识别人乙型肝炎病毒核心抗原C18-27表位的特异性TCR的制作方法

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，尤其涉及能特异性识别并结合人乙型肝炎病毒核心抗原的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

背景技术：

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)引起的一种肝脏感染性炎症，是病毒性肝炎中最严重的一种类型。hbv是一个部分环状的双链dna病毒，全基因组长约3.2kb，包含4个部分重叠的开放阅读框(orf)：s(pres1/pres2/s)orf编码乙肝表面抗原(hbsag)；c(即precore/core)orf编码乙肝e抗原(hbeag)和核心抗原(hbcag)；xorf编码hbx蛋白；porf编码聚合酶蛋白。根据hbv全基因组序列差异≥8％分为a、b、c、d、e、f、g、h、i和j共10个基因型。欧美等国家流行的hbv病毒基因型主要是a和d型,而我国流行的hbv病毒基因型主要是b和c型。

hbv感染可以引起急性和慢性肝脏疾病，患者死于肝硬化和肝癌的风险显著升高。据世界卫生组织(who)公布的数据，全球有20亿人曾感染过hbv，其中3.5亿人以上为慢性hbv携带者，每年约有100万人死于hbv感染所引起的相关性疾病，包括肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌等。乙型肝炎已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，是全球主要公共卫生问题之一，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病，估计我国hbv病毒携带者约有9300万，其中3000万为慢性乙型肝炎患者。

目前，慢性乙型肝炎的治疗方案主要是依赖于干扰素或核苷(酸)类似物，虽然这些治疗可以有效地控制病毒复制，但对于绝大多数患者来说并不能有效的根除病毒，患者需要终身服药。因而，一旦治疗中断，存在于宿主细胞核中的hbv共价闭合环状dna(cccdna)便会驱动病毒反弹和疾病复发。长期服用这些药物治疗不仅费用昂贵，而且还会出现毒副作用或耐药。因此，目前迫切需要一种新的、有效的、无或较小毒副作用的靶向hbv的治疗方法。

hbv对细胞的感染和转化使得细胞表达hbv特异的抗原，如核心抗原，这些抗原在正常人体组织中并无表达，是理想的t淋巴细胞识别并杀伤被感染细胞的靶点。然而，研究显示在慢性hbv患者的外周血中没有或仅存在数量稀少的hbv特异性t细胞。使用t细胞受体基因修饰t淋巴细胞(tcr-t)的过继免疫疗法通过将可识别hbv抗原的tcr基因整合至患者t细胞中，使得原本不具备抗原特异性识别能力的t细胞可识别并杀伤表达相应hbv抗原的靶细胞，从而达到治疗肝炎和肝癌的目的。

分离并鉴定得到特异性、亲和力良好的t细胞抗原受体(tcellreceptor,tcr)是实施tcr-t治疗的基础。不同tcr分子的特性赋予了tcr-t产品不同的效用功能。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是背景技术中的一些缺陷，提供一种能识别并结合hla-a2-hbv-c18-27抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物的用途。

所述hla-a2-hbv-c18-27抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a2及hbv核心抗原短肽(flpsdffpsi)或突变体(flpsdffpsv)组成，表达于目标靶细胞表面。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

一方面，本发明提供一种识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr，所述tcr具有结合hla-a2-hbv-c18-27抗原复合物的特性，所述tcr包含tcrα链可变区和/或tcrβ链可变区；

所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为cavspnnndmrf(seqidno：7)；

所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为casssreqakniqyf(seqidno：10)。

优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：seqidno：5，

αcdr2：seqidno：6，

αcdr3：seqidno：7。

更优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：seqidno：11，

αcdr2：seqidno：12，

αcdr3：seqidno：13。

优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：seqidno：8，

βcdr2：seqidno：9，

βcdr3：seqidno：10。

更优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：seqidno：14，

βcdr2：seqidno：15，

βcdr3：seqidno：16。

优选的，以上所述的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seqidno：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

优选的，tcrα链可包含seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的全部序列。

优选的，以上所述的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr，所述tcrβ链可变区的氨基酸序列为与seqidno：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

优选的，tcrβ链可包含seqidno：8、seqidno：9和seqidno：10的全部序列。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码第一方面所述的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr或tcr链的核苷酸序列或其互补序列。

优选的，所述核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seqidno：3和/或包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seqidno：4。

第三方面，本发明提供一种载体，所述载体含有第二方面所述的核酸分子。

优选的，所述载体为病毒载体。

更优选的，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

第四方面，本发明提供一种细胞，所述细胞转导第二方面所述核酸分子或第三方面所述载体，所述细胞可表达结合hla-a2-hbv-c18-27抗原复合物的特异性tcr。

优选的，所述细胞为t细胞或干细胞。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含以上任一所述的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体或以上任一所述的细胞作为活性成分。

本发明还提供以上任一所述的识别hbv-c18-27抗原的tcr、以上任一所述的核酸分子、以上任一所述的载体、以上任一所述的细胞、以上任一所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物。

优选的，以上任一所述的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr、任一所述的核酸分子、任一所述的载体、任一所述的细胞、任一所述的药物组合物分别用于制备治疗或预防hbv感染的各类疾病的药物；进一步地，用于制备治疗肝炎和肝癌的药物。

与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

本发明提供了能特异性识别并结合hla-a2-hbv-c18-27抗原复合物的tcr，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导所述核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备治疗肿瘤或病毒感染的药物的用途。

本发明提供的识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr具有特异性识别人乙型肝炎病毒核心抗原、亲和性良好，使得原本不具备抗原特异性识别能力的t细胞可识别人乙型肝炎病毒核心抗原并杀伤表达相应人乙型肝炎病毒核心抗原的靶细胞，从而达到治疗肝炎和肝癌的目的。

附图说明

图1为插入逆转录病毒载体的tcr序列元件示意图；

图2流式细胞术检测hla-a2-hbv-c18-27特异tcr-t细胞的转导效率；

图3为酶联免疫吸附实验(elisa)检测tcr-t细胞与靶细胞共培养后释放细胞因子ifn-γ的能力；

图4为elisa检测tcr-t细胞分别与人肝癌细胞系hepg2(hla-a2阳性且hbv核心抗原阴性)和hepg2.2.15(hla-a2阳性且hbv核心抗原阳性)共培养后，特异性释放细胞因子的能力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，附图中类似的组件标号代表类似的组件。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：hla-a2-hbv-c18-27特异性t细胞的克隆及测序

利用化学合成的短肽flpsdffpsi(生工生物工程(上海)股份有限公司)体外刺激来源于hla-a2基因型且hbv阳性患者的外周血单个核细胞(pbmc)。经过2轮多肽刺激后，将多克隆t细胞(1×10⁵)与1×10⁵负载flpsdffpsi短肽(靶细胞)或非目标短肽的t2细胞(对照细胞)于37℃共培养过夜。第二天检测培养上清中细胞因子ifn-r的释放量。将阳性多克隆t细胞(靶细胞od450-对照细胞od450>1.0)进行有限稀释克隆，14天后elisa检测有限稀释后各孔t细胞与靶细胞的反应性。挑取阳性单克隆t细胞进行快速扩增。快速扩增14天后，用hla-a2-hbv-c18-27五聚体染色(proimmune)对t细胞进行染色，经流式细胞仪分选出五聚体染色阳性的目标t细胞。

分选后的t细胞(2-5×10⁶)经离心去除上清后重悬于1mltrizol(rneasyplusuniversalminikit，qiagen)，液氮速冻后送测序(免疫组库测序，苏州金唯智生物科技有限公司)。根据测序结果将测得频率最高的tcrα链及tcrβ链进行配对，pcr构建包含恒定区的全长tcr(tcr序列的元件示意图如图1所示)并插入逆转录病毒载体中。

其中，tcrα链可变区氨基酸序列为seqidno：1。

tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：drgsqs(seqidno：5)，

αcdr2：iysngd(seqidno：6)，

αcdr3：cavspnnndmrf(seqidno：7)。

tcrα链可变区核苷酸序列为seqidno：3。

tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：gaccgaggttcccagtcc(seqidno：11)，

αcdr2：atatactccaatggtgac(seqidno：12)，

αcdr3：tgtgccgtgtcccccaataacaatgacatgcgcttt(seqidno：13)。

tcrβ链可变区氨基酸序列为seqidno：2。

tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：mnhey(seqidno：8)，

βcdr2：smnvev(seqidno：9)，

βcdr3：casssreqakniqyf(seqidno：10)。

tcrβ链可变区核苷酸序列为seqidno：4。

tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：atgaaccatgagtat(seqidno：14)，

βcdr2：tcaatgaatgttgaggtg(seqidno：15)，

βcdr3：tgtgccagcagttctagggagcaggccaaaaacattcagtacttc(seqidno：16)。

实施例2：制备hla-a2-hbv-c18-27特异性tcr-t细胞

将目标tcr克隆至逆转录病毒载体pmsgv1中(addgene)构建pmsgv1-tcr载体。转染病毒包装细胞系293gp细胞pmsgv1-tcr及pvsv-g质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导t细胞。

转染操作如下：第0天将293gp细胞接种至6孔板(6×10⁵/孔)；第1天，pmsgv1-tcr及pvsv-g质粒转染293gp细胞(2μgpmsgv1-tcr及1.4μgpvsv-g/孔)，同一天，采用抗人cd3抗体(okt3)活化健康人的pbmc；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的dmem)至293gp细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的t细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的t细胞；第5天将转染后的t细胞收集至t25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300iu/mlil2的x-vivo(lonza))。第10天流式检测目标tcr的表达水平，如图2所示，tcr的转导效率(五聚体染色的阳性率)为39％。

实施例3：hla-a2-hbv-c18-27特异性tcr-t的体外功能验证

elisa检测:将分别负载hbv-c18-27多肽(flpsdffpsi)、突变体多肽(flpsdffpsv)和来源于hbv聚合酶蛋白的hla-a2限制性表位p575-583(fllslgihl)的t2细胞(hla-a2+)与tcr-t细胞于37℃共培养16小时后，elisa检测t细胞特异性识别相应表位后细胞因子ifn-γ的释放，如图3所示，tcr-t可特异性识别hbv-c18-27多肽(flpsdffpsi)和突变体(flpsdffpsv)并释放细胞因子，且不识别来源于hbv聚合酶蛋白的hla-a2限制性表位。

elisa检测：将hla-a2+且hbv+的人肝癌细胞系hepg2.2.15(atcc)和hla-a2+且hbv-的人肝癌细胞系hepg2分别与tcr-t细胞进行共培养(37℃，16小时)，取培养上清检测ifn-γ的释放量，如图4所示，tcr-t不能识别无内源性hbv核心抗原表达的hepg2细胞，只特异性识别表达内源hbv核心抗原的hepg2.2.15细胞并释放细胞因子，且该特异性识别能力可被anti-hla-a/b/c抗体阻断，表明该tcr确是通过识别hla多肽复合物发挥功能。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>深圳市因诺转化医学研究院；深圳因诺免疫有限公司

王,明军

马,意朋

区,家裕

林,通

<120>识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr

<141>2020-05-22

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

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<211>110

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<213>homosapiens

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202530

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354045

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