一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用的制作方法

本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用，是一个参与桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇生物合成的基因及应用。

背景技术：

萜类途径挥发性物质是植物种类最为丰富的次生代谢产物，在生长发育过程中具有重要作用。芳樟醇是一种线性的单萜醇，具有花香、甜香和醇香，是很多果实和花香气的重要来源。此外，芳樟醇在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。芳樟醇是重要的化学信息素，可吸引植物取食害虫的天敌或直接作为一些蚜虫的驱虫剂，也具有一定抗菌作用。

桃(prunuspersica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。桃作为重要的大众经济水果，其基因组较小，可以作为蔷薇科植物研究的模式材料。芳香是影响果实消费的重要品质，芳樟醇是桃果实香味形成的重要物质基础。因此，鉴别参与芳樟醇合成关键基因具有重要生物学和产业意义。

芳樟醇是单萜(c10)类化合物，主要在质体中通过甲基赤藓醇磷酸(mep)途径合成，其前体物质是牻牛儿基二磷酸(gpp)。萜类合成酶tps是芳樟醇生物合成途径的末端酶，已经在番茄，苹果，葡萄，猕猴桃，小苍兰等多个物种上有研究。对于芳樟醇等萜类物质而言，它可以由多个tps催化合成。同时，tps蛋白可以催化gpp生产多个产物。tps基因包括多个家族成员，由于萜类物质代谢的复杂性，参与桃果实芳樟醇生物合成的tps基因有待进一步鉴别。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，所述基因是pptps3基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。所述pptps3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.4所示。

该基因的特征功能如下：

1.基因的表达特征：在不同品种的桃果实，果实的不同发育阶段和不同组织中，pptps3的基因表达都与芳樟醇的含量呈正相关关系。在花叶果等组织中，pptps3在果实中表达量最高，见实施例1。

2.基因的功能特征：在大肠杆菌中表达pet6xhn-n-pptps3重组载体从而得到重组蛋白，检测蛋白活性结果证明pptps3编码的蛋白能将牦牛儿基二磷酸(gpp)转化为单萜类挥发性物质芳樟醇，见实施例2。

本发明的另一个目的是提供所述pptps3基因在基因工程中的应用，是开展基因工程和改良育种的重要候选基因，可改善果实的芳香品质和提高抗性能力。通过将pgreenii002962-sk-pptps3重组载体和pbi121-pptps3重组载体分别在桃果实和番茄果实中过量表达，结果证明pptps3编码的蛋白能够促进芳樟醇的积累，见实施例3和实施例4。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一个参与桃芳樟醇生物合成的基因pptps3,所述pptps3基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述pptps3的pcr扩增的上游引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列；所述pptps3的pcr扩增的下游引物序列如seqidno.3所示。

本发明提供了上述方案所述基因pptps3编码的蛋白质含有535个氨基酸，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供了一种包含上述方案所述基因pptps3的重组载体，所述重组载体优选的以pet6xhn-n(clonetech，takara)为原始载体，在pet6xhn-n的多克隆位点插入基因pptps3。

本发明还提供了一种包含上述方案所述基因pptps3的体外重组蛋白。

本发明还提供了所述基因pptps3的蛋白在体外合成芳樟醇的应用。

本发明还提供了所述的基因pptps3在桃果实和番茄果实中合成芳樟醇的应用。

本发明还提供了上述方案所述的基因pptps3在桃育种中的应用，所述应用优选为基因pptps3在桃果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一个来源于桃的基因pptps3，并证明其重组蛋白具有催化合成芳樟醇的活性。本发明中，桃果实的pptps3基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。体外功能验证表明，重组蛋白pptps3能够以gpp为底物催化合成芳樟醇。在桃果实中过量表达pptps3，显著促进了芳樟醇含量的增加。在番茄果实中采用遗传转化技术过量表达pptps3也显著提升了芳樟醇的积累。所述pptps3可显著促进芳樟醇生物合成，是利用基因工程和育种技术改善桃果实芳香品质的重要基因。本发明利用基因工程方法过量表达该基因，显著促进了桃果实和番茄果实的芳樟醇含量。本发明对于利用基因工程提高芳樟醇含量，提升桃果实芳香品质，具有重要应用价值。

附图说明

图1：不同桃品种果实的pptps3表达与芳樟醇含量。

图2：桃果实成熟过程中的pptps3表达与芳樟醇含量。

图3：重组蛋白pptps3催化gpp产生芳樟醇。

图4：过表达pptps3显著提高了桃果实芳樟醇含量。

图5：过量表达pptps3显著提高了转基因番茄果实芳樟醇含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述，但实施例不限制本发明保护范围。

实施例1桃pptps3的表达与芳樟醇含量具有正相关关系

(一)实验方法

1.桃果实材料

采集九个桃品种果实的成熟期样品，包括‘光核桃’(ght)，‘红根甘肃桃’(hggst)，‘红花山桃’(hhst)，‘早上海水蜜’(zshsm)，‘富阳赤月’(fycy)，‘红蟠1号’(hp1)，‘红蟠2号’(hp2)，‘湖景蜜露’(hjml)和‘丹霞’(dx)。‘湖景蜜露’桃果实分别在第一次快速生长期(花后34天，34dab)，硬核期(71dab)，第二次快速生长期(94dab)，成熟期(108dab)和完熟期(111dab)取样。设置三个生物学重复，每个重复包含5个果实，果肉组织经液氮冷冻后于-80℃保存待用。

2.rna提取和cdna合成

利用ctab法提取果实组织总rna，利用primescript^tmrtreagetkitwithgdnaeraser(takara)试剂盒去除基因组残留dna并将rna逆转录合成单链cdna。

3.基因表达测定

qpcr以桃pptef2(seqidno.5和seqidno.6)为内参基因，pptps3引物序列为seqidno.7和seqidno.8。qpcr反应体系总体积为20μl，包括上下游引物(10pm)各lμl，2μlcdna(或以h2o作为阴性对照)，10μlssofastevagreensupermix染料(bio-rad)和6μlh2o。pcr程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为bio-radcfx96(rio-rad，hercules，ca，美国)实时荧光定量pcr仪。

不同成熟阶段桃果实的rna为材料，送由百迈克生物科技有限公司进行开展转录组测序，分析pptps3的表达模式。

4.桃果实挥发性芳樟醇含量分析

取样后的桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，加入3ml200mmedta溶液、3ml20％cacl2溶液及30μl的内标2-辛醇(0.8mg/ml)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(pdms-dvb)萃取头(supelcoco.)进行30min固相微萃取。萃取头在gc-ms(agilent7890-5975)进样口解吸附5min后用db-wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，j&wscientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃·min^-1速率升至100℃,然后再以5℃·min^-1速率升至245℃。以1.0ml·min^-1氦气为载气，ms离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70ev，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库nist-8(nist/epa/nih，美国)和保留指数(retentionindex，ri)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算。

(二)实验结果

实时定量pcr结果显示，在九个品种中，pptps3的表达与芳樟醇含量呈正相关关系(附图1)；桃果实成熟过程中pptps3表达持续增强，伴随有芳樟醇含量的持续增加(附图2)。

实施例2pptps3重组蛋白体外催化芳樟醇的生物合成

(一)实验方法

1.重组载体构建及大肠杆菌转化

根据pptps3在桃基因组数据库(phytozomev12)中的参考序列，利用pcr技术，以桃果实cdna为模板，结合引物对seqidno.2和seqidno.3扩增获得pptps3全长seqidno.1。pcr反应体系为50μl，成分分别为：25μlprimestarmaxpremix(2x)酶(takara)，上下游引物(10μm)各1μl，1μl桃果实cdna，22μlh2o。pcr反应程序为：98℃10s；55℃15s，72℃10s，35个循环。利用vazyme一步克隆试剂盒将pcr产物与经限制性内切酶sali和hindiii在37℃水浴条件下酶切3h后的pet6xhn-n载体5μl连接产物加入20μldh5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化dh5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的pptps3-pet6xhn-n载体利用热激转化法转入bl21(de3)中，挑取阳性克隆保存。

2.诱导表达及重组蛋白的纯化

转化后的bl21(de3)菌于20ml含amp(100mg/l)的lb中培养12h，然后以1:50转移至500ml含amp(100mg/l)的lb中继续培养至od600＝0.5-0.8，加入iptg(终浓度0.5mmol/l)，16℃诱导24h后离心(5000g，15min，15℃)集菌。用25ml1xpbs缓冲液重悬后超声破碎，10000rpm，4℃离心30min。上清液过0.45μmhv的除菌膜后按照说明书过histalontm(clontech,takara)的重力柱纯化得到粗蛋白并通过sds-page电泳检测。粗蛋白液用脱盐柱pd-10(gehealthcare，英国)进行脱盐，并将蛋白置换到tris-hcl缓冲液(100mmol/ltris,2mmol/ldtt,ph7.5)，加入10％甘油储存在超低温冰箱。

3.蛋白体外活性测定

反应底物gpp所用对应缓冲液a(50mmol/lhepes，7.5mmol/lmgcl2，100mmol/lkcl，5mmol/ldithiothreitoland10％[v/v]glycerol，ph7.0)，反应在4ml的密封玻璃瓶进行，1ml的反应体系中分别加入200μl纯化蛋白，10μg反应底物，800μl反应缓冲液，加入适量内标后，在42℃反应15min。空载体表达的蛋白以及底物单独反应加热作为阴性对照。用spme方法进行挥发性物质的收集测定。

(二)实验结果

在大肠杆菌中诱导pptps3-pet6xhn-n重组载体表达，得到大小约为63.45kda的pptps3重组蛋白，以gpp为底物反应产生了4种单萜，最主要的是芳樟醇，占比达98.3％(附图3)，证明pptps3能催化芳樟醇的生物合成。

在大肠杆菌中诱导pptps3-pet6xhn-n重组载体表达，得到大小约为63.45kda的pptps3重组蛋白，以gpp为底物反应产生了4种单萜，最主要的是芳樟醇，占比达98.3％，证明pptps3能催化芳樟醇的生物合成。

实施例3桃果实中过量表达pptps3基因增加了芳樟醇的含量

(一)实验方法

1.载体构建及农杆菌转化

结合引物对seqidno.9和seqidno.10，利用pcr技术扩增获得pptps3，pcr体系及反应程序同实施例2。利用vazyme一步克隆试剂盒将pcr产物与经限制性内切酶bamhi和sali在37℃水浴条件下酶切3h后的pgreenii002962-sk载体5μl连接产物加入20μldh5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化dh5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的pptps3-sk载体利用电击转化法，转入农杆菌gv3101::psoup中，挑取阳性克隆保存。50μl农杆菌感受态加入5μl重组载体，冰上放置30min，转入bio-rad的2mm电击杯，通过bio-radgenepulserxcell在2.5kv条件电击转入。

2.桃果实的侵染

将含有pptps3-sk载体的gv3101农杆菌在含卡那霉素(50mg/l)及庆大霉素(25mg/l)的固体培养基上划线28℃培养2d后，挑取单克隆菌株于5ml含卡那霉素与庆大霉素的lb中，过夜培养后转移至500ml含lb(kan50mg/l+get25mg/l)中，培养至od600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集菌。用等体积渗透液(10mmol/lmes，10mmol/lmgcl2，150mmol/l乙酰丁香酮，0.04％triton^rx-100，ph5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空sk载体的农杆菌以同样方法准备，作为对照。

选取转色期的果实，洗净后用50％的乙醇消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·l^-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用。消毒后去除表皮，选取中部果肉，切成为厚度1cm，面积为4-8cm²的小块，将制备好的果肉切片放置在ms固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h。500ml渗透液经过2h诱导后，倒入提前消毒过的真空渗透装置中，将培养基上的切片放入渗透液进行抽真空渗透。每个果实切取的2片一半用来渗透含有重组载体pptps3-sk的菌液，一半用来渗透只含sk空载的菌液，互为对照。真空压力抽至-70kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降，开始缓慢释放真空，让侵染液能够渗入果肉组织，过程大约需要15-20min。侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3-5次，晾干后转入新配置的ms固体培养基在25℃培养2天，然后用液氮迅速冷冻果肉组织并储藏在-80℃冰箱。

3.桃果实pptps3基因表达及香气物质检测

桃果实样品用液氮研磨，利用ctab法提取总rna，取1.0μgrna按(takara)试剂说明书操作合成cdna。qpcr所用引物，反应体系及检测方法同实施例1。经液氮研磨后的果实组织5g用gc-ms分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。

(二)实验结果

在桃果实体内瞬时过量表达pptps3基因后，芳樟醇积累量增加到对照空载的4倍左右(附图4)，图4表示在桃果实中瞬时过表达pptps3显著提高了其芳樟醇含量。因此，pptps3确实可以在桃果实体内合成芳樟醇。

实施例4转基因技术过量表达pptps3显著提高番茄的芳樟醇含量

(一)实验方法

1.载体构建及农杆菌转化

结合引物对seqidno.11和seqidno.12，利用pcr技术扩增获得pptps3，pcr体系及反应程序同实施例2。利用vazyme一步克隆试剂盒将pcr产物与经限制性内切酶xbai和bamhi在37℃水浴条件下酶切3h后的pbi121载体5μl连接产物加入20μldh5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化dh5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的pptps3-pbi121载体利用载体利用电击转化法，分别转入农杆菌eha105中，并分别挑取阳性克隆保存。

2.番茄子叶的侵染

挑选阳性单菌落于3ml含卡那霉素(50μg/ml)及利福平(10μg/ml)的lb液体培养基中，28℃培养过夜后转入20mllb中，28℃培养至od600＝0.5～0.6，离心集菌后用无菌水稀释至od600＝0.1～0.2作为侵染液。无菌条件下生长7-8d的番茄子叶，切去叶尖和叶基，将外植体背面朝上置于铺滤纸的预培养基t1上。将预培养2d后的外植体浸泡于侵染液中，震荡5min后倒掉浸染液，将多余的浸染液用滤纸吸干后，将外植体重新置于预培养培养基。在暗室共培养2d后置于芽诱导培养基t21，在光下培养7d后转入新的t21培养基中进行继代培养。第一次继代培养后，每隔2周继代一次，直至外植体发芽完全。待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基t22中。培养3-4周当芽伸长至4-5cm时，转入生根培养tr中培养3-4周。将生根旺盛，生长到一定高度的小苗即时转入土盆里。转入土盆后提取叶片dna进行阳性植株检测。经过鉴定的t1代转基因番茄及野生型种植于人工气候室(25℃，16h/8h光周期)。采收红熟阶段番茄果实经液氮冷冻后保存于-80℃用于芳樟醇含量及基因表达分析。每个株系选取3株分别作为3个生物学重复，每个重复包含5颗果实。

3.转基因番茄pptps3表达及香气物质检测

番茄果实样品用液氮研磨，利用ctab法提取总rna，取1.0μgrna按(takara)试剂说明书操作合成cdna。qpcr以番茄slactin(seqidno.13和seqidno.14)为内参基因，pptps3引物序列为seqidno.7和seqidno.8。qpcr反应体系及检测方法同实施例1。经液氮研磨后的果实组织5g用gc-ms分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。

(二)实验结果

在番茄中采用遗传转化技术过量表达pptps3基因后，番茄果实中芳樟醇积累量增加到野生型的4.4倍左右(附图5)。由此可得，pptps3确实可以催化芳樟醇的合成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1608

<212>dna

<213>桃(prunuspersica)

<400>1

atggcccttcttcaagctcactctgcttcccccaactgtccaattgttgattttcacgtc60

caccatgctcaaaaattgaaggaattgaaggatgcactggcaaatgttggagaagatgaa120

ctgctgattgcggttgatgccatgcagcacctaggccttgatcatcacttccgagaggag180

attgaagcatttctgcaaaagcaatatcatgcaagagcttatgataattgcaatcatcaa240

cttcttgaggtttcacttcgttttcgactcttgagacaacaaggttatcatgtaaccaca300

gatgtgtttaacaaattcaagaacatccaagacttgaaatcaggactagacaaagacatt360

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cttgatgagactgatgaactaccagattacatgaagataagttttaaggctctttatgac960

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atccaaaagatttcagatgaatggaagagactcaaccaagaatgcttctcttcaaatcca1440

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gattacaatacccaacatcgccttccaagccttgaggagaacatgaagtcgttgcttttt1560

gatagttttcttgcacaagggtttcagtccccaggccagacgaaataa1608

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>2

aaggcctctgtcgacatggcccttcttcaagctca35

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>3

agaattcgcaagcttttatttcgtctggcctgggg35

<210>4

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<212>prt

<213>桃(prunuspersica)

<400>4

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151015

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leualaasnvalglygluaspgluleuleuilealavalaspalamet

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859095

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lysserleuthrargphemetalalysasnpheleuasptyrphegln

180185190

glythrglulystrpalaserileleuglngluleualalysleuglu

195200205

leuasnvalvalgluserileileargasngluileleuglnileser

210215220

lystrptrplysgluleuglyleuthrlysgluleuasnphevalarg

225230235240

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245250255

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290295300

aspgluleuproasptyrmetlysileserphelysalaleutyrasp

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325330335

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leuleuglualaglntrppheargcysglyhisleuproasnalaglu

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asptyrleulysasnglyvalileserthrglyvalproalavalleu

370375380

thrhisalaphepheileleuglyargglyilethrglnglnalaile

385390395400

aspilevalaspasnileasnthrproglyileileserserthrala

405410415

thrileleuargleutrpaspasppheglyseralalysaspgluasn

420425430

glnasnglytyraspglysertyrileglncystyrvalasngluhis

435440445

gluglycysseraspgluaspalaargalatyrvalileglnlysile

450455460

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465470475480

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485490495

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<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>5

ggtgtgacgatgaagagtgatg22

<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>6

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<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>7

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<210>8

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<212>dna

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<400>8

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<210>9

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<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>9

agaactagtggatccatggcccttcttcaagctca35

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<211>35

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

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cccctcgaggtcgacttatttcgtctggcctgggg35

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<212>dna

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accacccggggatcctttcgtctggcctggggact35

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<212>dna

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tgtccctatttacgagggttatgc24

<210>14

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>14

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