一种乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物及应用、试剂盒的制作方法

本发明涉及肿瘤分子诊断
技术领域：
，尤其涉及一种乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物及应用、试剂盒。
背景技术：
：乳腺癌是在女性中常见的恶性肿瘤之一，在美国等西方国家约有11％的女性患有乳腺癌。在我国，随着城市化的扩大和生活方式的改变，乳腺癌患者以每年160万的速度在快速增加，每年因乳腺癌死亡的患者高达120万。乳腺癌患者在接受治疗后死亡的主要原因是肿瘤的耐药与转移，而癌症干细胞具有抵抗放疗和化疗的特点，因此被认为是肿瘤耐药和转移从而导致治疗方案失败的根源。传统的放疗与治疗手段被证明导致了乳腺癌干细胞在肿瘤中的富集。新的治疗方案有：根据肿瘤干细胞的标志物特征靶向消除癌症干细胞、抑制乳腺干细胞癌变的信号传导通路。但目前针对乳腺癌干细胞相关的标志物和信号通路的靶向治疗都存在问题：目前还没有找到有治疗价值的特异性的乳腺癌干细胞标记物；信号转导通路在正常细胞中也会表达，通过抑制通路的药物也被报道具有严重的副作用。因此，寻找更具有特异性的分子事件，从而为乳腺癌的治疗提供新策略，显得尤为有价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物，为乳腺癌肿瘤的治疗提供新的靶点。本发明的另一目的在于将该肿瘤标志物用于制备乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的制剂或试剂盒。为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：本发明提供的一种肿瘤标志物phf20作为乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物的用途。phf20的序列如seqidno.5所示。一方面，本发明提供的一种乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物，所述肿瘤标志物为phf20，是mof复合物的组成蛋白之一，通过其tudor区域识别二甲基化的组蛋白赖氨酸位点。发明人通过实验数据进行分析和验证，创造性地发现了phf20基因与乳腺癌的关系，phf20有望成为乳腺癌肿瘤诊断和预后判断的标志物，这为乳腺癌肿瘤的治疗提供了新的靶点。因此，phf20可用于制备乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂，还可用于制备乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒。本发明另一方面提供一种乳腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒，所述试剂盒中包括phf20的特异性引物和内参基因gapdh的特异性引物。所述phf20的特异性上游引物的序列如seqidno.1所示，所述phf20的特异性下游引物的序列如seqidno.2所示，所述gapdh的特异性上游引物的序列如seqidno.3所示，所述gapdh的特异性下游引物的序列如seqidno.4所示。本发明提供的乳腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒为实时荧光定量pcr检测试剂盒。phf20、内参基因gapdh的特异性引物适用于sybrgreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准dna模板和pcr反应体系，pcr反应体系中的pcr反应液为实时荧光定量pcr反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量pcr反应液包括dntp、mg2+、taq酶及缓冲液，所述荧光染料为sybrgreenii，taq酶为热启动酶。本发明还提供利用上述试剂盒检测phf20的方法，过程如下：1)提取样品总rna；2)制备样品cdna；3)定量扩增phf20。下面对本发明作进一步说明：phf20定位于20号染色体chr20:35771974-35950381，可应用于辅助乳腺癌肿瘤诊断的试剂盒中。通过本发明使用提供的实时荧光定量pcr检测试剂盒，对随机抽取的乳腺癌肿瘤患者的乳腺癌肿瘤与配对正常乳腺组织中的phf20表达水平进行检测，发现phf20在乳腺癌肿瘤组织与配对正常乳腺组织中存在差异性表达，且在乳腺癌肿瘤组织中具有高表达。以上结果表明phf20可能作为新型乳腺癌肿瘤诊断标志物。所述的乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒包括：(1)从乳腺癌肿瘤组织中抽提总rna所用试剂，包括trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇、无酶水；(2)将总rna逆转录为cdna所用试剂，包括逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶及随机引物；(3)将cdna实时荧光定量pcr所需试剂，包括phf20实时荧光定量pcr特异性引物、gapdh内参特异性pcr引物、实时荧光定量sybr染料、无酶水；phf20特异性pcr引物包括：①phf20上游引物(seqidno.1)②phf20-下游引物(seqidno.2)；gapdh内参特异性pcr引物包括：①gapdh上游引物(seqidno.3)②gapdh下游引物(seqidno.4)。本发明发现并证实了phf20基因在乳腺癌肿瘤的组织细胞中具有高表达，可作为新型乳腺癌肿瘤诊断标志物或药物靶点。本发明为乳腺癌肿瘤的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为phf20表达高低对患者生存时间的影响；图2为phf20在正常乳腺组织、乳腺癌组织、浸润性乳腺癌的表达差异；图3为phf20在乳腺癌细胞系mcf-7、htb21、mda231、htb23、htb25、htb27、htb123、mda-mb-436、htb123、mda-mb-453、htb123、mda-mb-468与pbmc细胞、mcf-10a细胞的表达差异；图4为敲除phf20基因对乳腺癌htb21细胞和mda-mb-231细胞的影响(a)及对体外成瘤的影响(b)。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：比较phf20基因在乳腺癌患者的表达和生存率的关系为了了解phf20在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达情况，以及表达量与生存期的相关性，我们在tcta数据库中分析了302例乳腺癌患者肿瘤样品中phf20mrna表达水平，我们根据所有患者phf20表达量的平均值为分界点，将患者分为phf20高表达的患者(42例)和phf20低表达的患者(260例)，结合患者的随访资料我们统计后发现发现phf20的表达量越高，病人的生存时间越短，二者既为负相关(图1)，以上结果提示phf20可以作为评估病人预后的一项指标。实施例2：利用本发明提供的乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒检测phf20基因在正常乳腺组织、乳腺癌组织、浸润性乳腺癌的表达。其中，所述的乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒包括：(1)从乳腺癌肿瘤中抽提总rna所用试剂，包括trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、depc水。(2)将总rna逆转录为cdna所用试剂：promega逆转录试剂盒(goscripttmreversetranscriptase，a5003)，包括:goscripttm5xreactionbuffer、mgcl2、pcrnucleotidemix、recombinantribonucleaseinhibitor、goscripttmreversetranscriptase、nuclease-freewater。(3)将cdna实时荧光定量pcr所用试剂，包括phf20-实时荧光定量pcr特异性引物、gapdh内参特异性引物、实时荧光定量sybr染料(roche4887352001lightcycler480sybrgreenimaster)、depc水。其中，荧光定量pcr引物序列见表1。表1cdna实时荧光定量pcr的引物序列编号引物名称序列seqidno1phf20forwardprimergaatcagctttgaagtgggagcseqidno2phf20reverseprimergttccaacgcttgaaatggatgseqidno3gapdhforwardprimerggagcgagatccctccaaaatseqidno4gapdhreverseprimerggctgttgtcatacttctcatgg具体检测方法如下：1：乳腺癌肿瘤和配对的正常乳腺组织总rna提取。(1)新鲜或-80℃冻存组织约20mg左右，加入1mltrizol冰上研磨，可先用剪刀剪碎组织，为防止溢出，一般先加400ultrizol，待研磨充分，再补齐至1ml。室温放置5-10min。(2)trizol与三氯甲烷按体积比5：1的比例，将trizol加入三氯甲烷，涡旋振荡30s，室温放置5min，12000g转速4℃离心15min。(3)吸取约400ul上清层，尽量小心，避免吸取中间固体层，加入400ul异丙醇，上下颠倒混匀，切勿剧烈振荡，室温放置10min，12000g转速4℃离心10min。(4)吸弃上清液，用depc配制浓度为75％的乙醇加入1ml，在实验台上轻轻磕起沉淀，7500g转速4℃离心5min。(5)吸弃上清层，室温放置5-10min，加入70左右的pepc水溶解rna，于-80℃保存。(6)用1％的琼脂糖凝胶，按1ug的rna加1ul6xloadingbuffer混匀，电泳20min左右，凝胶电泳成像系统照相保存，分析。(7)nanodrop检测rna浓度和纯度，用depc水调零，将rna样品充分混匀，滴加2ul样品在nanodrop检测探头上，放测量臂，测量rna的浓度，记录260/280的比值。2：将1提取的总rna逆转录为cdna，并用实时荧光定量pcr检测phf20的表达量。(1)总rna逆转录为cdna采用promega逆转录试剂盒。配置如下体系:体系i：2ugrna溶于depc水中，加1ul随机引物，补齐至10ul。置于pcr仪上70℃5分钟，立即冰浴5分钟。体系ii中的组分如表2所示：表2：将体系i和体系ii混合，瞬时离心，放入pcr仪中，各程序参数见表3。表3step1step2step3step4温度25℃42℃75℃4℃时间5min1h15min∞(2)实时荧光定量pcr采用罗氏lightcycler480sybrgreenimaster试剂盒。反应体系如下表4：表4：名称体积cdna1uldepce水1ul上游引物1ul下游引物1ulsybrgreen10ul仪器采用roche480，实时荧光定量pcr程序为：95℃10min预变性，接40个循环：95℃10s，60℃20s，72℃30s。本实验数据采用相对定量的分析方法，将gapdh作为内参基因，计算公式为：δct＝δct-δctgapdhδδct＝δc癌组织-δc正常组织相对表达量＝log2-δδct利用软件spss18.0分析实时荧光定量pcrphf20的相对表达量。结果：所测乳腺癌肿瘤组织与配对正常组织相比，乳腺癌肿瘤组织的phf20表达明显上升，见图2。实施例3：利用本发明提供的乳腺癌肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒检测phf20基因在不同乳腺癌细胞系中的表达。检测不同的细胞中phf20的表达状态，其中，乳腺癌细胞为mcf-7、htb21、mda231、htb23、htb25、htb27、htb123、mda-mb-436、htb123、mda-mb-453、htb123、mda-mb-468；正常细胞为：pbmc和mcf-10a。检测过程如实施例2。检测结果：见图3，由图可知，与正常细胞相比，12种乳腺癌细胞对phf20均体现出高表达，这种表达差异可作为乳腺癌肿瘤的判断参考。实施例4：分析phf20表达与病例临床特征的关系将总体病例根据目标phf20在乳腺癌与配对的正常组织的相对表达值2-δδct从低到高进行排列，取前后各32例分为低表达组与高表达组。根据上述分组情况，分析目标phf20高低表达与病例性别、年龄、病灶部位、肿瘤大小、分化级别、有无淋巴结转移、tnm分期等的关系。由p值得出，乳腺癌中phf20高表达与乳腺肿瘤的年龄、性别、病灶部位、肿瘤大小、n分级、tnm分级、淋巴结侵犯、远处转移无统计学差异，而与肿瘤分化程度、t分级密切相关，见表5。表5phf20临床信息表格实施例5检测phf20基因对乳腺癌htb21细胞和mda-mb-231细胞生长的影响以及对体外成瘤的影响。实验方法：为了研究phf20在乳腺癌致瘤性的作用，我们首先构建phf20基因沉默(phf20kd)的htb21细胞和mda-mb-231细胞。通过将htb21细胞或mda-mb-231细胞在t25培养瓶中培养，当细胞密度为50％-60％时加入可表达phf20shrna的5ml病毒液和5μlpolybrene，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养6小时后弃去混有病毒液的培养液，换成完全培养基，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养。然后通过嘌呤霉素筛选获得phf20基因沉默(phf20kd)的htb21细胞和mda-mb-231细胞。接下来，我们对野生型(对照)和phf20kd细胞在mammosphere无血清悬浮培养基和在低粘附96孔板中进行悬浮成球能力培养，7天后在显微镜下观察并拍照(图4的a部分)，计数并统计结果显示通过phf20沉默下调其表达后后显著抑制乳腺癌细胞的成瘤能力。最后我们将5周龄雌性balb/c裸小鼠置于spf级单独通风的微隔离器笼中。每只小鼠右侧皮下注射100μlpbs中的106个对照或phf20kdmda-mb-231细胞。此后，通过测量肿瘤的长度和宽度，每隔2天用卡尺定期测量肿瘤的大小。肿瘤体积按体积(mm3)＝(长×宽×宽)/2计算。处死小鼠后，取出移植瘤进行拍照和称重。结果发现phf20kdmda-mb-231细胞在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力显著弱于对照组(图4的b部分)。实验结果见图4。以上结果表明，phf20可作辅助乳腺癌肿瘤诊断的新型分子标志物。为乳腺癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。序列表<110>深圳市因诺转化医学研究院，深圳因诺免疫有限公司<120>一种乳腺癌肿瘤相关的肿瘤标志物及应用、试剂盒<130>0429<141>2020-05-27<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1gaatcagctttgaagtgggagc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2gttccaacgcttgaaatggatg22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3ggagcgagatccctccaaaat21<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4ggctgttgtcatacttctcatgg23<210>5<211>3039<212>dna<213>人(homosapiens)<400>5atgacaaagcatccacctaacagacgaggaatcagctttgaagtgggagcccagttggaa60gcccgggaccgtttaaaaaactggtatccagctcacatagaagacattgactacgaggaa120ggaaaagtactcatccatttcaagcgttggaaccatcgttatgatgagtggttctgctgg180gacagtccttatttacgccctttagagaaaatacagctgaggaaagagggcttgcatgaa240gaggatggatcttctgaatttcaaataaatgagcaggtccttgcttgctggtctgattgt300cgtttttacccggccaaagtcactgctgttaacaaggatggtacttacactgtgaaattt360tatgatggagtagttcagactgtcaaacatattcatgtcaaagctttttccaaagatcag420aatattgtgggtaatgctaggcctaaagaaacagatcacaaaagtctttcatcatctcct480gataaacgagagaagtttaaagaacagagaaaagcaacagtgaatgtgaagaaagacaaa540gaagataaacccttaaagacagaaaagcgacccaagcagcctgataaagaaggaaagtta600atctgttctgaaaaggggaaagtgtcagagaaaagtcttcccaagaacgagaaggaagac660aaggaaaacatttccgaaaatgacagagagtattctggagatgcccaagtggataagaaa720cctgaaaatgacattgtgaagagtccacaagaaaacttgagggaacccaaaagaaaacga780ggcagacccccttccatagctcctactgctgtggattcaaactctcaaactttgcaacca840ataacattggaactgagaagaaggaaaatatcaaaaggatgtgaagtcccattaaaacgt900cctcggcttgacaaaaattcatcccaggaaaagtcaaaaaactactcggaaaacactgac960aaagacttatcgaggagacgttcctccaggctgtccactaatgggacccatgagatccta1020gatcctgacttggttgtatcagatttggttgatacggatcctttgcaagacacgttgtct1080agtaccaaggaatctgaagaaggtcagttgaagtctgctttggaagctggccaggtctca1140tctgcactgacttgccactcctttggggatggatccggggctgcaggcttggagttgaac1200tgcccatcaatgggagaaaacacgatgaaaacagaaccgacttctccccttgtggaatta1260caagagatttcgactgtggaagtaacaaatacttttaagaaaacagatgattttgggtca1320tctaatgcaccagctgtcgacctagaccataagtttagatgcaaagttgtggactgttta1380aaatttttccgcaaagccaaactgttgcactatcacatgaagtatttccatggaatggag1440aagtcactggagccagaagagagcccgggaaagaggcatgtccaaaccaggggcccttca1500gcttcagacaagcccagccaggagaccctgaccaggaagcgggtctctgccagttcccca1560actacaaaagacaaggaaaagaataaagagaagaaattcaaggagtttgtgagagtgaag1620ccaaagaagaaaaagaaaaagaaaaagaaaaccaaacctgaatgcccctgcagtgaggag1680atcagtgacacctcccaggaaccttctccacccaaggcatttgctgttaccaggtgtggg1740tcctcacacaagccaggggtccatatgagcccgcagcttcatggcccagaatctggacac1800cacaaagggaaagtgaaagcattggaggaggataatttgagtgagtcctcttctgagagc1860tttctctggagtgatgatgagtatggccaagatgtggatgtgaccaccaacccagatgag1920gaacttgatggggatgaccgctatgacttcgaggtggtccgctgcatctgtgaggtccag1980gaggaaaatgacttcatgattcagtgtgaagagtgccagtgctggcagcatggggtctgc2040atgggattactggaagaaaatgtgcccgagaaatacacctgttatgtttgccaagaccct2100ccaggtcagaggcctggcttcaagtactggtatgacaaggagtggctgagcaggggacat2160atgcatggcctggcatttctagaagagaactactcccatcagaatgccaagaagatcgtg2220gccacccaccagcttcttggtgatgtgcagagagtgattgaggttctgcatggcctgcag2280ctcaagatgagcatcttgcaaagccgggagcatcctgatctgccgctgtggtgccagcct2340tggaaacagcactcaggggaggggagatctcatttcagaaacatccctgtcactgacacc2400aggagcaaggaggaagctccaagctatagaactttgaacggggcagtggagaagcccagg2460cccctggccctgcccctgccgcgttctgtggaggaatcctatatcaccagtgagcattgc2520taccagaagccccgcgcctattaccctgccgtggagcagaagctggtggtggagacgagg2580ggctctgccctcgacgatgcggtcaaccccctccatgagaacggcgatgattccctttcc2640ccgcgcctgggctggcctctagaccaagacaggagcaagggggacagtgaccccaaaccc2700ggctccccaaaggtgaaggaatatgtctccaaaaaggccctaccagaagaagcccctgct2760cggaagctgctggacagaggtggagaggggctgctgagctcccagcaccagtggcagttt2820aacctgctgacccatgtggaatctcttcaggatgaagttacgcacaggatggactccatt2880gagaaggagttggatgtgttggagagctggctggactacactggggaactggagccccct2940gagccgctggccaggcttccgcagctcaagcattgtatcaagcagctgctgatggacctg3000ggcaaggtgcagcagatcgccctctgctgctcaacatga3039当前第1页12