芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌的制作方法

文档序号：21501669发布日期：2020-07-14 17:39阅读：484来源：国知局

本发明属于酶工程与代谢工程领域，具体涉及一种通过定向进化手段获得催化能力提高的芳樟醇合成酶突变体、编码它的核酸序列、含有该突变体基因的重组表达载体，以及在酿酒酵母中的表达及其应用。

背景技术：

芳樟醇是天然存在于植物中的具有特殊香味的非环状单萜烯醇，不仅具有抗菌、驱避杀虫、消炎止痛以及镇静等多种生物学功效，还可以作为维生素a、维生素e以及异植物醇生产过程中的重要中间体，是食品、医药、化妆品行业的重要原料。目前，市场上的芳樟醇主要来源于植物提取和化学合成两种方法。由于植物生长周期长，且提取工艺复杂，提取的产品纯度低，并不能满足人们对其日益增长的需求。而化学合成的芳樟醇工艺复杂，成本高。随着芳樟醇合成酶的发现，代谢改造微生物生产芳樟醇具有巨大的潜力。国际竹藤中心将来自土肉桂的芳樟醇合成酶定位到酿酒酵母线粒体中，在酿酒酵母的线粒体中完整构建了甲羟戊酸等途径(mva)利用了在线粒体和细胞质共同参与合成芳樟醇(cn109554403a)。但是芳樟醇合成酶作为芳樟醇合成途径中的关键酶，其在微生物内的表达量和催化活性都比较低，成为限制芳樟醇异源微生物合成的主要瓶颈问题。为了进一步提高芳樟醇异源微生物合成的产量，本发明通过定向进化手段对芳樟醇合成酶进行突变，使其具有更高的活性，并在酿酒酵母中进行表达。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种通过定向进化手段获得的芳樟醇合成酶突变体基因和其编码的蛋白，以及其在微生物异源合成芳樟醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：e352h或e343d。

突变体e352h代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，突变体e343d代表第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。

其中，所述芳樟醇合成酶突变体为e352h和e343d的双突变体，双突变体代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，同时第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。

本发明内容还包括编码所述的芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸。

其中，编码所述芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸的第1054位核苷酸由g突变为c、第1056位核苷酸由a突变为c；和/或第1029位核苷酸由a突变为c。

其中，所述芳樟醇合成酶的突变型基因序列如序列表中seqidno.2所示，其氨基酸序列如序列表中seqidno.4所示。

其中，序列表中的seqidno.4的氨基酸序列编码的芳樟醇合成酶命名为t67omclis^e343d/e352h，所述突变体相对于野生型的氨基酸其第343位谷氨酸突变成天冬氨酸、第352位谷氨酸突变成组氨酸。

其中，任何对所述seqidno.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸、n端氨基端截短、羧基端截短并在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有芳樟醇合成酶活性的，即能催化牻牛儿基焦磷酸(gpp)转化成芳樟醇的，仍属于本发明的保护范围。

本发明内容还包括含有所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。

本发明还提供了上述芳樟醇合成酶突变体的获得方法，具体包括：

(1)首先通过易错pcr技术建立芳樟醇合成酶基因突变体库。

(2)在同一个细胞中，构建番茄红素合成途径和芳樟醇合成途径，由于两者竞争相同的前体物质gpp，因此芳樟醇合成酶的活性与番茄红素积累呈负相关，因此利用菌落颜色变化作为指示对芳樟醇合成酶突变库进行筛选。具有方法如下：将表达芳樟醇合成酶导入到产番茄红素的酿酒酵母菌株yxwp-111(metabolicengineering，2015；30：69-78)中，当芳樟醇合成酶活性高时，流向番茄红素合成途径的代谢通量降低，菌株颜色变淡。挑选出颜色变淡得菌株，进行测序，并导入酵母中再验证。具体流程如图2所示。

本发明进一步涉及包含本发明的芳樟醇合成酶突变基因的酿酒酵母重组表达载体。

其中，所述重组载体为pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis^e343d/e352h。

其中，所述重组表达载体通过如下方式构建得到：将seqidno.2所示的芳樟醇合成酶突变体基因t67omclis^e343d/e352h克隆到酿酒pumri-16-erg20^f96w/n127w，得到包含t67omclis^e343d/e352h基因的酿酒酵母整合型表达质粒pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis^e343d/e352h。

本发明进一步涉及相应的芳樟醇合成工程菌株ylin-05。其中，所述重组菌为酿酒酵母重组菌。

本发明内容还包括所述的重组菌的构建方法，所述重组菌的构建方法包括如下步骤：

1)芳樟醇合成酶的突变型基因的获得；

2)将步骤1)得到的突变型基因导入pumri-16-erg20^f96w/n127w质粒中得到重组质粒；

3)将重组质粒整合到酿酒酵母菌株中即得。

其中，具体地，所述的生产菌株构建如下：将上述pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis^e343d/e352h质粒整合到酿酒酵母by4741-c-04(natcommun.2016；7：12851)染色体ty4位点，使得所述的芳樟醇合成酶基因在酿酒酵母中表达，实现芳樟醇绿色生产。

本发明内容还包括所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌在合成芳樟醇中的应用。

本发明还涉及到酿酒酵母芳樟醇合成菌株的两项发酵培养方法。

有益效果：本发明根据酿酒酵母密码子偏好性合成了薄荷(menthacitrata)来源的芳樟醇合成酶基因，并建立以竞争性合成途径中番茄红素的颜色指示高通量筛选方法，首次对芳樟醇合成酶进行了定向进化改造，获得了催化活力提高的芳樟醇合成酶突变体，并将筛选到的芳樟醇合成酶突变体应用到酿酒酵母芳樟醇的生产中，为其它单萜的微生物合成提供了方法借鉴。

附图说明

图1酿酒酵母合成芳樟醇gc-ms鉴定图；

图2t67omclis易错pcr产物核酸凝胶电泳图；泳道1dl2000plusdnamarker，泳道2和泳道3t67omclis目的基因；

图3为芳樟醇合成酶定向进化流程图；a、番茄红素和芳樟醇在代谢途径中的竞争关系b、芳樟醇合成酶的具体定向进化流程；

图4用于酿酒酵母芳樟醇合成酶表达的pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis^e343d^/e352h质粒图谱；

图5为芳樟醇合成酶突变体与野生型的活性比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例所用试剂与培养基配方：

高保真酶dna聚合酶primestar^tmhsdnapolymeras、t4dna连接酶、dna限制性内切酶购于takara公司；2×taqplusmastermixii、dnamarker购于南京诺唯赞生物技术有限公司；pcr产物纯化试剂盒、dna凝胶纯化试剂盒构于axygen公司；上述分子生物学试剂用于基因克隆实验；pcr引物合成及测序服务有上海生物工程有限公司或南京擎科生物技术有限公司提供。

无氨基酵母氮源(yeastnitrogenbasewithoutaminoacids&ammoniumsulfate，ynb)(上海生物工程有限公司)用于合成培养基的制备；芳樟醇标准品购自阿拉丁公司，其他未做特殊说明的试剂和药品均为国产分析纯。

100mg/ml氨苄青霉素(ampicillin)：称量1g氨苄青霉素置于15ml离心管中，用灭菌水定容到10ml充分混匀溶解后，用无菌0.22μm针式过滤器(上海安谱实验科技股份公司)过滤除菌，分装到1.5ml离心管后于-20℃保存，工作浓度为100μg/ml。

50mg/ml卡那霉素：称量0.5g氨苄青霉素置于15ml离心管中，用灭菌水定容到10ml充分混匀溶解后，用无菌0.22μm针式过滤器(上海安谱实验科技股份公司)过滤除菌，分装到1.5ml离心管后于-20℃保存。工作浓度为50μg/ml。

0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液(含80mmol/lmgcl2，20mmol/lcacl2)：称取mgcl2·6h2o16.26g，cacl22.22g，用去离子水溶解并定容至1l，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

甘油-cacl2溶液(含0.1mol/l的cacl2和20％的甘油)：称取cacl211.1g用20％的甘油溶液溶解并定容至1l，121℃灭菌15min，冷却后于4℃冰箱保存。

luria-bertani(lb)培养基：5g/l酵母提取物，10g/l胰蛋白胨，10g/lnacl，用naoh调节ph≈7.2，固体lb培养基添加1.5-2％的琼脂粉，121℃灭菌15min。

yeastextractpeptonedextrose(ypd)培养基：10g/l酵母浸出粉，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，固体ypd培养基添加1.5-2％的琼脂粉，115℃灭菌21min。

10×氨基酸混合母液：按以下配方称取各种氨基酸混合并溶于ddh2o中，浓度为：l-腺嘌呤硫酸盐200mg/l，l-精氨酸200mg/l，l-组氨酸200mg/l，l-异亮氨酸300mg/l，l-亮氨酸1000mg/l，l-赖氨酸300mg/l，l-蛋氨酸200mg/l，l-苯丙氨酸500mg/l，l-苏氨酸2000mg/l，l-色氨酸200mg/l，l-酪氨酸300mg/l，l-尿嘧啶200mg/l，l-缬氨酸1500mg/l(注：配制上述氨基酸母液时，根据营养筛选的不同，缺失相应的氨基酸)。用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放。使用时稀释10倍。

syntheticdefined(sd)培养基：2％葡萄糖，10％(v/v)的10×ynb母液，10％(v/v)的10×氨基酸混合母液。配置100mlsd培养基具体流程如下：取2g葡萄糖溶于80ml水中，115℃高压灭菌21min，待培养基冷却到60℃以下，加入10ml的10×ynb母液和10ml的10×氨基酸混合母液。固体sd培养基添加1.5-2％的琼脂粉。其中sd-ura-表示缺尿嘧啶的sd培养基。

50％pegmw3350(w/v)：称取50gpeg3350溶解于100ml无菌去离子水中，搅拌均匀，完全溶解后，利用0.22μm的针式过滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱存放。

1m醋酸锂溶液：称取10.2g二水醋酸锂溶解于100ml水中，完全溶解，搅拌均匀后，利用0.22μm的针式过滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱存放。

实施例所用常规的技术方法：

1.大肠杆菌bl21感受态制备

大肠杆菌的mgcl2-cacl2感受态细胞制作方法及转化参照分子克隆操作手册。若无特别说明，大肠杆菌质粒抽提、dna凝胶回收、dna片段的连接等均按照相应的试剂盒的说明进行操作。

转化后的大肠杆菌克隆采用菌液pcr的方法进行鉴定。从平板上挑取单个菌落，接种到含有相应抗生素的300μllb溶液中，利用2×taqplusmastermixiidna聚合酶进行菌液pcr验证。挑选阳性克隆对应试管进行质粒抽提，并对克隆区段进行dna测序鉴定。

2.酿酒酵母感受态细胞的制备及质粒转化

(1)将保存在甘油管中的宿主菌株在ypd平板上画线，置于30℃生化培养箱培养3天。

(2)从ypd平板上挑取单菌落接在含有5mlypd液体培养基的试管中，放置于30℃，220rpm恒温摇床过夜培养。

(3)将试管中的种子液菌株转接到50mlypd液体培养基中，初始od600为0.5，30℃培养大约5h，od600为2左右时，用50ml灭菌离心管3000rpm下离心5min，去上清，收集菌体。

(4)向离心管中加入30ml无菌水，用漩涡震荡仪震荡，重新悬浮菌株，3000rpm下离心5min，去上清，重复清洗一次，去上清，收集菌体。

(5)向有菌体沉淀的离心管中加入1ml无菌水，用漩涡震荡仪震荡重悬后，取100μl菌液于1.5ml灭菌ep管中，12000rpm离心30s，去上清。

(6)向含有菌液的1.5mlep管中依次加入240μl50％peg3350、36μl1mliac、50μl2mg/mlssdna(100℃加热处理)、10μgsfii快切酶线性化后的整合型质粒或者游离型质粒、无菌水补齐体系至总体积为360μl。42℃热激40min后，12000rpm离心，去上清。

(7)加入1mlypd液体培养基，放置于30℃恒温摇床复苏2h。12000rpm离心30s，去上清。

(8)加入1ml无菌水，重悬进行清洗，12000rmp离心30s，去上清，加入1ml无菌水重悬。取50μl重组菌株在相应抗性的筛选平板上涂布均匀。30℃培养三天至单菌落出现。

实施例1产芳樟醇酿酒酵母菌株构建

酿酒酵母质粒载体pumri-16(enzymemicrob.technol.，100(2017)28-36)由浙江大学于洪巍教授课题组提供。首先利用酿酒酵母by4741-c-04(natcommun.2016；7：12851)基因组为模板，以erg20-f(gcggaattcatggcttcagaaaaagaaattagg)和erg20-r(ccttagatctctatttgcttctcttgtaaact)为引物，pcr扩增获得法尼基焦磷酸合酶基因(erg20)，并利用erg20(f96w)-f1(agttgttgcaggcttactggttggtcgccgatgatatgat)和erg20(f96w)-r1(atatcatcggcgaccaaccagtaagcctgcaacaactcaa)、erg20(n127w)-f2(ttggggaaattgccatctgggacgcattcatgttagaggc)和erg20(n127w)-r2(tctaacatgaatgcgtcccagatggcaatttccccaactt)两对引物，通过重叠延伸pcr扩增得到突变体基因erg20^f96w/n127w。将得到的erg20^f96w/n127w和质粒pumri-16用ecori和bglii双酶切后，进行连接，转化至大肠杆菌感受态中，获得质粒pumri-16-erg20^f96w/n127w，具体如下：

双酶切体系：总体积20μl

基因/质粒：17μl

10×buffer：2μl

ecori酶：0.5μl

bglii酶：0.5μl

酶切条件：37℃放置酶切1.5-2h

连接体系：总体积10μl

基因：5.5μl

质粒3μl

10×t4dnaligasebuffer：1μl

350u/μlt4dna连接酶：0.5μl

感受态细胞的转化：将10μl的连接产物加到大肠感受态中，冰上放置20min，42℃，热击90s后，冰上放置3min左右，加入1mllb，37℃摇床复苏50min，离心，取一定量涂到相应的抗性lb平板，放置于37℃培养箱培养过夜得到的阳性克隆用于质粒抽提。

根据酿酒酵母的密码子偏好性，用密码子优化网站(http：//www.jcat.de/)将薄荷来源的芳樟醇合成酶基因(genbank号：ay083653.1)进行密码子优化，并根据文献报道的n端定位序列预测方法(natcommun，9(2018)965.)，截去n端67个氨基酸定位序列，然后通过人工基因合成获得优化后的t67omclis基因(如序列表seqidno.1所示)。然后用noti和saci双酶切，并与上述同样noti和saci双酶切后的pumri-16-erg20^f96w/n127w进行连接转化，获得质粒pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis。

重组表达载体转化如下：

重组载体含有ty4同源臂，同源臂处含有sfii位点，通过sfii酶切方法线性化。

酶切体系：总体系50μl，质粒43.5μl，10×gbuffer5μl，sfii酶1.5μl。

酶切条件：放置50℃酶切2-3小时；

利用上述酿酒酵母感受态细胞的制备及质粒转化方法，将线性化的pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis整合到过表达甲羟戊酸途径的酿酒酵母by4741-c-04中，从而构建得到芳樟醇生产菌株ylin-04。

实施例2芳樟醇合成菌株的两相发酵及产量分析

将实施例1中获得的芳樟醇生产菌株ylin-04在ypd平板上划线培养3天，然后挑取单菌落至5mlypd试管中，220rpm30℃进行过夜培养，然后转接到含有5ml十四酸异丙酯的50mlypd培养基中至终od600为0.05。220rpm30℃培养72小时。将摇瓶静置，使两相自然分层，取上层有机相于1.5ml离心管中，12000rpm离心3min，取上清500μl于新的1.5ml离心管中。在离心管中加入20μl的481.4mg/l正辛醇作为内标。

使用下列气相色谱条件，分析酿酒酵母中芳樟醇的含量。气相色谱仪为福立的9790ii，色谱柱为hp-5(30m×0.320mm，0.25micron，agilenttechnologies，lnc.)，载气：n2；进样量：1μl；进样口温度：280℃；检测器：fid，280℃。采用程序升温：初始温度80℃，保持2min；以10℃/min升温至110℃，然后以40℃/min升至250℃，保持3min。正辛醇保留时间：3.8min；芳樟醇保留时间：4.2min。并结合质谱分析，成功检测到酿酒酵母积累了24.48mg/l芳樟醇(图1)。

实施例3芳樟醇合成酶定向进化流程

首先通过将经密码子优化后合成的t67omclis基因(seqidno.1)连接到p416xwp-pgal10-obkt质粒上(enzymemicrob.technol.，100(2017)28-36.)，然后以p416xwp-pgal10-t67omclis为模板，以gal10f(aacttctttgcgtccatcca)和adh1tr2(caaccttgattggagacttgac)为引物，使用taq酶，通过易错pcr的方法获取t67omclis突变体库。由于mn²⁺可以增加pcr过程中的碱基错配率，在利用taq酶进行易错pcr时，在体系中加入一定量的mncl2以增加pcr过程中的基因突变率。易错pcr的体系为：

pcr反应条件为：预变性95℃3min，然后进入温度循环，变性，95℃30s；退火，54℃30s；延伸，72℃1min40s，共30个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃，得到易错pcr产物的核酸凝胶电泳如图2所示。

将易错pcr产物清洗后与线性化的p416xwp-pgal10质粒(用noti和saci进行双酶切)，通过化学转化法共同转入产番茄红素的yxwp-111菌株中(metabolicengineering，30(2015)69-78)，涂布在sd-ura缺陷的平板上，培养3天。理论上，当芳樟醇合成酶突变体活性增强时，会竞争番茄红素合成所需要的前体物质，导致番茄红素积累下降，菌株在平板上颜色变浅，因此利用菌株番茄红素的颜色变化作为指示对t67omclis突变体库进行筛选，挑选颜色变浅的菌株，用酿酒酵母提取试剂盒提取阳性突变质粒，将提取的质粒转到大肠杆菌bl21中扩增，测序，具体流程如图3所示。

实施例4筛选活性提高的芳樟醇合成酶突变体

将实施例3筛选出的突变体按照实施例1的方式构建到pumri-16-erg20^f96w/n127w质粒中，得到的重组质粒按照实施例1中的转化方法整合到酿酒酵母染色体上，涂布在含有g418抗性的ypd平板上。得到菌株在摇瓶中进行两相发酵。收集有机相，经gc分析后，确认一株活性增强的突变体，该突变体的突变位点如表1所示，含有e352h和e343d两个位点突变。利用该突变体构建的重组质粒为pumri-16-erg20^f96w/n127w-t67omclis(图4)，将该重组质粒整合到酿酒酵母by4741-c-04菌株中，得到的重组菌株命名为ylin-05，与含野生型芳樟醇合成酶的酿酒酵母ylin-04相比，产量提高了52.7％，达到了37.39mg/l(图5)。将e352h和e343d进行单点突变分析，发现含e343d位点的突变体无明显活性提高，而含e352h突变位点的芳樟醇合酶也仅使产量提高了22.1％。因此今后的研究选用t67omclis^e343d/e352h进行芳樟醇的生产。

突变体的序列分析结果如下表1所示：

序列表

<110>扬州大学

<120>芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1620

<212>dna

<213>芳樟醇合成酶(artificialsequence)

<400>1

atgagaagatctggtaactaccacccatctgtttgggacttcgacttcatccaatctttg60

gacactgaccactacaaggaagaaaagcaattggaaagagaagaagaattgatcatggaa120

gttaagaagttgttgggtgctaagatggaagctactaagcaattggaattgatcgacgac180

ttgcaaaacttgggtttgtcttacttcttcagagacgaaatcaagaacatcttgaactct240

atctacaagatcttccaaaacaacaactctactaaggttggtgacttgcacttcacttct300

ttgggtttcagattgctcagacagcacggcttcaacgtttctcagggtgttttcgactgt360

ttcaagaacgaacacggttctgacttcgaaaagactttgatcggtgaagacacaaagggt420

gtcctgcaattgtacgaagcttctttcttgttgagagaaggtgaagacactttggaagtt480

gctagaaagttctctactgaattcttggaagaaaagttgaaggctggtatcgacggtgac540

aacttgtcttcttctatcggtcactctttggaaatcccattgcactggagaatccaaaga600

ttggaagaaagatggttcttggacgcttactctagaagaaaggacatgaacccaatcatc660

ttcgaattggctaagttggacttcaacatcatccaagctactcaacaagaagaattgaag720

gacttgtctagatggtggaacgactcttctttgccacaaaagttgccattcgttagagac780

agattggttgaatcttactactgggctttgggtttgttcgaagctcacaagttcggttac840

gaaagaaagactgctgctaagatcatcactttgatcactgctttggacgacgtttacgac900

atctacggtactttggacgaattgcaattgttcactcacgttatcagaagatgggacact960

gaatctgctactcaattgccatactacttgcaattgttctacttcgttttgtacaacttc1020

gtttctgaagttgcttaccacatcttgaaggaagaaggtttcatctctatcccattcttg1080

cacagagcttgggttgacttggttgaaggttacttgcaagaagctaagtggtactacact1140

aagtacactccaactatggaagaatacttgaactacgcttctatcactatcggtgctcca1200

gctgttatctctcaaatctacttcatgttggctaagtctaaggaaaagccagttatcgaa1260

tctttctacgaatacgacgaaatcatcagattgtctggtatgttggttagattgccagac1320

gacttgggtactttgccattcgaaatgaagagaggtgacgttgctaagtctatccaaatc1380

tacatgaaggaacaaaacgctactagagaagaagctgaagaacacgttagattcatgatc1440

agagaagcttggaaggaaatgaacactactatggctgctaactctgacttgagaggtgac1500

gttgttatggctgctgctaacttgggtagagacgctcaattcatgtacttggacggtgac1560

ggtaaccactctcaattgcaacacagaatcgctaacttgttgttcaagccatacgtttaa1620

<210>2

<211>1620

<212>dna

<213>芳樟醇合成酶突变体(artificialsequence)

<400>2