新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物lncRNA的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物lncrna的应用。

背景技术：

lncrna是一类转录本长度大于200bp的非编码rna产物，在转录、转录后和染色体修饰等多个层面，调控胚胎发育、细胞增殖、转移和分化等各种生命活动，其异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。lncrna有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的lncrna表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的lncrna表达量也会变化，lncrna可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控。lncrna启动子同样可以结合转录因子，如oct3/4、nanog、creb、sp1、c-myc、sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征，序列上保守性较低，只有约12%的lncrna可在人类之外的其它生物中找到，其作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚，比如已有许多研究证实了mirnas参与调节tgfβ表达量和emt过程，但参与此过程的lncrna并不清楚。另外，一些在线网站比如starbase2.0网站预测准确率低，比如现在已经比较明确的gas5和mirna21都预测不到，而且人血清中存在多达1400个lncrna，还有变化，导致lncrna无法有效利用。

肠外营养(parenteralnutrition,pn)对不能通过正常肠道方式来满足生长的新生儿带来了革命性关爱。美国自60年代首次报道长期pn应用于一例新生女婴，至今已有数十万患者依赖pn得以生存。但长时间(＞2周)pn应用也存在许多相关问题,肠外营养相关性肝病(totalparenteralnutrition-associatedliverdisease,pnald)是一种最常见的并发症，随着长时间pn的应用，pnald发生率增加，主要表现为肝脂肪变性、胆汁淤积和转氨酶升高。约有30％-60％的患儿因长期pn发生pnald，伴有肝功能异常和肝细胞损害，严重者发展为肝硬化危及生命。而新生儿发生pnald更早、肝功能下降更快，死亡率高达38%～51%。因此，pnald是严重威胁新生儿健康的重大疾病，如何防治该病是新生儿临床焏待解决的问题。pnald临床主要表现为黄疸、肝脾肿大，可有白陶土样大便，肝功等化验检查多提示丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶、血总胆红素、直接胆红素升高。

因此针对新生儿肠外营养相关性肝病，研发合适的特异性lncrna作为标志物在调控基因转录、作为疾病诊断标志物等方面具有重要的研究和临床意义。

技术实现要素：

本发明提供一种作为针对新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的lncrna及其应用。本发明首次公开了lncrnag034337作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物，利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行qrt-pcr验证lncrna的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是一种准确特异诊断新生儿肠外营养相关性肝病的方法。

本发明的技术方案如下：

lncrna作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物的应用；所述lncrna为lncrnag034337。

lncrna在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物中的应用；所述lncrna为lncrnag034337。

lncrna在制备新生儿肠外营养相关性肝病特异性诊断试剂中的应用；所述lncrna为lncrnag034337。

本发明中，通过检测人体全血样本中的lncrnag034337的表达情况即可诊断新生儿肠外营养相关性肝病，与现有临床检测手段结果吻合。

本发明公开了新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对lncrna的表达量进行定量的试剂，所述lncrna为lncrnag034337；优选的，所述能够对lncrna的表达量进行定量的试剂包括qrt-pcr引物对；所述qrt-pcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2。

本发明还公开了新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用，该试剂盒含有能够对lncrna的表达量进行定量的试剂，所述lncrna为lncrnag034337；优选的，所述能够对lncrna的表达量进行定量的试剂包括qrt-pcr引物对；所述qrt-pcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2。

本发明公开了能够对lncrna的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒中的应用或者能够对lncrna的表达量进行定量的试剂在制备新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂中的应用，所述lncrna为lncrnag034337；优选的，所述能够对lncrna的表达量进行定量的试剂包括qrt-pcr引物对；所述qrt-pcr引物对的序列为seqidno：1、seqidno：2。

实施例中，本发明通过提取新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者全血样本的总rna，设计qrt-pcr特异性引物，并通过常规qrt-pcr检测特异性lncrnag034337的表达量，结果显示在新生儿肠外营养相关性肝病患儿中lncrnag034337发生了显著性的上调表达；由此说明，通过检测lncrnag034337的表达水平，可以有效区分新生儿肠外营养相关性肝患儿和正常健康人。

本发明中，lncrnag034337序列为seqidno：3，具体如下：

aagtggaggccggagcctgggacaccgccggcggggagagaagcggatcccgtccgagccccggccccaagtaacgccgccgccccggagccgccaggcttctagagataggctcctcatgtgtctgcaattccaaaacttaacaaaaacaaaaagttgagcctctgaagctgtcactaaccaagtgattcagatgtcgggactggaacaccagctgttggggatgcaggacttggtctctgccctcccacacctcctgcctcttctttctctccatcgccccatctctgccagtagagaatggaactgagttggaggtccccctccccactaagtgcctctttgcatagcaccagtccccacccgcacgctctctggaccactacagctggacgggcaatggcgggtcggggaggcgcagcacgacccaatggaccagctgctgggaacaagatctgtcaatttaagctggttctgctgggggagtctgcggtaggcaaatccagcctcgtcctccgctttgtcaagggacagtttcacgagtaccaggagagcacaattggagcggccttcctcacacagactgtctgcctggatgacacaacagtcaagtttgagatctgggacacagctggacaggagcggtatcacagcctggcccccatgtactatcggggggcccaggctgccatcgtggtctatgacatcaccaacacagatacatttgcacgggccaagaactgggtgaaggagctacagaggcaggccagccccaacatcgtcattgcactcgcgggtaacaaggcagacctggccagcaagagagccgtggaattccaggaagcacaagcctatgcagacgacaacagtttgctgttcatggagacatcagcaaagactgcaatgaacgtgaacgaaatcttcatggcaatagctaagaagcttcccaagaacgagccccagaatgcaactggtgctccaggccgaaaccgaggtgtggacctccaggagaacaacccagccagccggagccagtgctgcagcaactgagccccccttgcctgcccgctgcccccgcctcctccgcctgaatgacccgactggaatccactctaaccaatcgcacttaacgactcgggccaccactgggggggcagggggagggg

本发明中，lncrna相对表达量分析采用graphpadprism5软件，采用软件中单样本t检验和独立样本t检验，p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，p<0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异。研究发现，相对健康人样本，新生儿肠外营养相关性肝病人lncrnag034337的表达量都发生了显著性的上调表达，在统计学上具有极显著性差异，可以说明lncrnag034337可以作为新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物用于诊断。

附图说明

图1为lncrnag034337在pnald组病人和正常健康人之间的差异表达图；

图2为lncrnag034337在新生儿高胆红素血症病人和正常健康人之间的差异表达图；

图3为lncrnag034337在脂肪肝儿童和正常健康人之间的差异表达图。

具体实施方式

总rna提取试剂盒购自ambion公司；qrt-pcr反转录试剂盒购自fermentas公司；sybrsystemmix购自takara宝生物工程（大连）有限公司；384孔板及膜购自罗氏公司。

实施例一新生儿肠外营养相关性肝病人lncrnag034337的表达量发生了显著性的上调表达

pnald患儿30例，正常对照组新生儿30例，分别收集外周血3ml，提取血浆中的总rna，进行qrt-pcr验证。设计及检测结果如下。

本研究经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，pnald的诊断标准如下:(1)pn持续时间大于等于14天;(2)临床表现为皮肤暗黄并进行性加重、和/或肝脾肿大、大便发白等不能用原发病解释;(3)直接胆红素(db)>34.2umol/l(2mg/dl)与db胆汁淤积反应。(4)排除消化道畸形、遗传性代谢性疾病、先天性病毒感染等明确原因引起的胆汁淤积。正常对照组为健康新生儿，无任何肝脏相关疾病。

qrt-pcr引物为：

以内参β-actin在新生儿肠外营养相关性肝病患者全血样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的lncrna产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的lncrna，即此定量无污染，准确，可靠。

所有血样采用一次性真空edta抗凝采血管抽取，采集外周血3.0ml，颠倒混匀；加入3倍体积红细胞裂解液（300μl血液加入900μl红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放5min，期间颠倒几次；3000rpm离心5分钟，弃上清。用1ml的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000rpm离心2min，弃上清；用1ml的trizolreagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。

将新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者含有白细胞的trizolreagent样本于-80℃中取出，待4℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心5min。取上清；加1.25倍体积100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000rpm，30s，弃流过液；加350μlmirnawashsolution1(mirvana™mirnaisolationkit，ambion-1561)到离心柱中，13000rpm，30s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10μldnasei和70μlbufferrddqiagen(#79254)总体积：80μl，加到离心柱中的膜上，室温放置15min；加350μlmirnawashsolution1到离心柱中，13000rpm，30s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500μlwashsolution2/3过柱两次，13000rpm，30s。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心1min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加100μl95℃预热的elutionsolution，放置2min，室温最高转速离心20-30秒，收集管中的液体即为提取的总rna，放置在-80℃保存。

取新生儿肠外营养相关性肝病患者和健康对照者总rna样本1.0μl，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测od值，在紫外分光光度计上测定a260/a280数值，测定结果总rna浓度在5～10ng/μl之间，a260/a280数值在1.2～1.9之间，表示总rna的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总rna降解。

新生儿肠外营养相关性肝病诊断试剂盒qrt-pcr新生儿肠外营养相关性肝病相关的特异性lncrna

用fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总rna2.5μl，rnase抑制剂rri0.25μl，dntp（10mmeach）0.5μl，5×m-mulvbuffer1.0μl，随机引物（2µm）0.5μl，m-mulv反转录酶0.25μl，总体积5μl。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，10min；第二步：42℃，60min；70℃，15min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。

qrt-pcr体系：ddh2o7μl，sybrsystemmix10μl，50*roxrefenencedye0.4μl，上游引物（10µm）/下游引物（10µm）0.8μl，模板cdna1μl，总体积20μl；混匀后离心，在abi7500中进行荧光定量pcr反应，反应参数设置为：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，共40个循环。

lncrna荧光定量数据分析以β-actin为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。lncrna表达倍数的变化公式为rq=2^-△△ct，其中△△ct=（ctlncrna-ctβ-actin）oc-（ctlncrna-ctβ-actin）meanon。rq代表相对表达变化量，ctlncrna和ctβ-actin分别代表同个样本中目标lncrna和内参基因β-actin的ct值，oc代表新生儿肠外营养相关性肝病患者，on代表健康对照者，meanon代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cdna模板，以ddh2o代替，所有荧光定量pcr均做3次重复。lncrna相对表达量分析采用graphpadprism5软件，采用软件中单样本t检验和独立样本t检验。p<0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，p<0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异，差异表达的lncrna数据处理结果以平均值±标准差表示，绘制柱状图。

分别在30例pnald病人和30例正常健康新生儿中检测lncrnag034337的表达量，结果显示在pnald病人中lncrnag034337发生了显著性的上调表达，见附图1，表达差异在6倍以上；p<0.005。

实施例二验证lncrnag034337的表达特异性

经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，收集30例临床确诊的新生儿高胆红素血症患儿，明确为非pnald患者。根据实施例一同样的方法检测外周血以分析lncrnag034337在该病的表达情况，结果表明，与对照组（正常健康，实施例一）相比，lncrnag034337在新生儿高胆红素血症患儿血浆中表达量无明显差异，差异无统计学意义；p>0.05，见图2。

实施例三验证lncrnag034337的表达特异性

经苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，收集30例临床确诊脂肪肝患儿（0-14岁），明确为非pnald患者。根据实施例一同样的方法检测外周血以分析lncrnag034337在该病的表达情况，结果表明，与对照组（正常健康，实施例一）相比，lncrnag034337在脂肪肝患儿血浆中表达量无明显差异，差异无统计学意义；p>0.05，见图3。

上述对照组、pnald组、高胆红素血症组、脂肪肝组lncrnag034337的相对表达量如下：

本发明公开的新生儿肠外营养相关性肝病特异性lncrna，利用设计的引物对进行qrt-pcr方法验证得到差异表达量，获得新生儿肠外营养相关性肝病特异性lncrna标志物，对pnald的诊断上具有较高的应用价值。

序列表

<110>苏州大学附属儿童医院

<120>新生儿肠外营养相关性肝病特异性标志物lncrna的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtggccgaggactttgattg20

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cctgtaacaacgcatctcatatt23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gggtcttattctcctccctat21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>1166

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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acatttgcacgggccaagaactgggtgaaggagctacagaggcaggccagccccaacatc780

gtcattgcactcgcgggtaacaaggcagacctggccagcaagagagccgtggaattccag840

gaagcacaagcctatgcagacgacaacagtttgctgttcatggagacatcagcaaagact900

gcaatgaacgtgaacgaaatcttcatggcaatagctaagaagcttcccaagaacgagccc960

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gccagccggagccagtgctgcagcaactgagccccccttgcctgcccgctgcccccgcct1080

cctccgcctgaatgacccgactggaatccactctaaccaatcgcacttaacgactcgggc1140

caccactgggggggcagggggagggg1166