一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法与流程

本发明涉及杂交种子纯度鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的ssr引物及方法。

背景技术：

萝卜(raphanussativusl.)为十字花科(brassi-caceae)萝卜属(raphanus)蔬菜，在中国常年栽培面积仅次于大白菜，在农业生产中占有重要地位。萝卜的种植区域广泛，种植品种多，干制加工型萝卜是秋冬季云南山区重要的特色农业支柱产业，依托云南独特的气候优势得以迅速发展。据统计，2018年云南省萝卜种植面积约为110万亩，主要种植于曲靖、昭通、楚雄、红河等地区。近年来随着云南省加工型萝卜条的外销和出口产值不断提高，对加工型萝卜的条形和品质也提出了更高的要求，选育出产量高、品质优的加工型萝卜品种也变得更为迫切。云萝卜2号是云南省农业科学院园艺作物研究所选育运用雄性不育技术获得的杂交一代干制加工型萝卜品种，具有肉质根皮、肉白色、根型长直、干物质含量高、抗病性强、加工品质优良等优点，已在云南省楚雄州、红河州、陆良县等干制加工基地规模化推广种植，随着该品种种植面积的不断扩大，种子需求量和制种面积也相应增加。云萝卜2号杂交种生产过程中，父母本按照一定比例分行种植，并与其他品种或者类型的十字花科作物保持2000m以上的隔离距离；母本植株开花后拔出混杂的可育株，利用昆虫等传粉媒介或者人工辅助授粉的方式，获得杂交种子。但制种时母本中可育株未完全去除、田间隔离措施不完善、收获前父本没有及时拔出、收获后其他品种混入都会导致假杂种的产生。目前田间小区种植鉴定是干制加工型萝卜种子纯度鉴定的主要手段，存在工作量大、周期长、易受经验和环境影响等缺点，可能错过杂交种最佳的销售和播种时间。

因此，寻找一种准确、快速的鉴定杂交种纯度的方法是非常重要的，有利于云萝卜2号的进一步推广应用。

技术实现要素：

为了解决上述相关领域中的不足，本发明提供一种用于云萝卜2号杂交种子纯度鉴定的ssr引物ssr06及其鉴定方法。

本发明的一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的ssr引物及方法是通过以下技术特征实现的：

一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的ssr引物，其特征在于，所述ssr引物为ssr06，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示。

引物ssr06的上游引物和下游引物的具体单链dna序列从5’到3’端分别为：

上游引物：gaagcagatgattgcaaaacc(seqidno:1)；

下游引物：catccgttttgaagatggaaa(seqidno:2)。

一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1，提取待测样品云萝卜2号杂交种基因组dna；

步骤2，以步骤1所提取的云萝卜2号杂交种基因组dna作为模板，采用所述ssr引物ssr06进行pcr扩增；

步骤3，将步骤2中的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；

步骤4，利用步骤3的统计结果计算云萝卜2号杂交种的纯度。

进一步地，步骤1采用ctab法提取云萝卜2号父本材料wr01、母本材料ws01，杂交种f1的叶片基因组dna。

进一步地，步骤3扩增产物的检测包括：

步骤i，将步骤2的扩增产物中加入2μl上样缓冲液，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每个样孔点2μl，dl50dnamarker为对照，180v恒压下电泳90min；

步骤ii，电泳结束后，将凝胶剥下在固定液中浸泡10min，取出用双氧水冲洗一次，在0.1％agno3溶液中银染10min，取出用双氧水快速冲洗2次，随后浸泡在于显影液显影10min，直至可以观察到dna条带；

步骤iii，立即用双氧水漂洗，平铺放在观察灯上统计带型并拍照编号保存；

步骤v，比较云萝卜2号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型为云萝卜2号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种。

进一步地，所述云萝卜2号杂交种的纯度是通过以下方式进行计算的：

送检测云萝卜2号纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数)/总检测种子粒数×100％。

进一步地，步骤2中pcr扩增时，反应体系包括:10μl2×taqplusmastermixii，7μlddh20，1μl模板dna，上游引物ssr06-f和下游引物ssr06-r各1μl。

进一步地，步骤2中pcr扩增时的pcr反应程序为：95℃预变性5min；30个扩增循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s；72℃延伸5min。

进一步地，步骤1中提取云萝卜2号父本材料wr01、母本材料ws01，杂交种f1的叶片基因组dna的步骤包括：

步骤a，取幼嫩叶片100mg放入1.5ml离心管中，加入液氮用研磨棒研磨，加200μl2％ctab提取缓冲液，研磨，后补齐至700μl，65℃水浴40min；

步骤b，加入氯仿和异戊醇共700μl，其中v氯仿：v异戊醇＝24:1，轻摇5min，后12000rpm离心10min；

步骤c，取250μl上清，加入250μl预冷的异丙醇混匀，-20℃放置冷藏30min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μl预冷乙醇，轻轻混匀，12000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；

步骤d，加100μlte溶解dna，室温放置1h；

步骤e，用te将dna稀释到50ng/μl后作为pcr模板使用或-20℃冷藏保存备用。

进一步地，所述固定液为0.02％冰醋酸和99％酒精混合液。

进一步地，所述显影液为3％naoh与0.5％甲醛混合液。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明中的ssr引物ssr06特异性高，标记重复性好，条带清晰，能够准确鉴定云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种子的纯度；

2)该检测方法快捷、简便、稳定、可靠、成本低，可在3-4h之内完成云萝卜2号种子纯度鉴定工作，有利于云萝卜2号杂交种高效准确的质量控制。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为部分设计引物在云萝卜2号亲本间进行筛选获得条带的情况，其中ssr06引物在云萝卜2号亲本间可获得特异性条带；

图2为利用本发明检测云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；其中m表示marker，p1为云萝卜2号父本，p2为云萝卜2号母本，f1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中的部分检测结果(三角形所示为云萝卜2号假杂交种样品)；

图3为利用本发明检测1号制种基地生产的云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；其中m表示marker，p1为云萝卜2号父本，p2为云萝卜2号母本，f1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中的部分检测结果；

图4为利用本发明检测2号制种基地生产的云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；其中m表示marker，p1为云萝卜2号父本，p2为云萝卜2号母本，f1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中的部分检测结果(三角形所示为云萝卜2号假杂交种样品)；

图5为利用本发明检测3号制种基地生产的云萝卜2号干制加工型萝卜杂交种获得的特异性条带；其中f1表示100份已检测云萝卜2号杂交种中的部分检测结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

本发明采用的云萝卜2号母本材料ws01是2010年选育定型的干制加工型萝卜细胞质雄性不育系，其不育基因来源于韩国鲜食型白萝卜材料krs-1，50a不育性稳定，经套袋自交和花粉粒显微观察检测，以及多年田间调查，其不育度和不育株率均稳定达到100％。生长期90-100d，叶色深绿，叶柄淡绿，羽状浅裂叶18片左右，叶片刺毛少；肉质根长圆柱形，根形长直，出土部分2/3，表皮为黄绿色，入土部分1/3，表皮为白色，肉色白色。肉质根长36cm左右，横径9cm左右，90d单株肉质根重2kg左右。耐抽薹性较好，抗病毒病，较耐霜霉病和软腐病。本发明采用的父本材料wr01是2005年以耐病总太f3选株与云南三月萝卜杂交，经连续6代自交系统选育成的加工型白萝卜优良自交系，生长期90-100d左右，基生叶4-5片下垂，顶生叶16片直立，羽状浅裂叶，叶色深绿，叶柄浅绿，肉质根长圆柱形，根形长直，出土部分2/3，表皮为黄绿色，入土部分1/3，表皮为白色，肉色白色。肉质根长38cm左右，横径8cm左右，90d单株肉质根重1.5kg左右。耐抽薹性好，抗病毒病，较耐霜霉病和软腐病。

实施例1

本实施例提供一种用于云萝卜2号杂交种子纯度鉴定的ssr引物ssr06，其筛选过程如下：

根据萝卜基因组信息，设计200对引物在云萝卜2号亲本间进行筛选，获得具有共显性差异标记条带的引物对ssr06(图1)，该标记重复性好，条带清晰，序列如下：

上游引物：gaagcagatgattgcaaaacc(seqidno:1)

下游引物：catccgttttgaagatggaaa(seqidno:2)。

实施例2

本实施例提供一种用于云萝卜2号杂交种子纯度鉴定方法，包括以下步骤：

1)基因组dna的提取:

将云萝卜2号杂交种子浸种12小时，露白后播种于穴盘中，置于光照培养箱，待萌发后，取下胚轴置于1.5ml离心管中，加入液氮用研磨棒研磨，加200μl2％ctab提取缓冲液，研磨，后补齐至700μl，65℃水浴40min；

加入氯仿和异戊醇共700μl，其中v氯仿：v异戊醇＝24:1，轻摇5min，然后12000rpm离心10min；

取250μl上清，加入250μl预冷的异丙醇混匀，-20℃放置30min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μl预冷乙醇，轻轻混匀洗净，12000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；

加100μlte溶解dna，室温放置1h；

用te将dna稀释到50ng/μl，作为pcr模板使用或-20℃保存备用。

2)pcr扩增:

以所提取的云萝卜2号杂交种基因组dna作为模板，采用分子标记特异性引物对srr06进行pcr扩增，获得扩增产物，如杂交种获得3条扩增条带，大小介于50-100bp之间，如图2-4中f1所示。

其中pcr反应体系为:10μl2×taqplusmastermixii，7μlddh20，1μl模板dna，上游引物和下游引物ssr06-r各1μl；

pcr反应程序为：95℃预变性5min；30个扩增循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min25s；72℃延伸5min。

3)扩增产物的检测：

在扩增产物中加入2μl上样缓冲液，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每个样孔点2μl，dl50dnamarker为对照，180v恒压下电泳90分钟；

电泳结束后，将凝胶剥下在固定液(0.02％冰醋酸和99％酒精混合液)中浸泡10min，取出用双氧水冲洗一次，在0.1％agno3溶液中银染10min，取出用双氧水快速冲洗2次，随后浸泡在于显影液(3％naoh与0.5％甲醛混合液)显影10min，直至可以观察到dna条带；

立即用双氧水漂洗，平铺放在观察灯上统计带型并拍照编号保存；

比较云萝卜2号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型为云萝卜2号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种。

4)数据统计：

选择在云萝卜2号杂交种及其双亲中表现共显性互补带型的引物用于杂交种纯度鉴定。

供试云萝卜2号杂交种纯度：送检测云萝卜2号杂交种纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数)/总检测种子粒×100％，通过对100份云萝卜2号杂交种进行检测，有1份f1材料的条带呈现父本类型，根据上述公式计算得到云萝卜2号杂交种纯度为99％，如图2所示。

实施例3

不同制种基地生产的云萝卜2号杂交种纯度检测情况

利用ssr引物ssr06对来自3个制种基地农户生产的各100粒云萝卜2号萝卜杂交种进行pcr检测。

结果如表1所示，1号和3号制种基地云萝卜2号杂交种纯度为100％(图3，图5)；2号制种基地云萝卜2号杂交种纯度为99％，如图4中显示，具有父本带型的种子数有1个(三角形所示的条带)为非杂交种，其余种子均为云萝卜2号杂交种。

表1不同制种基地生产的云萝卜2号杂交种纯度检测情况

对比例

传统方法鉴定云萝卜2号杂交种纯度

将实施例2中所用的材料播种于大田进行常规管理，约90天后，根据叶型、叶色、开展度和肉质根的大小、性状、皮色及肉色等综合性状，与父本、母本材料做比较，判断待检测材料是否为杂交种材料，结果为：100株待检测材料中，99株为杂交种，1株与云萝卜2号父本材料相同，检测结果与分子标记的检测结果一致。

由此可见，利用本发明中的ssr分子标记检测云萝卜2号杂交种纯度获得的结果与田间小区种植鉴定获得的检测结果一致，本发明省事省力，可以利用该方法对云萝卜2号一代杂交种进行纯度鉴定。