含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体T细胞及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体来说，涉及一种调控双嵌合抗原受体t细胞活性的双功能免疫开关分子的构建方法及其应用。

背景：

基于嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞的免疫疗法被证明是一种有希望的癌症治疗手段，尤其是在b细胞恶性肿瘤中取得了空前的成功。car通过表面展示的单链可变区与胞内的共刺激和激活结构域来赋予t细胞识别和清除肿瘤的能力。尽管car-t细胞疗法在b细胞急性淋巴细胞性白血病患者中展现出了显著疗效，但其在治疗实体瘤中的效果却不尽人意。

car-t细胞的应用主要受制于实体瘤肿瘤微环境以及脱靶效应。实体瘤肿瘤微环境中发挥抑制免疫活性的细胞及相关配体会使浸润的t细胞丧失抗肿瘤活性，从而造成肿瘤的免疫逃逸。例如在乳腺癌中，肿瘤微环境中包含大量肿瘤相关巨噬细胞和调节性t细胞，他们通过与t细胞接触或是通过分泌抑制性的细胞因子，削弱t细胞的抗肿瘤活性，造成患者抗肿瘤免疫反应失效。此外，激活的t细胞分泌大量效应细胞因子ifnγ，造成乳腺肿瘤pd-l1表达升高。而pd-l1与t细胞表面抑制性受体pd-1结合，会抑制t细胞的抗肿瘤活性。目前，检查点阻断疗法，尤其针对pd-1/pd-l1，其通过抗体阻断t细胞抑制性信号通路，已经被证明在一系列肿瘤治疗中产生了临床响应。而通过将car-t细胞疗法与pd-1/pd-l1抗体联合，通过car-t细胞自分泌pd-1/pd-l1抗体，以及通过crispr介导的pd-1-敲除car-t细胞已经在临床前或是临床研究中展现出积极的结果。

对于脱靶效应，由于实体瘤相关抗原往往在一系列正常组织中也表达，导致临床上将car-t细胞应用与实体瘤治疗时产生了严重的毒性。例如一个乳腺癌患者在回输靶向her-2的car-t细胞后产生了致命的炎性细胞因子释放，就是因为肺表皮细胞上也表达her-2。目前有许多措施来控制car-t细胞的活性，包括引入自杀基因，采用双抗原受体，外源开关分子控制控制car-t细胞活性。此外，我们先前的研究介绍了一种可调节双受体car系统，其活性依赖于双抗原且严格受控于开关分子^[1]。具体来说，t细胞受双嵌合抗原受体共同调控，功能性开关分子控制的第一嵌合抗原受体(cd3ζ胞内信号域)及肿瘤相关抗原msln控制的第二嵌合抗原受体(4-1bb胞内信号域)。而开关分子作为效靶细胞间的桥梁，控制着可调节双受体car-t细胞的激活及靶细胞清除。

技术实现要素：

要解决的问题

针对目前car-t细胞治疗过程中出现的脱靶毒性及免疫抑制，本发明提供了一种双功能免疫开关分子，其一方面具有调控双受体car-t细胞活性的功能，此种car-t细胞需同时识别msln，pd-l1双抗原及双功能开关分子才可以被激活，从而降低了脱靶毒性的风险。另一方面双功能开关分子具有pd-l1阻断活性，从而解除car-t细胞的抑制状态，更好的发挥抗肿瘤活性。总之，通过设计的双功能免疫开关分子，可以同时解决双受体car-t细胞脱靶效应及免疫抑制状态，扩大了car-t细胞在实体肿瘤中的应用。

技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种双功能免疫开关分子，其特征在于，其含有双嵌合抗原受体的调控区域和免疫检查点抑制区域。

所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：免疫检查点抑制区域为pd-l1阻断多肽，所述多肽的序列为：seqidno.1。

所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：双嵌合抗原受体调控区域为偶联的fitc分子。

所述的一种双功能免疫开关分子，其特征在于：其序列为fitc-acp-snglsqpv；

含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体t细胞，其特征在于：其含有所述的双功能免疫开关分子、第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体；其中第一嵌合抗原受体由cd8α信号肽，fitcscfv(seqidno.6)，cd8α铰链区与跨膜区，cd3ζ胞内信号域串联构成，所述第一嵌合抗原受体的氨基酸序列为：seqidno.2；所述的第二嵌合抗原受体由cd8α信号肽，mslnscfv(seqidno.5)，cd8α铰链区与跨膜区，4-1bb胞内信号域串联构成，所述第二嵌合抗原受体的氨基酸序列为：seqidno.3；

所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括卵巢癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、头颈癌、宫颈癌和骨肉瘤。

更进一步地，一种转染制备能够表达双嵌合抗原受体t细胞的方法，其特征在于：将所述的双嵌合抗原受体基因连接到过表达载体中，通过包装慢病毒，将目的基因转入到原代t淋巴细胞中，使得t细胞表达双嵌合抗原受体；

更进一步地，所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体t细胞在制备治疗过表达肿瘤抗原msln和pd-l1的肿瘤药物领域中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体t细胞可通过多种给药方式治疗癌症，包括皮下或静脉注射，肌肉注射，瘤内注射。

一种肿瘤细胞治疗药物组合，其特征在于，包括的双功能开关分子，或双嵌合抗原受体t细胞，以及药学上可接受的辅料。

作用机理：

如图3示意图所示，本发明中包括可调节双嵌合抗原受体(即sdcar)t细胞(sdcar-t细胞)包含双嵌合抗原受体和双功能免疫开关分子(即dt301)，sdcar包括第一和第二嵌合抗原受体；其中第一嵌合抗原受体主要包括胞外的fitcscfv识别区及胞内的cd3ζ信号域等，主要识别dt301中的fitc部分；第二嵌合抗原受体主要包括胞外的mslnscfv识别区及胞内的4-1bb信号域，主要识别肿瘤细胞表面的msln。因此，这种sdcar-t细胞必须同时识别dt301的fitc即msln双抗原后才可以被充分激活，有效降低脱靶效应发生的概率。此外，dt301由两部分构成，分别为pd-l1阻断多肽以及偶联的fitc分子，是一种起到开关作用的分子，即通过添加dt301实现car-t细胞启动，具体来说一方面，外源添加dt301后，其通过pd-l1阻断多肽与肿瘤细胞表面的pd-l1结合，从而将偶联的fitc分子锚定在肿瘤细胞表面，进而可以通过fitc分子与肿瘤细胞本身表达的msln分子共同调控sdcar-t细胞的激活，因此sdcar-t细胞只有在添加dt301后才可以被充分激活，有效增加了sdcar-t细胞的可控性。在具体的抗肿瘤过程中，只有当肿瘤细胞同时表达msln及pd-l1时，添加dt301后，dt301与pd-l1结合，这时sdcar-t细胞通过识别msln及fitc抗原得以激活，从而发挥抗肿瘤作用，而不添加dt301，或是肿瘤细胞不同时表达msln和pd-l1抗原，sdcar-t细胞不能被激活，这些结果如图5-8所示，因此安全性明显得到提高。而在sdcar-t细胞的长期在体外被同时表达msln和pd-l1的肿瘤细胞刺激并且添加dt301后，其增殖活性明显强于mslncar-t细胞，这表明在长期的抗肿瘤过程中，sdcar-t细胞配合dt301会显示更好的增殖活性，如图9所示。体内的抗肿瘤实验也表明，sdcar-t细胞联合dt301对肿瘤细胞的清除能力更强，体内增殖活性也更好，显示了更好的抗肿瘤活性，而对于没有添加dt301的组别，sdcar-t细胞本身并不能发挥清除肿瘤的作用，如图10-12所示，这些结果表明了sdcar-t细胞在体内的抗肿瘤活性依赖于dt301的存在，当sdcar-t细胞联合dt301后，其抗肿瘤活性优于mslncar-t细胞。综上所述，通过人为的添加dt301，可以同时实现降低脱靶毒性，增强sdcar-t细胞的可控性以及解除sdcar-t细胞免疫抑制的多重功效。

有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明设计了一种新型的双功能免疫开关分子dt301，其序列为fitc-acp-snglsqpv，是个分子量相对较小分子，可以通过dt301起到启动和调节功能，进而降低脱靶毒性和增加可控性，解除免疫抑制等多重功能，方便快捷，临床价值高。具体来说其通过将pd-l1阻断多肽偶联fitc分子，可以对先前报道的一种双受体car-t细胞的活性进行精准调控^[1]。dt301通过结合肿瘤细胞表面的pd-l1后，与肿瘤相关抗原msln共同调控sdcar-t细胞的激活。相比于先前的报道，利用实体瘤中高表达的pd-l1及msln，通过dt301作为桥梁，更好的将sdcar-t细胞限制在实体肿瘤部位，进一步降低了脱靶效应；

2.外源添加dt301后，其与肿瘤细胞表面的pd-l1结合不仅可以控制sdcar-t细胞的激活，还可以阻断pd-1/pd-l1信号通路，从而降低了sdcar-t细胞的免疫抑制活性；

3.本专利通过外源添加dt301，不仅将sdcar-t细胞的激活与细胞毒作用限制在实体瘤部位，还可以解除sdcar-t细胞的免疫抑制状态，因此会进一步拓展双受体car-t细胞的应用范围。

附图说明：

图1为dt301与靶细胞(panc-1和mda-mb-321)结合的流式检测结果；

图2为靶细胞(panc-1和mda-mb-321)表面msln及pd-l1的表达情况；

图3为sdcar-t细胞联合dt301抗肿瘤的示意图；

图4为空白对照，mslncar-t细胞和sdcar-t细胞转染阳性率结果；

图5为dt301介导的sdcar-t细胞激活后il-2的分泌水平；

图6为dt301介导的sdcar-t细胞激活后ifn-γ的分泌水平；

图7为dt301介导的sdcar-t细胞激活后cd69的表达水平；

图8为dt301介导的sdcar-t细胞长期增值能力的结果；

图9为dt301介导的sdcar-t细胞的体内杀肿瘤能力监测结果；

图10为dt301介导的sdcar-t细胞杀肿瘤后的瘤重结果；

图11为dt301介导的sdcar-t细胞体内增值结果；

图12为多种实体瘤重pd-l1的表达水平结果；

图13为多种实体瘤重msln的表达水平结果；

图14为重组质粒plvx-car的示意图图；

图15为msln过表达载体质粒图。

具体实施方式

术语：dt301,即双功能免疫开关分子；sdcar-t细胞，即可调控双嵌合抗原受体t细胞；msln,即间皮素；mslncar-t细胞，及传统的靶向msln的二代car-t细胞；egfp,即增强型绿色荧光蛋白；panc-1细胞为人类胰腺癌细胞系；

实施例1dt301的合成与靶细胞结合实验

本发明涉及的一种具有双功能的免疫开关分子dt301，具有序列fitc-acp-snglsqpv，其中acp代表β-氨基己酸，snglsqpv序列来自先前公布的一种pd-l1抑制多肽(cn110669102a)。dt301为上海吉尔多肽有限公司，纯度为95％以上。本实验选取两种不同的靶细胞，分别为mda-mb-231(pd-l1⁺)和panc-1(pd-l1^-)，均购自atcc。具体方案为：

分别取250nm,750nm及1.5μm的dt301，分别与靶细胞避光孵育30min，通过pbs清洗3遍，之后通过流式细胞仪的fitc通道监测dt301在靶细胞上的结合能力。流式检测结果详见附图1，dt301在mda-mb-231细胞的结合率为250nm-76.4％,750nm-91.2％及1.5μm-96.8％，而对于panc-1细胞，dt301在任何浓度都没有结合。

结果说明：

mda-mb-231细胞是人类乳腺癌细胞，流式检测结果表明其只表达pd-l1而不表达msln,panc-1细胞是人类胰腺癌细胞，流式结果显示其pd-l1和msln都不表达。本实验通过将dt301与mda-mb-231细胞(pd-l1⁺msln^-)或panc-1细胞(pd-l1^-msln^-)共孵育，结果显示dt301只与mda-mb-231细胞结合而不与panc-1细胞结合，说明了其对于pd-l1的结合特异性。

实施例2sdcar过表达质粒的构建

1.基因片段的合成

sdcar序列从5’到3’端依次为cd8α信号肽，fitcscfv，cd8α铰链区，cd8α跨膜区，cd3ζ胞内信号域,ires,cd8α信号肽，mslnscfv，cd8α铰链区,cd8α跨膜区，4-1bb胞内信号域,p2a,egfp，将优化后完整的sdcar基因序列进行全基因合成，核苷酸序列为seqidno.4，通过特异性酶切位点xhoⅰ和xbaⅰ将其克隆到plvx-puro中，最终构建重组质粒plvx-car(见图14)，引入的egfp荧光标签是为了便于对构建的car-t细胞进行检测和跟踪，sdcar-t细胞示意图见附图3。

2.重组质粒的构建及测序

将重组质粒plvx-car送至公司进行测序，比对测序结果与拟合成的sdcar基因序列，结果证实得到的合成序列正确。

实施例3靶细胞(msln⁺pd-l1⁺，msln⁺pd-l1^-，msln^-pd-l1⁺，msln^-pd-l1^-)的构建

1.msln过表达载体的构建

由于本发明需要验证sdcar-t细胞对于pd-l1与msln的抗原依赖性，因此需要四种靶细胞，分别为msln⁺pd-l1⁺，msln⁺pd-l1^-，msln^-pd-l1⁺，msln^-pd-l1^-。为了获得四种靶细胞，通过首先筛选得到msln^-pd-l1⁺与msln^-pd-l1^-的肿瘤细胞(见图2)，然后通过人为过表达msln,即可得到满足条件的四种靶细胞。参考ensembl数据库中人源间皮素msln的cds区序列(ensg00000102854)。msln基因片段通过酶切位点xhoⅰ和xbaⅰ插入到慢病毒过表达载体plvx中，形成plvx-msln重组表达质粒，如图15。将重组质粒送至公司进行测序，比对测序结果与拟合成的plvx-msln基因序列，结果证实得到的合成序列正确。

2.慢病毒颗粒的制备

1)准备15cm的培养皿，加入含有10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的完全培养基(dmem高糖)，接种5×10⁶个293t细胞，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。

2)从冰箱中取出构建的过表达载体plvx-msln(浓度约为100μm)及慢病毒包装质粒(lenti-goi、pgp、pvsvg)(购自购自addgene)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。

3)取出磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)，温热至室温。取2ml的pbs至6孔板的一个孔，分别加入10μg的lenti-goi、6μg的pgp、5μg的pvsvg，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μl的plvx-msln，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10min。

4)将上述过表达质粒plvx-msln和各种包装质粒的复合物逐滴加入到过夜培养的293t细胞中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱。

5)培养6-8h后(本实施例中优选8h)，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。

6)连续培养48-72h后(本实施例中优选48h)，收集培养皿中含有病毒的培养基上清。

7)将上述所得培养基上清用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，50000g，4℃高速离心2h。

8)离心后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μlpbs缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。

9)测定所得慢病毒颗粒的滴度。过表达msln的病毒颗粒滴度为1.62×10⁸tu/ml。

3.慢病毒感染肿瘤细胞

1).从液氮中复苏低代次的细胞株，常规培养传代5次，调整细胞状态至对数生长期。

2).准备一块新的6孔板，按照5×10⁵个细胞/孔的密度进行接种，共接种2孔，添加完全培养基至2ml/孔。将孔板置于37℃、5％co2培养箱中，过夜培养。

3).从-80°冰箱中取出一管过表达慢病毒，置于37℃水浴锅中迅速解冻。从培养箱中取出细胞，更换新鲜的完全培养基，向其中一孔的培养基中加入终浓度为6ug/ml的polybrene，然后加入100ul慢病毒，用移液器轻轻吹打混匀后，将孔板置于离心机中，800g离心1小时。离心结束后，将孔板置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24小时。

4).从培养箱中取出孔板，然后将孔板中含有病毒上清的培养基去除，加入新鲜的完全培养基，继续培养2天。

5).从培养箱中取出孔板，然后将孔板中2个孔的的培养基去除，添加含有1ug/ml嘌呤霉素的培养基。

6).以未经病毒感染的对照孔细胞为对照，连续培养5天，直至对照孔细胞完全死亡，经病毒感染孔中存活的细胞，即为构建成功的稳定细胞株。

7).采用流式细胞仪或wb验证目的基因在稳定细胞株中的表达情况。

8).获得靶细胞(msln⁺pd-l1⁺，msln⁺pd-l1^-，msln^-pd-l1⁺，msln^-pd-l1^-)。

实施例4sdcar-t细胞的制备

1.sdcar慢病毒颗粒的制备

1)准备15cm的培养皿，加入含有10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)的完全培养基(dmem高糖)，接种5×10⁶个293t细胞，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。

2)从冰箱中取出实施例2中构建的过表达载体plvx-car(浓度约为100μm)及慢病毒包装质粒(lenti-goi、pgp、pvsvg)(购自addgene)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。

3)取出磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)，温热至室温。取2ml的pbs至6孔板的一个孔，分别加入10μg的lenti-goi、6μg的pgp、5μg的pvsvg，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μl的plvx-car，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10min。

4)将上述过表达质粒plvx-car和各种包装质粒的复合物逐滴加入到过夜培养的293t细胞中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱。

5)培养6-8h后(本实施例中优选8h)，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。

6)连续培养48-72h后(本实施例中优选48h)，收集培养皿中含有病毒的培养基上清。

7)将上述所得培养基上清用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，50000g，4℃高速离心2h。

8)离心后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μlpbs缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。

9)测定所得慢病毒颗粒的滴度。过表达sdcar的病毒颗粒滴度为1.18×10⁸tu/ml。

2.外周血单核细胞的获取

外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞等细胞密度较大，为1.092g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度约为1.070g/ml。淋巴细胞分离液ficoll试剂是由60％的聚蔗糖和34％的泛影葡胺按照2:1混合而成，比重约为1.077±0.001的特性。通过离心，按照密度梯度进行分布，从而将淋巴细胞与其他血细胞分离开。具体实施方法为：取新鲜抗凝血1ml与pbs缓冲液按照1:1混匀后，小心添加1ml的ficoll分离液，室温2000rpm离心20min，此时离心管中由下至上细胞分为四层，收集上面第二层乳白色薄膜层为pbmc层；将pbmc与5ml的pbs缓冲液充分混匀后，1000rpm离心10min，反复清洗两次即可得到纯度较高的pbmc。

将分离得到的pbmc按照每毫升5×10⁵细胞密度接种在15cm的培养皿，培养基为含10％fbs的rpmi1640，并添加终浓度为50u/ml的细胞因子il-2，将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中培养48h，培养结束后在显微镜下观察细胞状态。可以观察到pbmc培养以后细胞状态产生了明显分化，一部分为聚集生长呈圆形透亮的悬浮细胞，另一部分开始贴壁并呈梭形生长的细胞。经分析，悬浮生长的细胞应为淋巴细胞，贴壁生长的细胞为单核细胞。

3.t细胞的磁珠分选

本实施例主要采用磁珠分选的方法将目的t细胞分选得到,具体步骤如下：

1)将上步分离得到的pbmc体外扩增至10⁶～10⁷；

2)离心：300g，10min，完全弃去上清；

3)一次重悬细胞：按照每10⁷总细胞数加入80μl的buffer彻底重悬细胞；

4)磁性标记：按照每10⁷总细胞数加入20μl的cd3的磁性微珠；充分混匀后放到2～8℃的冰箱中静置15min；

5)一次清洗：按照每10⁷总细胞数加入1～2mlbuffer，混匀后300g离心10min，完全弃去上清；

6)二次重悬细胞：加入500μlbuffer重悬细胞；

7)润洗柱子：按照不同的分选柱加入适量的buffer；

8)上样：将上述重悬的细胞全部加入到分选柱中；

9)二次清洗：收集未标记的细胞并用适当的buffer进行清洗；

10)洗脱目的细胞：清洗完毕后，快速的将分选柱从磁场中拿出放到合适的收集管中，添加适量的buffer，最后用专用注射活塞快速地将细胞压出。

分选结果表明通过磁珠分选得到cd3⁺t细胞的阳性率约为92.4％。

4.慢病毒感染t淋巴细胞

1).收集活化后的t细胞，离心(1000rpm，5min)后弃上清，取1ml新鲜培养基重悬细胞。使用磁珠分选架，利用磁场吧cd3/cd28磁珠吸附于离心管壁上，缓缓吸取细胞悬液，吸至另一离心管，该过程重复2遍。

2).准备一块新的6孔板，按照3×10⁵个细胞/孔的密度进行接种，共接种2孔，添加完全培养基至3ml/孔。将孔板置于37℃、5％co2培养箱中，过夜培养。

3).从-80℃冰箱中取出一管过表达慢病毒(sdcar的病毒颗粒)，置于37℃水浴锅中迅速解冻。从培养箱中取出细胞，更换新鲜的完全培养基，向其中一孔的培养基中加入终浓度为6ug/ml的polybrene，然后加入50ul慢病毒，用移液器轻轻吹打混匀后，将孔板置于离心机中，800g离心1小时。离心结束后，将孔板置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24小时。

4).从培养箱中取出孔板，然后将孔板中含有病毒上清的培养基去除，加入新鲜的完全培养基，继续培养2天，观察gfp表达情况。

转染结果见附图4，结果显示细胞已转染成功，转染效率大约为43％，即获得sdcar-t细胞。

实施例5dt301介导sdcar-t细胞的体外激活试验

本实施例详细介绍了dt301介导的sdcar-t细胞体外激活试验的研究。检测的指标是t细胞表面激活分子cd69的数目以及激活过程中产生的细胞因子il-2和ifnγ水平。本实验中，选择的靶细胞为实施例3中获得的靶细胞。共设计5个组别(每个组别设计三个复孔)，具体方案为：

组别一：效应细胞为sdcar-t细胞，靶细胞为mda-mb-231细胞(msln^-pd-l1⁺)，添dt301；

组别二：效应细胞为sdcar-t细胞，靶细胞为mda-mb-231-msln细胞(msln⁺pd-l1⁺)，不添加dt301；

组别三：效应细胞为sdcar-t细胞，靶细胞为panc-1-msln细胞(msln⁺pd-l1^-)，添加dt301；

组别四：效应细胞为sdcar-t细胞，靶细胞为mda-mb-231-msln细胞(msln⁺pd-l1⁺)，添加dt301；

组别五：效应细胞为msln-car-t细胞，靶细胞为mda-mb-231-msln细胞(msln⁺pd-l1⁺)，不添加dt301。

实施步骤：

1)分别复苏效应细胞与靶细胞，选择rpmi1640培养基培养24h后，按照效靶比为2：1进行铺板，并在对应组别孔中加入dt301。

2)分别加入赤霉酸乙酰甲酯(gibberellicacidacetoxymethylester)过夜培养(8h)后，800g离心5min，分别收集细胞与上清。

3)分别采用elisa法检测收集上清液中的il-2和ifnγ的含量。

4)收集得到的细胞直接标记流式抗体cd69，流式检测激活的t细胞数目。

细胞上清液中细胞因子il-2水平检测详见图5，细胞上清液中细胞因子ifnγ水平检测详见图6。car-t细胞表面激活因子cd69的流式检测结果见图7。

结果讨论：本实验通过将sdcar-t细胞与不同的靶细胞在dt301缺失或是存在的情况下，测定sdcar-t细胞的激活情况，来探索sdcar-t细胞的激活对抗原与dt301的依赖性。实验结果表明，sdcar-t细胞只有在靶细胞同时表达msln及pd-l1，以及添加dt301的情况下才能被激活，说明了sdcar-t细胞的双抗原依赖性及受dt301调控的特点。

实施例6dt301增强双嵌合抗原受体t细胞的体外增殖试验

本实施例详细介绍了car-t细胞体外增殖试验的研究。检测的指标是长期刺激后t细胞的数目随时间变化而变化。本实验中，选择的靶细胞为构造的mda-mb-231-msln细胞。sdcar-t细胞和靶细胞共孵育21天。实验组别设计为：

组别一：效应细胞为sdcar-t细胞，靶细胞为mda-mb-231-msln细胞(msln⁺pd-l1⁺)，添加dt301；

组别二：效应细胞为msln-car-t细胞，靶细胞为mda-mb-231-msln细胞(msln⁺pd-l1⁺)，不添加dt301。

具体实施步骤：

1)复苏靶细胞mda-mb-231-msln，选择rpmi1640培养基培养24h后用丝裂霉素c处理30min，使得靶细胞失去增殖的能力。

2)复苏效应细胞sdcar-t细胞或msln-car-t细胞，按照效靶比为2：1进行铺板。

3)每7天添加新鲜的肿瘤细胞进行刺激。

4)采用流式检测car-t的细胞百分含量以及用细胞计数仪检测总细胞数。

5)计算出car-t细胞数目。细胞增殖结果图详见图8。

结果讨论：本实验通过将sdcar-t细胞或mslncar-t细胞与mda-mb-231-msln细胞长期共孵育的情况下，比较sdcar-t细胞的与mslncar-t细胞的抗肿瘤活性。实验结果表明，sdcar-t细胞在与靶细胞长期共孵育时比mslncar-t细胞的抗肿瘤活性更强。

实施例7dt301增强双受体car-t细胞的体内杀瘤试验

选择6-8周的雌性裸鼠balb/c，将肿瘤细胞皮下注射到裸鼠体内，待肿瘤细胞在体内成瘤之后，分别对各组尾静脉注射相应的效应细胞和开关分子。共设计四个实验组，每组6只裸鼠。具体方案为：

组别一：pbs对照组；

组别二：效应细胞为sdcar-t细胞,添加dt300(不含fitc)；

组别三：效应细胞为sdcar-t细胞,添加dt301；

组别四：效应细胞为特异于msln的二代car-t细胞，不添加dt301；

以接种肿瘤细胞时记为第0天，第7天注射1×10⁷的效应细胞和开关分子，对小鼠进行活体成像持续观察其体内的肿瘤大小，活体成像表征的肿瘤体内负荷见图8。瘤重见附图10同时在第14天取50μl裸鼠血，测量外周血中car-t细胞的数目，实验结果见图11。经过试验验证分析，sdcar-t细胞+dt301相比其他三组具有更好的抑制肿瘤生长的能力，肿瘤荧光强度更低，sdcar-t细胞在体内的存活时间明显延长。

结果讨论：体内实验结果表明，sdcar-t细胞+dt301治疗可以有效介导小鼠肿瘤的消除，且抗肿瘤活性比mslncar-t细胞更强；此外，单独施用sdcar-t细胞的小鼠肿瘤并没有被抑制，说明sdcar-t细胞的抗肿瘤活性依赖dt301的添加，反映出sdcar-t细胞的可控性。

实施例8双嵌合抗原受体t细胞联合dt301在实体瘤中的应用

根据上述sdcar-t细胞联合dt301的体内外试验结果，为进一步验证这种联合治疗策略在实体瘤中的治疗效果与适用肿瘤类型，所选择的实体瘤细胞通过验证均高表达msln和pd-l1。参考相关文献^[2-5]及相应的临床试验数据，此种car-t细胞联合dt301治疗的适应症主要选择胰腺癌aspc-1、肺癌a549、胃癌mg803、结肠癌sw480、乳腺癌mcf7、肝癌smcc7721、黑色素瘤a375、宫颈癌hela、肾癌a498、前列腺癌pc-3、舌鳞癌cal-27、膀胱癌bt-b、卵巢癌ov90及鼻咽癌5-8f细胞。首先利用流式抗体分别检测这些实体瘤细胞表面表达癌胚抗原的水平，对这些实体瘤的检测结果汇总详见附图12，13。检测结果表明，所选择的这些肿瘤细胞均高表达响应抗原。以上检测结果表明，本发明中的sdcar-t细胞联合dt301适用于多种实体瘤类型。

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[2].lvj,zhaor,wudetal.mesothelinisatargetofchimericantigenreceptortcellsfortreatinggastriccancer[j].jhematoloncol,2019,12:18

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序列表

<110>中国药科大学

<120>含有双功能免疫开关分子的双嵌合抗原受体t细胞及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>pd-l1阻断多肽(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

serasnglyleuserglnproval

15

<210>2

<211>458

<212>prt

<213>第一嵌合抗原受体(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproalaseraspvalvalmetthrglnthrproleu

202530

serleuprovalserleuglyaspglnalaserilesercysargser

354045

serglnserleuvalhisserasnglyasnthrtyrleuargtrptyr

505560

leuglnlysproglyglnserprolysvalleuiletyrlysvalser

65707580

asnargvalserglyvalproaspargpheserglyserglysergly

859095

thraspphethrleulysileasnargvalglualagluaspleugly

100105110

valtyrphecysserglnserthrhisvalprotrpthrpheglygly

115120125

glythrlysleugluilelysserseralaaspaspalalyslysasp

130135140

alaalalyslysaspaspalalyslysaspaspalalyslysaspgly

145150155160

glyvallysleuaspgluthrglyglyglyleuvalglnproglygly

165170175

alametlysleusercysvalthrserglyphethrpheglyhistyr

180185190

trpmetasntrpvalargglnserproglulysglyleuglutrpval

195200205

alaglnpheargasnlysprotyrasntyrgluthrtyrtyrserasp

210215220

servallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser

225230235240

valtyrleuglnmetasnasnleuargvalgluaspthrglyiletyr

245250255

tyrcysthrglyalasertyrglymetglutyrleuglyglnglythr

260265270

servalthrvalserthrthrthrproalaproargproprothrpro

275280285

alaprothrilealaserglnproleuserleuargproglualacys

290295300

argproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuasppheala

305310315320

cysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleu

325330335

leuleuserleuvalilethrleutyrcysargvallyspheserarg

340345350

seralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasn

355360365

gluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysarg

370375380

argglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasnpro

385390395400

glngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalagluala

405410415

tyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysglyhis

420425430

aspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyrasp

435440445

alaleuhismetglnalaleuproproarg

450455

<210>3

<211>376

<212>prt

<213>第二嵌合抗原受体(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>3

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproglyserglnvalglnleuglnglnserglypro

202530

gluleuglulysproglyalaservallysilesercyslysalaser

354045

glytyrserphethrglytyrthrmetasntrpvallysglnserhis

505560

glylysserleuglutrpileglyleuilethrprotyrasnglyala

65707580

sersertyrasnglnlyspheargglylysalathrleuthrvalasp

859095

lysserserserthralatyrmetaspleuleuserleuthrserglu

100105110

aspseralavaltyrphecysalaargglyglytyraspglyarggly

115120125

pheasptyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserserglygly

130135140

glyglyserglyglyglyglyserserglyglyglyseraspileglu

145150155160

leuthrglnserproalailemetseralaserproglyglulysval

165170175

thrmetthrcysseralaserserservalsertyrmethistrptyr

180185190

glnglnlysserglythrserprolysargtrpiletyraspthrser

195200205

lysleualaserglyvalproglyargpheserglyserglysergly

210215220

asnsertyrserleuthrileserservalglualagluaspaspala

225230235240

thrtyrtyrcysglnglntrpserlyshisproleuthrtyrglyala

245250255

glythrlysleugluilelysserserthrthrthrproalaproarg

260265270

proprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuarg

275280285

proglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrarggly

290295300

leuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythr

305310315320

cysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcyslysarg

325330335

glyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargpro

340345350

valglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglu

355360365

gluglugluglyglycysgluleu

370375

<210>4

<211>3116

<212>dna

<213>sdcar(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>4

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgggatcccaggtacaactgcagcagtctgggcctgagctggagaagcctggcgcttca120

gtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtg180

aagcagagccatggaaagagccttgagtggattggacttattactccttacaatggtgct240

tctagctacaaccagaagttcaggggcaaggccacattaactgtagacaagtcatccagc300

acagcctacatggacctcctcagtctgacatctgaagactctgcagtctatttctgtgca360

agggggggttacgacgggaggggttttgactactggggccaagggaccacggtcaccgtc420

tcctcaggtggaggcggttcaggcggcggtggctctagcggtggtggatcggacatcgag480

ctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgc540

agtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaagtcaggcacctccccc600

aaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtcccaggtcgcttcagtggc660

agtgggtctggaaactcttactctctcacaatcagcagcgtggaggctgaagatgatgca720

acttattactgccagcagtggagtaagcaccctctcacgtacggtgctgggacaaagttg780

gaaatcaaaagcagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatc840

gcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtg900

catacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtact960

tgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaag1020

ctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggac1080

ggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgtaacgcccctct1140

ccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgttt1200

gtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct1260

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ggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacg1380

tctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggc1440

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agttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctg1560

aaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgc1620

tttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtg1680

gttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaacccacaaggagacgaccttcca1740

tggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggc1800

ccgctagcgacgtcgttatgactcaaacaccactatcacttcctgttagtctaggtgatc1860

aagcctccatctcttgcagatctagtcagagcctcgtacacagtaatggaaacacctatt1920

tacgttggtacctgcagaagccaggccagtctccaaaggtcctgatctacaaagtttcca1980

accgagtttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacac2040

tcaagatcaacagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacac2100

atgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagcttgaaattaagtcctctgctgatgatg2160

ctaagaaggatgctgctaagaaggatgatgctaagaaagatgatgctaagaaagatggtg2220

gcgtcaaactggatgagactggaggaggcttggtgcaacctgggggggccatgaaactct2280

cctgtgttacctctggattcacttttggtcactactggatgaactgggtccgccagtctc2340

cagagaaaggactggagtgggtagcacaatttagaaacaaaccttataattatgaaacat2400

attattcagattctgtgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtg2460

tctatctgcaaatgaacaacttaagagttgaagacacgggtatctattactgtacgggtg2520

cttcctatggtatggaatacttgggtcaaggaacctcagtcaccgtctccaccactaccc2580

cagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtc2640

cggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcct2700

gcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcg2760

tgatcactctttactgtcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagc2820

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tggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatcccc2940

aagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattg3000

gtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagca3060

ccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggtaa3116

<210>5

<211>244

<212>prt

<213>mslnscfv(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>5

glyserglnvalglnleuglnglnserglyprogluleuglulyspro

151015

glyalaservallysilesercyslysalaserglytyrserphethr

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

glyglyserserglyglyglyseraspilegluleuthrglnserpro

130135140

alailemetseralaserproglyglulysvalthrmetthrcysser

145150155160

alaserserservalsertyrmethistrptyrglnglnlyssergly

165170175

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180185190

valproglyargpheserglyserglyserglyasnsertyrserleu

195200205

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210215220

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ilelysserser

<210>6

<211>256

<212>prt

<213>fitcscfv(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>6

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151015

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202530

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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180185190

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210215220

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225230235240

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245250255