一种空间诱变酿酒酵母ST26-4及其在酿造啤酒中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，一种空间诱变酿酒酵母st26-4及其在酿造啤酒中的应用。

背景技术：

酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)是以出芽繁殖为主的单细胞真核微生物，细胞形态有卵形、长卵形(椭圆形)，于yepd培养基平板上菌落大小为4～5mm，表面凸起，光滑湿润、圆形、边缘整齐、质地黏稠，不透明，颜色呈乳白色。在麦芽汁液体培养基中发酵，表面产生气泡和泡沫，菌体悬浮于培养基中呈混浊状，发酵后期菌体细胞沉积于容器底部，发酵液变得澄清。优良酿酒酵母于25～30℃能发酵葡萄汁产生良好的果香和酒香。其发酵最适为ph4.0～4.5，具有较高的发酵能力，能将糖分发酵完全，耐受高浓度的乙醇和二氧化硫(正常添加到葡萄汁中的防腐剂)的能力较强，并具有较好的凝聚力和快速沉降能力。

空间微生物由于受到太空微重力效应、高真空、极端温差、弱磁场和高能粒子(电子、质子、重离子)辐射等诱变作用，可显著提高突变频率而发生基因突变，将导致其生物学性状(如个体形态、菌落特征、生理生化特性、免疫原性等)、发酵生产性能(如生物量、产物量、酶活力、效价、发酵速度等)发生改变。目前国内外学者对空间微生物的研究主要集中在空间病原菌、空间腐蚀菌和微生物制药方面，而国内学者对空间诱变酿酒酵母酿造啤酒的研究尚未报道。目前我国采用下面发酵酵母，即葡萄汁酵母(s.uvaram)酿造啤酒，其传统发酵周期长，后发酵双乙酰还原较慢，酒龄较长，从而影响了啤酒企业的经济效益。降低双乙酰含量，缩短发酵周期，可降低酿造工业生产的成本，是啤酒生产业所重点关注的问题之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于酿造啤酒的酿酒酵母。

本发明提供的酿酒酵母由地面酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gt26经太空诱变获得，其名称为空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.19247。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4。

所述菌剂的用途可为酿造啤酒。

所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉和草炭和中的至少一种；所述液体载体可为水或可用于培养酿酒酵母的培养基。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。

本发明还提供了酿造啤酒的方法，所述方法包括：利用所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4进行发酵，得到啤酒。

上述方法中，啤酒通过将所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4在麦芽汁中进行发酵得到。

上述方法中，所述麦芽汁的糖度可为10～12°bx。在本发明的一个实施例中，所述麦芽汁的糖度为10°bx。

上述方法中，所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4在所述麦芽汁中的接种量可为6×10⁶～9×10⁶cfu/ml。

上述方法中，所述利用所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4进行发酵可包括下述1)和2)：

1)将所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4在麦芽汁中于12～17℃下进行发酵，得到初级发酵液；

2)将所述初级发酵液于4～5℃继续发酵，得到啤酒。

上述方法中，步骤1)中发酵的温度可为15℃。

步骤1)中发酵的时间可为6～8天。

具体的，步骤1)中发酵的时间可为7天。

步骤1)中发酵前3天可在搅拌下进行。步骤1)中发酵前3天发酵时的转速可为150～180r/min。步骤1)中发酵前3天可每日通氧气6次。

步骤1)中发酵后4天可在静置下进行。

步骤2)中发酵的时间可为9～7天，如8天。

步骤2)中发酵时的温度可每日降低2℃至温度为4～5℃，并在4～5℃下发酵2～3天，得到啤酒发酵液，进而获得啤酒。

上述方法的发酵可在发酵罐中进行。

上述方法中，所用麦芽汁的体积与发酵罐的容积之比可为2.0～3.0l:5l。

所述空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4在酿造啤酒中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述菌剂在酿造啤酒中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明从经过太空诱变后的酿造葡萄酒的酿酒酵母中筛选一株能用于啤酒发酵的菌株，即空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4，该菌株不仅能在12～17℃下进行低温发酵能力高，而且还可以避免高温发酵所发生的酵母菌自溶死亡现象。本发明的菌株发酵能力强，且为下面啤酒发酵酵母，能发酵全部的棉子糖，在啤酒酿造中酵母菌悬浮于发酵液中，发酵接近结束时易于凝聚沉淀，发酵终了很快凝聚，且沉淀致密，发酵液澄清较快，收集沉积于容器底部的酵母泥后，可加快发酵液过滤速度，缩短啤酒澄清时间，容易得到生物性稳定的澄清啤酒；而上面啤酒发酵酵母能发酵1/3的棉子糖(指单位质量棉子糖只能发酵三分之一的量)，在啤酒酿造中酵母菌漂浮于发酵液面泡沫层中，发酵接近结束时凝聚后漂浮于液面，发酵终了在液面上形成酵母泡盖，发酵液澄清较慢，则发酵液过滤速度相对较慢，啤酒澄清时间亦相对延长。利用本发明的f-h-st26-4菌株酿造的啤酒双乙酰含量低，并赋予啤酒愉悦的花香和果香，且香气活泼，酒体的滋气味、风味及质感优良，这对提升酒体品质，缩短贮酒时间，提高啤酒企业经济效益具有重要的意义。因此，本发明的菌株具有广泛的应用前景。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

生物材料的菌株编号：f-h-st26-4

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2019年12月27日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.19247

附图说明

图1为空间诱变酿酒酵母st26(左侧平板)和地面酿酒酵母gt26(右侧平板)菌落形态结果。

图2为空间诱变酿酒酵母st26(左侧图，草酸铵结晶紫染色法)和空间诱变酿酒酵母st26-4菌株(右侧图，生理盐水浸片法)的细胞形态和一端出芽繁殖结果。

图3为空间诱变酿酒酵母st26菌落ttc显色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，利用excel2007和spss18软件进行分析，结果用平均值±标准差表示。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。

yepd液体培养基：fm828安琪酵母浸粉10g、蛋白胨20g、d(+)-麦芽糖20g、蒸馏水补至1000ml，调节ph6.2，115℃灭菌20min备用。

yepd固体培养基：在yepd液体培养基(1000ml)中加入琼脂粉17g得到的培养基，用于制备yepd琼脂平板。

fm828安琪酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司。

蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司。

d-(+)-麦芽糖：北京生物科技股份有限公司。

麦芽汁培养基：11brix麦芽汁，115℃灭菌20min备用。

麦芽汁固体培养基：11brix麦芽汁1000ml、琼脂17g，115℃灭菌20min备用。

麦芽汁：11brix(11°bx)麦芽汁：北京五星啤酒厂。

糖度单位brix，用符号°bx表示；在20℃条件下，1°bx是100g的麦芽汁中含有1g的麦芽糖，为质量百分比浓度(w/w)。

ttc培养基：

①上层ttc培养基：0.05gttc(显色剂ttc为2,3,5-氯化三苯四氮唑，简称红四氮唑)，0.5g葡萄糖、1.5g琼脂，去离子水补至100ml，沸水煮沸备用；

②下层yepd培养基：fm828安琪酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂17g、蒸馏水补至1000ml，调节ph6.2，115℃灭菌20min备用。

杜氏管发酵培养基：用移液枪吸取5ml11°bx麦芽汁将杜氏小管充满至液体将要流出，再将充满麦芽汁的杜氏小试管延壁倒置入试管中，注意杜氏小管内无气泡，再将移液枪内剩余的麦芽汁沿壁注入试管中，最后再吸取5ml11°bx麦芽汁，115℃高压蒸汽灭菌20min备用。

无菌生理盐水：氯化钠8.5g，蒸馏水补至1000ml，121℃灭菌15min。

无菌吐温-生理盐水：氯化钠8.5g，吐温-801ml，蒸馏水补至1000ml，121℃灭菌15min。

实施例1、空间诱变酿酒酵母发酵性能优良菌株的筛选

1、菌株

空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)st26：由地面酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gt26经天宫二号和神舟十一号飞船搭载返回的太空诱变菌种，保藏于富乐顿生物工程科技(北京)有限公司航天微生物菌种库。为了区别航天搭载前后的菌株差异，将地面酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)gt26航天搭载之后的太空诱变菌株标记为空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)st26。

2、空间诱变酿酒酵母的分离纯化

将冻存于-80℃的地面酿酒酵母gt26甘油保菌管和空间诱变酿酒酵母st26甘油保菌管置于4℃缓冻，于无菌工作台内分别以体积百分比2.0％接种量接种到10ml灭菌麦芽汁培养基中，28℃培养18h，活化三代后，再使用1ml移液枪分别吸取gt26和st26活化后的培养液1ml移入盛有99ml无菌吐温-生理盐水的无菌均质袋中，采用拍击式无菌均质器(型号scientz-ⅱ，宁波新芝生物科技股份有限公司)以6t/sec20min拍打均匀，以移液枪吸取1ml菌液于9ml无菌生理盐水中，梯度稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，用旋涡振荡器(型号ql-901，海门市其林贝尔公司)将试管中的稀释菌液振荡均匀，分别吸取100μl上述4个稀释度的菌液于yepd琼脂平板中，以涂布棒涂布平板至菌液完全均匀干燥，每个稀释度重复三个平行，置于全温双层振荡培养箱(型号hzq-f100，江苏太仓)中15℃静置培养72h(筛选耐受低温发酵菌株)，待其长出单菌落后，观察和描述菌落特征，同时在无菌超净工作台中，于载玻片上用接种环挑取单菌落于少量生理盐水中，混匀涂片、干燥与热固定，以草酸铵结晶紫染色液进行单染色，于显微镜下观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。挑取原始地面酿酒酵母gt26和空间诱变酿酒酵母st26的若干单菌落，分别划线接种于yepd琼脂斜面试管，28℃培养48h后于4℃冷藏保种备用。

结果如图1所示，于yepd琼脂平板上15℃培养长出的原始地面酿酒酵母gt26菌落呈圆形，大小为4～6mm，表面边缘扁平且其中心稍呈钝圆状凸起、光滑湿润、边缘整齐、质地黏稠，不透明，颜色呈乳白色，有典型的酒香味，其菌体细胞形态为椭圆形、卵形、近球形，一端出芽繁殖；于yepd琼脂平板上15℃培养长出的空间诱变酿酒酵母st26菌落呈圆形，大小为4～6mm，表面边缘扁平且其中心稍呈钝圆状及锥状凸起、光滑湿润、边缘整齐、质地黏稠，不透明，颜色呈乳白色，有典型的酒香味，其菌体细胞形态呈椭圆形、卵形、近球形，一端出芽繁殖(图2所示)。

3、发酵性能优良菌株初筛

3.1氯化三苯四氮唑(ttc)显色试验

ttc(2,3,5-氯化三苯四氮唑)是一种显色剂，在氧化态时为无色，还原态时为红色或紫红色，被应用于产乙醇酵母的筛选中，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应，并且通过颜色深浅观察判断酵母呼吸酶活力大小，即酵母产酒精能力的高低。在接种并培养空间诱变酿酒酵母st26的下层yepd培养基平板上，选择菌落数为10～100个的平板倒入冷却至45℃的上层ttc培养基约12ml，覆盖原有菌落，28℃避光培养2～3h，由菌落的颜色判定酵母菌的活力大小(产酒精能力)，颜色越紫红，反映其生命活力越强、产酒精能力越高。以地面酿酒酵母gt26的个体形态和菌落特征为对照，挑选颜色呈深紫红色且菌落较大的单菌落。将第一次挑选出的空间诱变酿酒酵母st26深紫红色的单菌落用灭菌牙签接种至划分小格的下层yepd培养基平板上，长出菌落后再覆盖上层ttc培养基，如此重复上述操作。结果如图3所示，通过ttc显色试验，对比各菌落颜色深浅，从中筛选出呈深紫色菌落的110株产酒精能力强的空间诱变酿酒酵母st26菌株，标记为st26-1至st26-110。

3.2空间诱变酿酒酵母生物量测定

将步骤3.1筛选出的产酒精能力强的110株st26-1至st26-110空间诱变酿酒酵母yepd液体培养物，按2％的接种量分别接入含有10mlyepd液体培养基的试管中，另以地面酿酒酵母gt26作为参照，于28℃培养18h后测定培养液于560nm波长下的od值，每个样品测定三次取平均值记录浊度。比较各菌株培养液od560nm值大小，从110株st26菌株中筛选出45株生物量高于地面酿酒酵母的优良菌株。其中，如表1所示，编号为f-h-st26-4的菌株(即空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4，以下简称为st26-4)的od560nm值为2.829，显著高于地面酿酒酵母gt26菌株(od560nm值为2.816)，说明该菌株的生物量以及生长速度均显著高于地面酿酒酵母gt26，显示在太空条件下该菌株的相关基因发生了正突变。

表1空间诱变酿酒酵母st26菌株生物量测定结果

3.3空间诱变酿酒酵母杜氏小管产气试验

将步骤3.1筛选出的产酒精能力强的110株st26-1至st26-110空间诱变酿酒酵母yepd液体培养物，按2％的接种量分别接入含有10ml麦芽汁培养基的带杜氏小管的试管中，另以地面酿酒酵母gt26作为对照，置于15℃培养48h，记录菌株培养24h和48h的产气量及液面泡沫产气高度，考察菌株的发酵性能。根据产气量多少(发酵速度快慢)和泡沫高度的情况(啤酒的泡持性)，从110株st26菌株中筛选出20株产气速度快于地面酿酒酵母的优良菌株，包括步骤3.2筛选出的生物量较高的st26-4菌株，该菌的产气量和泡沫高度均显著高于地面酿酒酵母gt26(见表2)，即该株菌的产气速度、泡沫高度均高于地面酿酒酵母gt26菌株，表明该空间诱变酿酒酵母产气速度快(起酵能力强)、生长繁殖速度快、凝聚性较强(杜氏小管底部有拇指盖大小的菌泥沉淀，为酵母菌发酵结束状态)，显示在太空条件下该菌株的相关基因发生了正突变，具有良好的啤酒发酵能力。

表2空间诱变酿酒酵母st26菌株杜氏小管产气量与泡沫高度结果

注：表2中，“+”表示产气量为杜氏管的1/4，“++”表示产气量为杜氏管的2/4，“+++”表示产气量为杜氏管的3/4，“++++”表示产气量充满整个杜氏小管；“p”表示泡沫量＜2cm，“pp”表示泡沫量2-4cm，“ppp”表示泡沫量4-6cm，“pppp”表示泡沫量＞6cm。

4、空间诱变酿酒酵母的复筛

4.1空间诱变酿酒酵母遗传稳定性试验

将初筛选出的产气速度快、活力高、产酒精能力强、生物量高的菌株于10ml麦芽汁培养基中传代50代后按照步骤3.2和3.3进行生物量测定、杜氏小管产气试验，以及发酵力试验，考察其遗传稳定性，筛选出遗传稳定的菌株，进行啤酒发酵试验。

发酵力的测定：采用微生物比浊法测定仪(型号wbs-100，北京先驱威锋技术开发公司)，将初筛选出的发酵性能优良的菌株，以2％的接种量接种至10mlyepd培养基中，28℃培养48h，在线测定并记录各st26菌株培养物的od600nm值，并以培养时间为横坐标，od600nm值为纵坐标，自动绘制生长曲线，在该曲线上找出迟缓期的时间(起酵时间)和到达对数生长期末期的时间。迟缓期的时间长短可间接反应出菌株的起酵时间，对数生长期是菌株生长繁殖最旺盛的阶段，迟缓期时间越短，且能越快到达对数生长期的菌株，其发酵力较强。

结果如表3可知，经传代50代后，空间诱变酿酒酵母st26-4菌株的生物量、产气速度、泡沫高度，以及发酵力均高于地面酿酒酵母gt26菌株，说明该株经空间诱变的菌株迟缓期较短，能够较快进入对数生长期，使得起酵速度加快，并具有很好的遗传稳定性，用之进一步做啤酒发酵试验。

表350代传代的空间诱变酿酒酵母st26菌株生物量、产气速度、泡沫高度、发酵力结果

注：表3中，“+”表示产气量为杜氏管的1/4，“++”表示产气量为杜氏管的2/4，“+++”表示产气量为杜氏管的3/4，“++++”表示产气量充满整个杜氏小管；“p”表示泡沫量＜2cm，“pp”表示泡沫量2-4cm，“ppp”表示泡沫量4-6cm，“pppp”表示泡沫量＞6cm。

4.2空间诱变酿酒酵母接种量和培养时间的确定

将筛选出遗传稳定性较好的空间诱变酿酒酵母st26-4菌株按2％接入yepd液体培养基中，28℃培养18h，连续三代活化后，按2％、3％、4％、5％、10％分别接入10mlyepd液体培养基中，28℃培养24h，在波长560nm下，测定并记录培养10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h菌悬液的od值(光密度值/浊度)，测量三次取平均值。

由表4可知，将st26-4菌株按接种量2％、3％、4％、5％、10％培养至24h，细胞浓度与光密度值成正比，od值随培养时间的延长呈现先增大后减少的趋势，结果显示在16h处可到达对数生长期转折点(末期)，即最大od值为2.043；而接种量为3％培养时间至16h时，能最快到达对数生长期转折点，od值最大为2.044，与2％的最大od值相差不大，考虑到后期工业化生产的成本，最终确定接种量为2％。结论：确定空间诱变酿酒酵母st26-4菌株的最适接种量为2％，培养时间为16h。

表4空间诱变酿酒酵母st26-4菌株最适接种量和培养时间的生物量(od值)结果

4.3空间诱变酿酒酵母发酵麦芽汁降糖试验

将筛选出的遗传稳定性较好的空间诱变酿酒酵母st26-4菌株甘油保种管按2％接种量接入10ml无菌麦芽汁[华润雪花啤酒(中国)有限公司]中，28℃培养16h活化两代后，使st26-4菌株培养液中的活菌数达到3.0×10⁸cfu/ml，再按2％(6.0×10⁶cfu/ml)接种量接入盛有200ml无菌麦芽汁的500ml三角瓶中(记为发酵0d)，置于全温双层振荡培养箱中15℃发酵7d，其中前3d以180r/min摇瓶发酵3d，后4d静置发酵，分别测定发酵0d的发酵液的麦芽汁糖度，以及发酵第3d、5d、7d发酵液的糖度，测量四次取平均值，根据第7天降糖结果，检测该空间诱变酿酒酵母菌株的发酵速度。以地面酿酒酵母gt26和中国专利申请201810811754.3(公开日2018-11-30)中的酿酒酵母st28-61作为对照。其中，利用手持式折光仪测定麦芽汁糖度步骤如下：(1)校正零点。取蒸馏水数滴，放于检测棱镜上，拧动零位调节螺栓，使分界线调至刻度0％位置，而后用软布仔细擦净检测棱镜。(2)样品测定。打开折光仪盖板，取20℃的待测发酵麦芽汁数滴，置于检测棱镜上，轻轻合上盖板，避免气泡产生，使溶液遍布棱镜表面。将仪器进光板对准光源或明亮处，眼睛通过目镜观察视场，转动目镜调节手轮，使视场的蓝白分界线清晰。分界线的刻度值即为麦芽汁的糖度(°bx)。

酵母菌发酵麦芽汁过程中的降糖速度与发酵速度呈正相关。由表5可见，随着发酵时间的延长，麦芽汁的糖度逐渐下降，于0～5d高泡期阶段麦芽汁降糖速度较快，st26菌株每天以1.0～1.5°bx的降糖速度下降，至第7天发酵麦芽汁的糖度结果由小至大顺序是：st26-4＜gt26＜st28-61。与地面gt26菌株相比，st26-4菌株的降糖指标是gt26菌株的1.30倍；与酿酒酵母st28-61菌株相比，st26-4菌株的降糖指标是st28-61菌株的1.43倍。由此可见，空间诱变酿酒酵母st26-4为发酵麦芽汁降糖速度和发酵速度较快的优良菌株。

表5st26-4和st28-61菌株不同发酵时间测定麦芽汁糖度(°bx)结果

4.4空间诱变酿酒酵母5l发酵罐啤酒发酵试验

将筛选出的遗传稳定性较好的空间诱变酿酒酵母st26-4甘油保种管按2％接种量接入10ml无菌11°bx麦芽汁中，28℃培养16h活化两代后，再按2％接种量接入100ml无菌11°bx麦芽汁中，28℃，180r/min摇瓶培养16h后，得到活菌数为3.0×10⁸cfu/ml的酒母(酵母菌种子液)。将酒母按3％(9.0×10⁶cfu/ml)接种量接入盛有2.5l、10°bx无菌麦芽汁[10°bx麦芽汁：华润雪花啤酒(中国)有限公司]的5l发酵罐[型号：5l/dm9000a，德镁生物科技(上海)有限公司]中，控制15℃发酵7d，其中前3d每日通氧气6次，搅拌转速为150～180r/min，后4d静置发酵，得到初级发酵液；第7d测定初级发酵液中麦芽汁的糖度，封罐后将初级发酵液继续发酵8d，期间利用发酵罐冷却系统每日降低2℃发酵液温度，最后降至4～5℃，并在此温度下维持发酵3d，得到啤酒发酵液。第15d检测啤酒发酵液的ph、酒精度、双乙酰含量，测量四次取平均值，同时进行感官评分，检测方法参照gb4927—2008、gb/t4928—2008啤酒分析方法。以地面酿酒酵母gt26作为对照。

(1)酒精度测定：参照国家标准gb/t4928—2008中的密度瓶法(第一法)测定酒精度，结果以公式(1)进行计算。

其中：——试样酒精蒸馏液(20℃)的相对密度；

m2——密度瓶和蒸馏液的质量，单位为克(g)；

m——密度瓶的质量,单位为克(g)；

m1——密度瓶和水的质量，单位为克(g)。

根据相对密度查gb/t4928—2008附录a，得到试样蒸馏液酒精含量的体积分数，即试样的酒精度。

(2)双乙酰测定：参照国家标准gb/t4928—2008中的方法测定双乙酰，结果以公式(2)进行计算。

x5＝a335×1.2............公式(2)

其中：x5——试样的双乙酰含量，单位为毫克每升(mg/l)；

a335——试样在波长335nm下，用20mm石英比色皿测得吸光度；

1.2——用20mm英比色皿时，吸光度与双乙酰含量的换算系数。

(3)糖度测定：利用手持式折光仪测定，方法同4.3步骤。

(4)ph测定：利用phs-3bph计测定。

(5)啤酒品质评分：邀请10名专业品酒师进行感官评分，评价方法参照国家标准gb4927—2008，啤酒感官评分标准见表6。按照表6啤酒感官评分标准的要求，对上述发酵15d的啤酒发酵液，从色泽、泡沫、口味、香气四个方面进行综合感官评价。

(6)花香和果香化合物的检测：利用flavourspec气相色谱离子迁移谱仪(型号：flavourspec，德国g.a.s.公司)测定啤酒风味物质组成分析。①试验组样品：编号st26-4，空间诱变酿酒酵母st26-4菌株发酵15d的啤酒发酵液；对照组样品：编号gt26，地面原始酿酒酵母gt26发酵15d的啤酒发酵液。②样品处理：取样品1ml置于20ml顶空瓶中待分析。③气相-离子迁移谱单元分析条件：分析时间30min；色谱柱类型fs-se-54-cb-115mid:0.53mm；柱温60℃；载气/漂移气n2；ims温度45℃。④自动顶空进样单元分析条件：孵化温度40℃；孵化时间15min；进样体积500μl；进样针温度85℃；孵化转速500r/min。④分析软件：仪器配套的分析软件包括lav(laboratoryanalyticalviewer)和三款插件以及gc×imslibrarysearch，可以分别从不同角度进行样品分析。⑤测量三次取平均值，并进行数据处理与分析。

所述分析软件包括①lav：用于查看分析谱图，图中每一个点代表一种挥发性有机物；对其建立标准曲线后可进行定量分析；②reporter插件：直接对比样品之间的谱图差异(二维俯视图和三维谱图)；③galleryplot插件：指纹图谱对比，直观且定量地比较不同样品之间的挥发性有机物差异；④dynamicpca插件：动态主成分分析，用于将样品聚类分析，以及快速确定未知样品的种类；⑤gc×imslibrarysearch：应用软件内置的nist数据库和ims数据库可对物质进行定性分析。

表6啤酒感官评分标准

表7st26-45l发酵罐啤酒发酵液理化指标结果

表8淡色啤酒理化要求(啤酒gb4927—2008国家标准)

表9st26-45l发酵罐啤酒发酵液的感官评价

酿造啤酒需要考察众多理化指标，其中双乙酰含量的口阈值超过0.15mg/l时，就会影响啤酒品质，使风味变劣，产生馊饭味。由表7和表8可知，st26-4的啤酒发酵液中的双乙酰含量显著低于gt26啤酒发酵液(st26-4啤酒发酵液为0.027mg/l，gt26啤酒发酵液为0.190mg/l)；与地面菌株gt26相比，st26-4的啤酒发酵液中的双乙酰含量低于国家标准gb4927—2008一级啤酒的要求(≤0.15mg/l)，并且还低于国家标准gb4927—2008优级啤酒的要求(≤0.10mg/l)；st26-4啤酒发酵液中酒精含量显著高于gt26啤酒发酵液，其含量是gt26啤酒发酵液的2.5倍[st26-4啤酒发酵液为4.79％(v/v)，gt26啤酒发酵液为1.95％(v/v)]。由表9可见，st26-4啤酒发酵液感官评分为95分以上，其色泽金黄澄清透明、无悬浮物，泡沫洁白更细腻、持久性好，具有啤酒的酒花香气，口味纯正、爽净、杀口、醇厚，无馊饭味，并含有愉悦的花香和果香，且香气活泼，酒体的滋气味、风味及质感优良。利用flavourspec气相色谱离子迁移谱技术测定啤酒风味化合物组成，结果显示，空间诱变酿酒酵母st26-4的啤酒发酵液中丙酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯、异丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸甲酯、己酸丁酯、dl-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯8种酯类化合物的含量显著高于gt26啤酒发酵液。其中己酸丁酯具有菠萝香气味，其含量是gt26啤酒的4.5倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为17573.68，gt26啤酒发酵液峰体积为3876.19)；dl-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯具有清新的黑莓气味，该物质含量是gt26啤酒的3.4倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为255.86，gt26啤酒发酵液峰体积为74.67)；己酸乙酯具有甜果菠萝香气味，其含量是gt26啤酒的1.5倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为16942.46，gt26啤酒发酵液峰体积为11625.48)；异丁酸乙酯具有甜香果味，其含量是gt26啤酒的1.3倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为1781.12，gt26啤酒发酵液峰体积为1373.26)；乙酸异丁酯具有成熟水果香气，其含量是gt26啤酒的1.2倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为5732.56，gt26啤酒发酵液峰体积为4675.21)；己酸甲酯具有菠萝醚味，其含量是gt26啤酒的1.8倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为352.62，gt26啤酒发酵液峰体积为192.29)；丁酸乙酯具有香蕉、菠萝气味，其含量是gt26啤酒的1.2倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为5086.39，gt26啤酒发酵液峰体积为4406.67)。这些酯类化合物能够赋予st26-4啤酒含有甜果味、菠萝味、香蕉味、清新黑莓味等甜香水果香气味(见表10)。此外，芳樟醇和β-苯乙醇的醇类化合物含量亦显著高于gt26啤酒。芳樟醇具有柑橘花香和玫瑰木香，其含量是gt26啤酒的1.6倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为269.87，gt26啤酒发酵液峰体积为171.23)；β-苯乙醇具有甜香和花香气味，并带有玫瑰般的蜂蜜味，其含量是gt26啤酒的1.3倍(st26-4啤酒发酵液峰体积为368.82，gt26啤酒发酵液峰体积为280.83)。这些醇类化合物能够赋予st26-4啤酒含有柑橘花香、玫瑰木香，并带有玫瑰般的蜂蜜味等甜香花香气味(见表10)。综上所述，在st26-4啤酒中存在大量的酯类、醇类等物质，为st26-4啤酒带来了花香、果香气味，与感官评价相符,是感官评价中显著优于gt26啤酒的物质基础。

表10不同风味化合物的气味

结论：st26-4的发酵麦芽汁降糖速度和发酵速度较快、啤酒发酵液酒精含量较高，且啤酒感官评分较高，含有愉悦的花香和果香，且香气活泼，酒体的滋气味、风味及质感优良，以及啤酒发酵液中的双乙酰含量均低于国家标准gb4927—2008优级啤酒的要求(≤0.10mg/l)，可成为酿造啤酒的优良菌株。

4.5优良菌株鉴定

将筛选出的优良菌株st26-4划线接种至yepd培养基平板上，28℃培养2d，观察其菌落特征并以生理盐水浸片法观察其细胞形态和出芽繁殖方式。取单菌落接种至10mlyepd液体培养基中,28℃培养16h，于4℃以7000r/min离心2min，弃上清液，取菌泥，利用真菌基因组dna快速抽提试剂盒(北京擎科生物科技有限公司)提取酵母菌的dna，以真菌18srdna通用引物——上游its1(5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′)和下游its4(5′-tcctccgcttattgatatgc-3′)，进行pcr扩增并对所得pcr产物外送测序[生工生物(上海)工程股份有限公司]，将测序结果在ncbi数据库进行blast同源性序列比对分析，确定菌株的种属地位。

st26-4菌株的pcr产物的序列为序列表中序列1，与酿酒酵母的同一性为99％。该株菌的细胞形态为椭圆形、卵形、近球形，一端出芽繁殖(图2所示)，于yepd培养基平板上28℃培养长出的菌落呈圆形，大小为5～6mm，表面边缘扁平且其中心稍呈锥状凸起、光滑湿润、边缘整齐、质地黏稠，不透明，颜色呈乳白色，有典型的酒香味。

经过形态学及18srdna测序分析鉴定，可以确定st26-4菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，鉴定结果见表11。

表11空间诱变酿酒酵母st26筛选优良菌株鉴定结果

空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4已于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.19247。空间诱变酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)f-h-st26-4的获得时间为2018年7月。

<110>富乐顿生物工程科技（北京）有限公司

<120>一种空间诱变酿酒酵母st26-4及其在酿造啤酒中的应用

<160>1

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<213>酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）

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