一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法与流程

本发明属于病毒检测技术领域，公开了一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎（coronavirusdisease2019，covid-19），简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是指2019新型冠状病毒（sars-cov-2）感染导致的肺炎，其被鉴定为一种含单股正链rna(ssrna)的beta型冠状病毒（betacoronavirus），其结构与严重急性呼吸综合征sars极其相似，新型冠状病毒基因与sarsr-cov和mersr-cov有70%和40%左右序列相似性，与蝙蝠病毒tg13的全基因组序列一致性高达96%。核酸的主要序列包括有e(envelopeproteingene)，m(membraneproteingene)，n(nucleocapsidproteingene)，s(spikeproteingene)，orf(openreadingframe)和rdrp(rna-dependentrnapolymerasegene)。该病毒可借助飞沫，气溶胶，粪口等方式在人群间进行传播感染。新冠病毒（sars-cov-2）可通过其表面s-蛋白与人的ace2受体互作的分子机制，来感染人的呼吸道上皮细胞。目前针对冠状病毒的临床诊断方法有很多，胸部ct扫描，分子诊断技术，免疫层析法等。ct扫描技术方便但特异性不够，可辅助确诊；免疫层析法操作简单，但特异性和灵敏度很差，易造成结果假阴性和假阳性，不适用临床确诊；分子诊断技术相比较而言，灵敏度高，特异性强，适用于新型冠状病毒的临床确诊及诊断。

甲型h1n1流感病毒【influenzaa(h1n1)virus】是一种亚型流感病毒，属于急性呼吸道传染病，及易在人群中传播。与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型h1n1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。2009年开始，甲型h1n1流感在全球范围内大规模流行。目前针对甲型h1n1流感病毒的临床诊断方法主要有实验室检查（包括外周血检查白细胞数量、血生化检测及核酸检测）和胸部影像学检测。

本次发明所设计的双通路双探针实时等温检测技术，是结合了荧光定量技术qpcr(quantitativereal-timepcr,qpcr)以及环导等温核酸扩增（lamp)的反转录pcr技术。双探针引物实时等温同步检测新型冠状病毒sars-cov-2和甲型h1n1流感病毒的多重实时荧光定量pcr检测方法是将标准的lamp引物与荧光和淬灭基团双区域相结合，通过解链时产生的荧光信号来检测目的片段，每扩增1条dna链就有1个荧光分子形成，从而实现了荧光信号与pcr产物的等比例增加，进而达到定量检测的目的。lamp是指在恒温（60-65℃）的条件下，利用6条特殊设计的引物和具有链置换活性的dna聚合酶在短时间内特异、高效、快速、精确地扩增8段病毒dna片段的新技术。将lamp和荧光定量qpcr技术相结合，该方法可以同时在一个lamp反应管中检测1-4个目的片段，重复性和敏感性高，可以检测到100copies以下的人类基因组dna。双探针双通路实时等温技术可以在同一个反应体系中检测出两种病毒，节约了扩增体系中各试剂的使用量，降低检测成本，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，可被广泛应用于基础研究、疾病研究、肿瘤的诊断等方面，成为分子生物学研究中的重要工具。

技术实现要素：

发明目的：本发明属于病毒检测技术领域，公开了一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法，本检测方法具有很高特异性及灵敏度。

优选的，本发明根据新型冠状毒（sars-cov-2）基因组序列高度保守基因orf1ab基因和甲型h1n1流感病毒ha基因设计2组效率高、特异性强的引物，设计2组不同的探针可以进行双色荧光标记（新型冠状病毒orf1ab基因和甲型h1n1流感病毒ha基因)，增加检测结果的准确性和特异性。

优选的，本发明优化了试剂组合，在保证酶活性的情况下，搭配了反应缓冲液，减少了检测人员的操作步骤，降低了检测中由于操作失误导致检测结果有误。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案是包括以下步骤：第一步，引物、人工合成rna和阳性对照质粒的合成：针对新冠病毒的保守区orf1ab基因和甲流h1n1病毒ha基因设计引物和探针。体外合成新型冠状病毒sars-cov-2和甲型h1n1流感病毒目的基因的rna片段和dna质粒。

第二步，分别以所述待测样品提取rna核酸、人工合成rna、阳性对照质粒为模板，使用特异性引物和探针进行real-timelamp反应，仪器通道同时选择fam通道和hex通道进行实验：

1.real-timelamp扩增反应的20μl反应体系为：sars-cov-2orf1ab基因rna和甲流h1n1病毒ha基因rna混合液2μl(0.01pg-1μg)，sars-cov-2orf1ab基因探针引物（4.4μm)1μl，甲流h1n1探针引物（4.4μm)1μl，反应液10μl，depc水6μl；

2.real-timelamp扩增参数为：65℃共120个循环；fam和hex通路，30秒采集一次荧光信号；

3.鉴定结果判断：本发明的检验实验范围在20分钟至40分钟内，时间过短不足检测出结果造成假阴性，实践过长会产生假阳性，如果检测结果fam通道和hex通道扩增曲线有明显起峰，检测ct值均<80，则可判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）和甲型h1n1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果fam通道扩增曲线有明显起峰检测ct值为<80，则可判断为甲型h1n1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果hex通道扩增曲线有明显起峰检测ct值为<80，则结果判断为新型冠状病毒(sars-cov-2）核酸阳性，否则为阴性。

第三步，反应体系灵敏性试验：对阳性sars-cov-2核酸进行荧光pcr检测，当浓度以10倍的稀释梯度逐渐从1/10降低至1/100000时，其rfu结果达到阈值时的循环数（ct）均小于80。同时在阳性患者rna浓度初始值为8.2ng/ul的基础条件下，浓度稀释比例达到100000倍，仍有循环数(ct)低于80的结果呈现，新型冠状得病毒的最低检测值可达到1/100000，该方法具有良好的敏感性。

进一步地，所述第一步中sars-cov-2特异性引物及探针序列如图1。

进一步地，述第一步中甲型h1n1流感病毒特异性引物及探针序列如图2。

所述第一步中合成重组阳性对照质粒dna序列为，

sars-cov-2病毒orf1ab基因片段：

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甲型h1n1流感病毒ha基因片段：

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本发明有益结果是：检测sars-cov-2病毒和甲型h1n1流感病毒的所用的rna样本的最小浓度大于0.01pg/ul，初始浓度sars-cov-2病毒为9-10ng/ul，甲型h1n1流感病毒rna初始浓度为10-20ng/ul，最小检测浓度大于0.01pg/ul。用于检测sars-cov-2及h1n1病毒的rna,所测得循环值(cyclethreshold,ct)为ct<80，灵敏性测试结果也表明该方法的敏感性好。本实验采用neb的bstdna聚合酶及逆转录酶的特异性好，结果特性强；采用一步法rt-qpcr，两种病毒rna逆转录和pcr反应在全封闭状态下的同一管内完成，避免了对环境的污染和由此导致的假阳性。因此该检测方法适用于任何科研实验室高校以及医疗卫生单位等，可以同时区分开sars-cov-2病毒和甲型h1n1病毒。综上所述，本发明提供的方法特异性强、灵敏度高、重复性好，操作简便，并且检测速度快。

附图说明

图1为新型冠状病毒sars-cov-2的引物及探针序列。

图2为甲型h1n1流感病毒的引物及探针序列。

图3为新冠病毒全基因组基因图谱。

图4为荧光定量后的人工合成的新型冠状病毒(sars-cov-2)rna浓度（8.162ng/ul）及甲型h1n1流感病毒rna浓度（19.8.ng/ul）进行荧光qpcr检测结果。

图5为新型冠状病毒(sars-cov-2)阳性患者rna稀释比例如下：

a=1:1，

b=1:10，

c=1:100，

d=1:1000，

e=1:10000，

f=1:100000，

qpcr结果显示，在梯度稀释至1/100000时ct值<80。

具体实施方式

一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法。使用双重实时荧光等温平台技术同步检测新型冠状病毒sars-cov-2和甲型h1n1流感病毒的检测方法，包括如下步骤：

（一）仪器与试剂

荧光光定量pcr仪(bio-radcfx96touch)，

无核酸酶的并且pcr管盖透光性好的pcr管，

0-2μl移液枪(eppendorf)，

1-10μl移液枪(eppendorf)，

2-20μl移液枪(eppendorf)，

10-100μl移液枪(eppendorf)，

20-200μl移液枪(eppendorf)，

200-1000μl移液枪(eppendorf)，

病毒rna逆转录试剂盒（superscripttmiiifirst-strandsynthesissystem，thermofisher)，

dna回收试剂盒(e.z.n.a.®gelextractionkit，omegabio-tek)，

ta克隆试剂盒（peasy®-t1cloningkit，transgenbiotech)，

质粒提取试剂盒（endofreemineplasmidkitⅱ,无内毒素质粒小提中量试剂盒，tiangen)。

（二）准备样本和核酸提取：对于临床样本，我们将采集的鼻、咽拭子等样本经病毒rna提取试剂盒提取纯化获得sars-cov-2病毒核酸rna及甲型h1n1流感病毒rna（该步骤至少需要在p3实验室进行，减少污染源传播），并在-40℃~-80℃条件下保存备用。

（三）引物和标准品质粒的合成：针对新冠病毒的保守区orf1ab基因和甲型h1n1流感病毒ha基因设计两组引物和探针。体外合成新冠病毒dna序列合成标准品重组质粒及甲型h1n1流感病毒dna质粒。具体引物和探针信息如图1、图2。

（四）对sars-cov-2病毒rna和甲型h1n1流感病毒rna进行real-timelamp反应。

1.按照所述体系进行加样，real-timelamp扩增反应的20μl反应体系为：sars-cov-2病毒rna和甲型h1n1流感病毒rna混合后取2μl(5ng/μl-10ng/μl)，sars-cov-2病毒和甲型h1n1流感病毒引物探针混合液(4.4μm)2μl，反应液10μl，depc水6μl。先加阴性对照（阴性对照不加病毒rna,以depc水代替样本），再加样本。盖紧管盖，混匀后1800rpm离心5sec。加样结束后，立即将剩余试剂放入-20℃冰箱保存。

2.将各反应管按顺序放入pcr仪,按下列条件进行反应，仪器通道同时选择fam通道和hex通道进行实验。反应体积为20ul。real-timelamp扩增参数为：恒温65℃，30秒采集一次荧光信号，120个循环。

3.鉴定结果判断：如果检测结果fam通道和hex通道扩增曲线有明显起峰，检测ct值均<80，则可判断为新型冠状病毒（sars-cov-2）和甲型h1n1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果fam通道扩增曲线有明显起峰检测ct值为<80，则可判断为甲型h1n1流感病毒核酸阳性，否则为阴性；如果hex通道扩增曲线有明显起峰检测ct值为<80，则结果判断为新型冠状病毒(sars-cov-2）核酸阳性，否则为阴性。

4.反应体系灵敏性试验：反应体系灵敏性试验：对阳性sars-cov-2核酸进行荧光pcr检测，当浓度以10倍的稀释梯度逐渐从1/10降低至1/100000时，其rfu结果达到阈值时的循环数（ct）均小于80。同时在阳性患者rna浓度初始值为8.2ng/ul的基础条件下，浓度稀释比例达到100000倍，仍有循环数(ct)低于80的结果呈现，新型冠状得病毒的最低检测值可达到1/100000，该方法具有良好的敏感性。

本发明用于新型冠状病毒sars-cov-2和甲型h1n1流感病毒检测的real-timelamp技术，采用了高灵敏稳定性好rna反转录及扩增反应液，所有反应集于一管，减少了反应液成本，最大程度降低样本处理错误，缩短设置时间，可灵敏稳定地扩增两组病毒rna靶点；特异性的引物探针，实现定量荧光信号的标准化，可快速简单地设置反应，1小时内获得检测结果。该技术特点节约时间，降低检测成本、提高实验室的运作效率；同时方法灵敏度高，经济节约，性价比高。

序列表

<110>尹秀山

<120>一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(未知)

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