一种检测Wx1分子标记及应用于甜糯玉米选育的方法与流程

文档序号：21819354发布日期：2020-08-11 21:34阅读：570来源：国知局

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种选育鲜食玉米自交系调控wx1糯质基因的特异性分子标记的开发和利用所述分子标记快速选育优良鲜食甜糯玉米自交系的方法。

背景技术：

随着人们对鲜食玉米的喜爱和消费需求日益增强，鲜食玉米种植面积逐年扩增。市场对鲜食玉米的需求，不仅仅停留在鲜食玉米的商品外观性、贮运能力上，更是对优质口感提出了更高的要求。甜糯玉米是近年来我国最具发展潜力的新型鲜食玉米，由于糯中带甜，甜度适中的独特口感，广受消费者的喜爱，2018年种植面积已超过200万亩，这引起了育种家们对鲜食甜糯玉米自交系选育的重视。

在玉米(zeamaysl.)中，已经有不同淀粉突变体的相关研究，并在其功能上取得了重大进展，比如ae1[1]、su1[2]、和waxy1(wx1)[3,4]。其中，wx1基因编码颗粒结合型淀粉合成酶，在拟南芥和谷物已有相关应用研究。若wx1基因缺失，胚乳中直链淀粉含量将急剧降低，从而形成具有糯性的糯玉米子粒。而甜糯玉米的子粒，由于甜质相关基因位于淀粉合成途径上游，在甜质基因隐性纯合时，直链淀粉合成受阻，从而使糖度含量升高，而淀粉含量降低，此时的子粒即使wx1为隐性纯合也无法判定出糯性性状[5]。通常情况下，育种家们可以利用多个材料进行杂交测配，再从多代群体中反复观察甜子粒和糯性子粒分离比是否符合孟德尔定律，再推断该材料是否为甜糯玉米自交系，采用这种方式选育甜糯玉米，不仅耗时、费力、效率低，同时容易产生基因连锁累赘而影响甜糯玉米本身的口感，很难选育新的甜糯玉米品种。因此，建立科学、实用、便捷的鲜食甜糯玉米的鉴别方法对于快速选育甜糯玉米具有十分重要的应用价值。

至今为止，对鲜食甜糯玉米基因的鉴定，主要采用聚合酶链式反应(pcr)产物测序分析、限制性片段长度多态性扩增(rflp)、简单重复序列(ssr)等方法。但pcr方法存在对基因灵敏度低的缺点，容易受到假阳性的影响，检测结果存在不确定性，而rflp、ssr方法实验操作繁琐，实验过程较为费时、费工，不适于大规模的鲜食玉米育种。因此，开发一种简便实用、低成本、高通量的分子标记方法克服现有技术的不足，具有重要意义。

高分辨率熔解曲线分析(high-resolutionmeltingcurveanalysis，hrm)是一种针对单核苷酸多态性、突变研究及鉴定的工具，具有操作简单、快速、成本低、鉴定结果准确等特性。在植物分子育种中，可对突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面实现理想的应用价值。

根据wx1的序列，结合hrm方法，开发与wx1基因的分子标记，并建立中高通量辅助选育体系，能够大大提高鲜食玉米自交系选育的效率。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测鲜食玉米糯质基因wx1的方法，并提供一种结合高分辨率熔解曲线分析(high-resolutionmeltingcurveanalysis,hrm)用于检测鲜食玉米糯质基因wx1的分子标记引物，所述引物根据wx1基因序列的基因特异性单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)设计，可以结合hrm用于wx1基因的辅助选择，并利用所开发的分子标记快速选育甜糯双隐性基因的鲜食玉米自交系，用于提高鲜食玉米的选育效率，进而推进鲜食玉米的育种进程和生产应用以满足日益增长的市场需求。

本发明提供如下解决方案：

一种结合hrm用于检测鲜食玉米糯质基因wx1的分子标记引物，其上、下游序列分别为：

wx1-hrm-1f：5’-caggctggaagagcagaagg-3’(seqidno：4)；

wx1-hrm-1r：5’-cacacgtaccagcagaacgat-3’(seqidno：5)；

上述引物根据wx1基因序列的基因特异性snp设计，其基因特异性snp分别位于wx1基因(seqidno：1)的第495、1370、1453和1472位单核苷酸碱基。

一种结合hrm检测鲜食甜糯玉米糯质基因wx1的方法：

a)提取待测样本dna；

b)用检测引物对(seqidno：4和5)进行pcr扩增；

c)对pcr产物进行hrm分析扫描。

一种鲜食甜糯玉米自交系材料分子标记辅助选育方法：以甜糯玉米材料为亲本，与其他甜质玉米品种杂交，提取后代甜质子粒个体基因组dna，分别以引物对wx1-hrm-1f、wx1-hrm-1r(seqidno：4和5)进行pcr扩增，留取其扩增产物的高分辨率熔解曲线与玉米材料“s1”的熔解曲线相同的植株，进行套袋自交获得f2。以引物对wx1-hrm-1f、wx1-hrm-1r(seqidno：4和5)再次进行pcr扩增与阳性对照玉米材料“n1”的熔解曲线一致，同时与玉米材料“t1、s1”的熔解曲线不同，即为甜糯双隐性玉米自交系材料，后续通过田间筛选并进行自交繁殖，获得优良农艺性状的自交系。

其中材料t1为华南师范大学生命科学院提供的华旺甜7号dna，材料n1为未名兴旺系统作物设计前沿实验室提供的京科糯2000dna，材料s1为深圳作物分子设计育种研究院提供的甜糯玉米圳黑甜糯dna。

本发明还提供了一种基于hrm技术的鲜食玉米糯性基因wx1检测的pcr试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含一对检测引物，其引物的序列如seqidno：4和seqidno：5所示，用于检测玉米材料中wx1基因是否功能缺失，以判断玉米材料是否为糯质或是否为wx1基因缺失的甜糯玉米自交系材料。

本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

a)提取待测样本dna；

b)配制包含待测样品dna、检测引物对、pcr试剂盒和evagreen荧光染料的pcr反应体系进行pcr扩增；

c)对pcr产物进行hrm分析扫描。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)精准。本技术方法可以精确分析糯玉米与非糯玉米自交系。

(2)便捷。本研究方法可以在短时间内区分不同性质玉米自交系。

(3)高效。本发明的方法可将不同种质资源进行明显的划分，方便育种、生产和商业推广应用。

(4)用途广。利用本发明的方法可检测糯玉米材料，又可根据育种目标选择新型甜糯玉米自交系、商用杂交种等。

此方法灵敏度高、重复性好，相较ssr分子标记法灵敏度差，rapd-pcr法灵敏度低、实验重复性差，具有检测更为准确的优点。因此，本发明是一种简单、快捷、准确的检测方法，代替之前的检测方法，将有助于糯玉米自交系育种资源的选育和鉴别技术的推广应用。

参考文献

1.kim,k.,etal.,molecularcloningandcharacterizationoftheamylose-extendergeneencodingstarchbranchingenzymeiibinmaize.plantmolecularbiology,1998.38(6):p.945-956.

2.james,m.g.,d.s.robertson,anda.m.myers,characterizationofthemaizegenesugary1,adeterminantofstarchcompositioninkernels.theplantcell,1995.7(4):p.417-429.

3.shure,m.,s.r.wessler,andn.v.fedoroff,molecularidentificationandisolationofthewaxylocusinmaize.cell,1983.35(1):p.225-233.

4.zheng,h.,etal.,geneticdiversityandmolecularevolutionofchinesewaxymaizegermplasm.plosone,2013.8(6):p.e66606.

5.dong,l.,etal.,supersweetandwaxy:meetingthediversedemandsforspecialtymaizebygenomeediting.plantbiotechnolj,2019.17(10):p.1853-1855.

附图说明

图1为wx1基因的snp位点，其中方框内表示基因基因snp特异性。

图2为引物wx1-hrm-1检测96个玉米自交系材料中wx1基因的高分辨率熔解曲线图。

图3为结合wx1基因分子标记快速选育甜糯玉米双隐性纯合自交系流程图。

具体技术实施

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual(3rdedition)》(sambrook，j.，russell,davidw.，2001，coldspringharbor)，《plantpropagationbytissueculture》(edwinf.george,michaela.hall,geert-jandeklerk,2008,springer)。

下面实施例中用到的dna提取方法ctab法步骤如下：

(1)剪取50mg幼嫩叶片，用液氮充分研磨；

(2)将冷冻研磨成粉末的材料移入1.5ml的离心管中，加入0.5ml2.0×ctab提取液(ctab4g，nacl16.364g，1mtris-hcl20mlph8.0，0.5medta8ml)，先用70mlddh2o溶解，再定容至200ml灭菌)，摇匀，在56℃水浴中保温15～20min，期间摇动数次；

(3)加入0.5ml酚氯仿，上下颠倒混匀5min，20℃，12000r/min离心10min；

(4)取上清至另一离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀5min，4℃，12000r/min离心10min；

(5)取上清至另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，直至出现乳白色絮状沉淀；

(6)将絮状沉淀挑出，转入1.5ml离心管，用70％(v/v)的乙醇清洗沉淀一次；

(7)12000r/min离心1min，弃70％乙醇并晾干沉淀；

(8)溶于0.1～0.3mlddh2o，-20℃保存备用。

实施例1：wx1基因编码区序列的比对、特异性单碱基多态性分析及分子标记引物设计与检测

(1)选取了课题组多年选育的12个糯质玉米纯合自交系和12个非糯玉米纯合自交系，采用ctab法提取dna；

(2)糯质基因wx1已被成功克隆，ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)收录，其编码区序列可从ncbi的序列数据库中输入wx1下载基因序列得到(收录号为：zm00001d033937)，选取序列总长1750bp(seqidno：1)；

(3)进行基因扩增引物设计(引物序列由华大基因科技有限公司合成)，其中上下游引物序列如下：

wx1-cx-f：5’-cctgctggttcattatctgacc-3’(seqidno：2)；

wx1-cx-r：5’-acacacgcaagcaattagttca-3’(seqidno：3)；

(4)对选取序列进行wx1基因扩增；

其中pcr扩增反应体系如下：

2×kodneobuffer：15μl

dntps(2mm)：2μl

wx1-cx-f(10μm)：0.5μl

wx1-cx-r(10μm)：0.5μl

kodneoe：0.3μl

dna模板(50ng)：1μl

ddh2o：10.7μl

pcr温度循环条件：95℃，4min；98℃10s、58℃30s、68℃2min、68℃5min，35个循环；25℃，2min。

(5)将步骤(4)扩增的pcr产物进行测序(由华大基因科技有限公司提供测序)。利用多序列比对软件工具dnaman，通过对这些序列比对分析，筛选到4个wx1基因的snp位点(如图1方框内所示)。这些特异性位点分别位于选取wx1基因(seqidno：1)的第495位、第1370位、第1453位和第1472位单核苷酸碱基。

实施例2：wx1分子标记引物设计与hrm检测

(1)引物设计

根据实施例1中所述的wx1基因的snp特异性，遵循hrm引物设计原则，开发分子标记wx1-hrm-1f/r、wx1-hrm-2f/r、wx1-hrm-3f/r、wx1-hrm-4f/r共四对(引物序列由华大基因科技有限公司合成)，具体引物碱基序列如下：

wx1-hrm-1f：5’-caggctggaagagcagaagg-3’(seqidno：4)；

wx1-hrm-1r：5’-cacacgtaccagcagaacgat-3’(seqidno：5)；

wx1-hrm-2f：5’-aggatctctcctggaaggtacg-3’(seqidno：6)；

wx1-hrm-2r：5’-gcaaattaaaccacggtcagc-3’(seqidno：7)；

wx1-hrm-3f：5’-ccaagaactgggagaacgtg-3’(seqidno：8)；

wx1-hrm-3r：5’-tcccaacatgtttgcaccac-3’(seqidno：9)；

wx1-hrm-4f：5’-caagaactgggagaacgtgc-3’(seqidno：10)；

wx1-hrm-4r：5’-ctgcaggccgaactcttcag-3’(seqidno：11)；

(2)hrm检测

根据上述设计的四对hrm引物，对96个不同血缘玉米自交系dna模板(由华南师范大学黎杰强副教授提供)进行pcr扩增，其中，上述96个玉米自交系dna模板中糯玉米自交系为60个，非糯玉米自交系为36个。具体反应体系如下：

10×pcrbuffer(mg²⁺plus)：1μl

dntp：0.1μl

wx1-hrm-f(10μm)：0.1μl

wx1-hrm-r(10μm)：0.1μl

rtaq：0.1μl

evagreendye(20×)：0.1μl

dna模板(50ng)：1.5μl

ddh2o：7μl

pcr温度循环条件：94℃，3min；94℃30s、55℃30s、72℃10s、72℃2min，40个循环；95℃，2min。

检测结果比对：4对引物的扩增产物中，只有分子标记引物对wx1-hrm-1f/wx1-hrm-1r的hrm分型结果和96个不同自交系表型完全吻合，该引物对的上游引物在489bp至509bp处，下游引物在568bp至589bp处(seqidno：4和5)。具体地，从图2中可辨别出，糯玉米自交系的基因型用于wx1基因检测时可以形成单一的明显熔解峰(如图2所示，左边曲线为糯玉米基因型产物峰，右边曲线为非糯玉米基因型产物峰)，说明该引物在糯玉米自交系wx1基因的样品中可以进行特异性扩增。

而在用于非纯合wx1基因糯玉米自交系检测时，检测出的熔解峰可以明显与糯玉米纯合wx1基因自交系品种熔解峰不同，因此可以明确分辨出检测样品是否为糯玉米纯合wx1基因自交系。

对上述96个材料用引物对wx1-hrm-1f/wx1-hrm-1r进行分子检测，它们的分型结果与已知的表型完全一致。这说明本发明所开发提供的分子标记引物wx1-hrm-1f/wx1-hrm-1r可以高效、精确的用于鉴定玉米材料中是否含有糯性基因wx1。

实施例3：利用hrm引物选育甜糯玉米自交系

以鲜食甜糯玉米材料“圳甜糯1号”为母本(由深圳市作物分子设计育种研究院供种)，与鲜食超甜玉米材料“甜丰6号”(由华南师范大学生命科学院供种)作为父本进行杂交，分别提取杂交后代f1代中的甜质玉米子粒个体(基因型为wx1wx1或wx1wx1)、对照材料t1(华旺甜7号)、n1(京科糯2000)以及s1(圳黑甜糯)的基因组dna，分别以引物对wx1-hrm-1f/wx1-hrm-1r进行pcr扩增，获得其扩增产物的高分辨率熔解曲线。留取熔解曲线与玉米材料“s1”的熔解曲线相同(杂合株，基因型为wx1wx1)的f1代单株，进行自交，获得的f2代进行hrm分型，结果与阳性对照玉米材料“n1(wx1wx1)”的熔解曲线一致，同时与玉米材料“t1(wx1wx1)、s1(wx1wx1)”的熔解曲线不同，即为糯质玉米自交系材料，且该材料还同时具有甜质籽粒的性状，进而可自交繁殖。具体操作如图3所示，步骤如下：

(1)选取圳甜糯1号作为母本，甜丰6号作为父本杂交，获得f1代杂交种子；

(2)从f1代杂交种中选甜质(皱缩)籽粒，进行种植，三叶一芯期剪取叶片，ctab法进行dna提取；

(3)分别利用hrm引物wx1-hrm-1f、wx1-hrm-1r(seqidno：4和5)扩增步骤(2)提取的dna和玉米对照材料t1、n1、s1；

(4)分析熔解峰，留取与s1熔解曲线相同的f1代单株，并进行自交，获得f2代；

(5)对f2代单株用ctab法进行dna提取，并分别利用hrm引物wx1-hrm-1f、wx1-hrm-1r(seqidno：4和5)扩增提取到的f2代单株dna、玉米对照材料n1和s1；

(6)分析熔解峰，若f2代单株中熔解曲线与与玉米材料n1一致，同时与玉米材料t1、s1的熔解曲线不同，则说明该f2代单株为甜糯双隐性的自交系材料(基因型为wx1wx1)，后续可以进行自交繁殖；

(7)观察田间长势，选择田间所感兴趣表型的植株进行套袋自交，最终选育出农艺性状优良的甜糯玉米自交系材料。

序列表

<110>华南师范大学

深圳市作物分子设计育种研究院

<120>一种检测wx1分子标记及应用于甜糯玉米选育的方法

<130>1

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1739

<212>dna

<213>玉米(zeamays)

<400>1

ccacaactgttcgcgtcctgctggttcattatctgaccttgattgcattgcagctacgag60

aagcccgtggaaggccggaagatcaactggatgaaggccgggatcctcgaggccgacagg120

gtcctcaccgtcagcccctactacgccgaggagctcatctccggcatcgccaggggctgc180

gagctcgacaacatcatgcgcctcaccggcatcaccggcatcgtcaacggcatggacgtc240

agcgagtgggaccccagcagggacaagtacatcgccgtgaagtacgacgtgtcgacggtg300

agctggctagctagctgattctgctgcctggtcctcctgctcatgctggttcggttctga360

cgcggcgagtgtacgtacgtgcgtgcgacggtggtgtggtgtccggttcaggccgtggag420

gccaaggcgctgcaggcggaggtcgggctcccggtggaccggaacatcccgctggtggcg480

ttcatcggcaggctggaagagcagaagggacccgacgtcatggcggccgccatcccgcag540

ctcatggagatggtggaggacgtgcagatcgttctgctggtacgtgtgcgccgcccgcca600

cccggctactacatgcgtgtatcgttctactggaacatacgtgtgagcaacgcgatggat660

aatgctgcagggcacgggcaagaagaagttcgagcgcatgctcatgagcgccgaggagaa720

gttcccaggcaaggtgcgcgccgtggtcaagttcaacgcggcgctggcgcaccacatcat780

ggccggcgccgacgtgctcgccgtcaccagccgcttcgagccctgcggcctcatccagct840

gcaggggatgcgatacggaacggtacgagagagaaaaaaaaacatcctgaatcctgacga900

gagggacagagacagattgattatgaatgcttcatcgatttgaattgattgatcgatgtc960

tcccgctgcgactcttgcagccctgcgcctgcgcgtccaccggtggactcgtcgacacca1020

tcatcgaaggcaagaccgggttccacatgggccgcctcagcgtcgacgtaagcctagctc1080

tgccatgatctttcttctttctgtatgtatgtatgtatgaatcagcaccgccgttcttgt1140

ttcgtcgtcctctcttcccagtgcaacgtcgtggagccggcggacgtcaagaaggtggcc1200

accaccttgcagcgcgccatcaaggtggtcggcacgccggcgtacgaggagatggtgagg1260

aactgcatgatccaggatctctcctggaaggtacgtacgcccgccccgccagagcagagc1320

gccaagatcgatcgaccgaccgaccacacgtacgcgcctcgctcctgtcgctgaccgtgg1380

tttaatttgcgaaatgcgcagggccctgccaagaactgggagaacgtgctgctcagcctc1440

ggggtcgccggcggcgagccaggggtcgaaggcgaggagatcgcgccgctcgccaaggag1500

aacgtggccgcgccctgaagagttcggcctgcaggccccctgatctcgcgcgtggtgcaa1560

acatgttgggacatcttcttatatatgctgtttcgtttatgtgatatggacaagtatgtg1620

tagctgcttgcttgtgctagtgtaatataatagtgtagtggtggccagtggcacaaccta1680

ataagcgcatgaactaattgcttgcgtgtgtagttaagtaccgatcggtaattttatat1739

<210>2

<211>22

<212>dna