h，获得包被抗体的磁微粒溶液；
s2，将0.01-1g样本加入至0.01-100ml所述磁微粒溶液，混合1-20min，震荡离心，弃上清，得到待培养物；
s3，将所述待培养物均匀涂于培养基表面，在35-38℃、co2体积分数为,1-15％的环境下，培养2-7天，得到样本菌落；
s4，对所述样本菌落进行细菌鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功；
所述缓冲液浓度为10-100mm。所述磁微粒携带羧基。
需要说明的是，本发明提供的磁微粒溶液用于捕捉样本中的幽门螺杆菌，其含有可识别幽门螺杆菌表面抗原的抗体，抗体通过化学键联的方法偶联于磁微粒表面，含羧基的磁微粒通过化学交联剂在交联缓冲液中与抗体的氨基形成酰胺键连接，获得成功包被抗体的磁微粒。
抗体用于识别幽门螺杆菌表面抗原，这些表面抗原包括但不局限于尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶等，可以是通过幽门螺杆菌表面抗原制备的单克隆或多克隆抗体。
本发明提供的包被抗体的磁微粒可以高效捕捉到样本中的活体幽门螺杆菌，又不破坏幽门螺杆菌的结构和活性，利于富集菌量和扩增培养。
目前幽门螺杆菌的耐药情况普遍，临床上根除幽门螺杆菌的治疗方法是以质子泵抑制剂、铋剂为基础的三联或四联疗法，这两种疗法是得到广泛公认的治疗方案。治疗幽门螺杆菌的抗生素一般选择阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、呋喃唑酮、左氧氟沙星、四环素等，但是随着抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌的耐药菌株也逐渐增多，导致治疗失败。为了减少幽门螺杆菌的抗生素耐药率，建议个体化根除幽门螺杆菌，其中包括对幽门螺杆菌进行培养和药敏检测后，根据药敏结果选择抗生素。
利用本发明提供的方法培养出来的活性幽门螺杆菌可以用于药敏分析和基因分析等临床应用。例如，可以用于多种抗生素(阿莫西林，克拉霉素，甲硝唑，左氧氟沙星，呋喃唑酮，四环素，利福平、替硝唑、头孢克肟、多西环素)的耐药性测试。
实施例1：
磁微粒溶液的制备：100mg含羧基的磁微粒在5mlmes缓冲液中(50mm,ph6.0)，与5mg抗体溶液充分混合，然后加入100mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于混合液中，室温下反应2～4h，获得成功包被抗体的磁微粒溶液。
样本的分离、细菌培养与鉴定：在胃镜室用无菌活检钳在胃窦部位钳取胃粘膜活检组织标本2-3块，迅速挑进偶联抗体磁微粒溶液中震荡10分钟后离心，弃掉上清后，把磁微粒涂于固体培养基表面，放入二氧化碳培养箱中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为10％。3-7天后观察菌落形态：长出的菌落全部为针尖水滴样菌落，半透明状。对菌落扩增后进行尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶实验鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功。
细菌鉴定方法如下：
(1)尿素酶鉴定：滴2滴尿素溶液(100mm)和2滴酚红溶液(0.1g/l)至八排管孔内，再加20μl菌液吹打混匀，观察颜色变化情况。若10分钟内由淡黄色变成红色或者紫罗兰色，说明尿素酶试验结果呈阳性，所述样本菌落为幽门螺杆菌，判定幽门螺杆菌培养成功。若10分钟内没有颜色变化，则培养结果为阴性。
(2)氧化酶鉴定：将底物四甲基苯二胺溶于纯化水中(浓度为1mg/ml)，加入20μl菌液吹打混匀。若5分钟内变成蓝色，说明氧化酶试验结果呈阳性，所述样本菌落为幽门螺杆菌，判定幽门螺杆菌培养成功。若5分钟内没有颜色变化，则培养结果为阴性。
(3)过氧化氢酶鉴定：将底物过氧化氢溶液(浓度为1％)与20μl菌液吹打混匀，观察气泡情况。若3分钟内有大量气泡产生，说明过氧化氢酶试验结果呈阳性，所述样本菌落为幽门螺杆菌，判定幽门螺杆菌培养成功。若3分钟内没有气泡变化，则培养结果为阴性。
本发明培养成功的幽门螺杆菌可用于药敏试验，指导临床医生精准使用抗生素，根治幽门螺杆菌。例如，
将培养成功的幽门螺杆菌用无菌生理盐水洗脱下来，接种至药敏检测试剂盒中(一种测定幽门螺杆菌药敏及抗生素最小杀菌浓度的试剂盒，专利号：zl201621132807.1)，包含：阿莫西林(0.5mg/l和1mg/l)、克拉霉素(0.5mg/l和1mg/l)、甲硝唑(4mg/l和8mg/l)、左氧氟沙星(0.5mg/l和1mg/l)、呋喃唑酮(0.5mg/l和1mg/l)、四环素(2mg/l和4mg/l)、利福平(0.5mg/l和1mg/l)、替硝唑(4mg/l和8mg/l)、头孢克肟(0.5mg/l和1mg/l)、多环西素(2mg/l和4mg/l)。培养3天以上，将底物四甲基苯二胺溶于纯化水中(浓度为1mg/ml)，混匀配制成底物反应液，在每个微孔中加入50μl底物反应液，通常10分钟即可辨别出微孔中的变色情况。若变蓝色，说明幽门螺杆菌生长。若不变色，证明幽门螺杆菌不生长。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于样本的分离、细菌培养与鉴定的步骤：
通过吞入取样线到胃部，取样线浸入胃液，将取样线取出后放入偶联抗体磁微粒溶液中震荡10分钟后离心，弃掉上清后，把磁微粒涂于固体培养基表面，放入二氧化碳培养箱中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为10％。3-7天后观察菌落形态：长出的菌落全部为针尖水滴样菌落，半透明状。对菌落扩增后进行尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶实验鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于样本的分离、细菌培养与鉴定的步骤：
通过粪便取样器取少量新鲜粪便，将粪便提取液与偶联抗体磁微粒溶液混合震荡10分钟后离心，弃掉上清后，把磁微粒涂于固体培养基表面，放入二氧化碳培养箱中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为10％。3-7天后观察菌落形态：长出的菌落全部为针尖水滴样菌落，半透明状。对菌落扩增后进行尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶实验鉴定，确定幽门螺杆菌培养成功。
需要说明的是，本发明提供的磁微粒溶液用于捕捉样本中的幽门螺杆菌，其含有可识别幽门螺杆菌表面抗原的抗体，抗体通过化学键联的方法偶联于磁微粒表面，含羧基的磁微粒通过化学交联剂在交联缓冲液中与抗体的氨基形成酰胺键连接，获得成功包被抗体的磁微粒。
抗体用于识别幽门螺杆菌表面抗原，这些表面抗原包括但不局限于尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶等，可以是通过幽门螺杆菌表面抗原制备的单克隆或多克隆抗体。
本发明提供的包被抗体的磁微粒可以高效捕捉到样本中的活体幽门螺杆菌，又不破坏幽门螺杆菌的结构和活性，利于富集菌量和扩增培养。
目前幽门螺杆菌的耐药情况普遍，临床上根除幽门螺杆菌的治疗方法是以质子泵抑制剂、铋剂为基础的三联或四联疗法，这两种疗法是得到广泛公认的治疗方案。治疗幽门螺杆菌的抗生素一般选择阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、呋喃唑酮、左氧氟沙星、四环素等，但是随着抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌的耐药菌株也逐渐增多，导致治疗失败。为了减少幽门螺杆菌的抗生素耐药率，建议个体化根除幽门螺杆菌，其中包括对幽门螺杆菌进行培养和药敏检测后，根据药敏结果选择抗生素。
利用本发明提供的方法培养出来的活性幽门螺杆菌可以用于药敏分析和基因分析等临床应用。例如，可以用于多种抗生素(阿莫西林，克拉霉素，甲硝唑，左氧氟沙星，呋喃唑酮，四环素，利福平、替硝唑、头孢克肟、多西环素)的耐药性测试。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。