LINC02178作为宫颈癌的诊治标志物的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及linc02178作为宫颈癌的诊治标志物的应用。
背景技术：
：宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在女性生殖器官肿瘤中占首位。根据世界卫生组织2014年统计数据，宫颈癌的年新发病例约为52.8万例，年死亡例数约为26.6万例，其中85％的患者均发生在在发展中国家，且农村高于城市。我国是宫颈癌发病的大国，根据国家肿瘤中心公布的最新癌症统计数据，2015年我国的宫颈癌新发病例约为9.89万例，年死亡例数约为3.05万例，并且该数据呈现逐年上升且发病年轻化的趋势[chenw,zhengr,baadepd,etal.cancerstatisticsinchina,2015[j].cacancerjclin,2016,66(2):115-132]。宫颈癌的发生与多种因素密切相关，如早婚、早育、多产及性生活紊乱等，但人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染被认为是宫颈癌发病的必要条件，99.7％的宫颈癌患者hpv筛查呈阳性，且hpv持续感染患者罹患宫颈癌的风险是hpv阴性者的250多倍[wentzensenn,arbynm.hpv-basedcervicalcancerscreening-facts,fiction,andmisperceptions[j].prevmed,2017,98:33-35l；torrela,islamif,siegelrl,etal.globalcancerinwomen:burdenandtrends[j].cancerepidemiolbiomarkersprev,2017]。自上世纪七八十年代首次明确hpv感染是宫颈癌发病重要的成因后，学者们针对hpv感染诱发宫颈癌发病的机制展开深入研究，并因此开发出了针对宫颈癌的诊断方法和治疗策略，包括敏感特异的癌前诊断方法、靶向性的免疫预防措施以及治疗方法，极大的改善了宫颈癌患者生存及生活质量。随着现代生物检测技术的发展和肿瘤发病机制的不断深入研究，涉及肿瘤发生的多种生物学过程中的多种分子，如核酸、蛋白质、糖类、脂类、小分子代谢物乃至血液中游离的肿瘤细胞，均可作为重要的肿瘤标志物，给临床预防、诊断和治疗提供明确的依据。在宫颈癌中，目前己经发现了一些肿瘤标志物用于宫颈癌的临床预防。ki-67和p16ink4a是两种常见的用于分析肿瘤细胞增殖状态以及肿瘤恶性程度的分子标志物。其中ki-67在静默go期细胞不表达，而高表达于g1,s,g2和m期细胞，因此其可广泛用于分析细胞的增殖活性来评估肿瘤进程[endle,gerdesj.theki-67protein:fascinatingformsandanunknownfunction[j].expcellres,2000,257(2):231-237]；同时，由于其表达谱系广泛，作为特异性的肿瘤标志物仍具有一定的缺陷，临床尚需其他分子标志物辅助诊断。p16ink4a作为一种周期调节蛋白，可特异性与cdk4和cdk6结合从而抑制其活性以及下游prb的磷酸化，调节细胞周期进行及细胞分化过程；有研究发现，p16ink4a表达与hr-hpv持续感染以及宫颈肿瘤病理分级呈正相关，对于患者术后hpv的清除以及持续感染具有一定的指导价值[kohj,endersgh,dynlachtbd,etal.tumour-derivedp16allelesencodingproteinsdefectiveincell-cycleinhibition[j].nature,1995,375(6531):506-510]。proexc抗体(bd公司)可特异性的识别因hpv感染而诱导的胞核蛋白mcm2以及拓扑异构酶top2a复合物。在宫颈腺体和鳞状细胞不典型增生中，e7癌基因诱导的细胞s期基因会促进top2a和mcm2在细胞核内高表达，同时top2a可与6个mcm2分子结合形成稳定的结构滞留于细胞核[santinad,zhanf,bignottie,etal.geneexpressionprofilesofprimaryhpv16-andhpv18-infectedearlystagecervicalcancersandnormalcervicalepithelium:identificationofnovelcandidatemolecularmarkersforcervicalcancerdiagnosisandtherapy[j].virology,2005,331(2):269-291]。因其在正常宫颈上皮细胞中不表达，而在hpv诱导的增殖活跃的鳞状细胞内显著高表达，临床上可用于区分不典型增生与鳞状细胞发育不完全或萎缩等类似改变。hpvdna完整性和稳定性主要是由衣壳蛋白l1与l2蛋白共同形成一个稳定的保护壳来维持。其中，l1蛋白还可通过识别宿主细胞上的相应受体，促进病毒颗粒侵染粘膜基底膜带细胞或宫颈上皮细胞。在hpv侵染的轻度至中度不典型增生过程中会持续检测到l1蛋白的表达，但是随着宫颈癌化程度进展l1蛋白的表达会逐渐消失[mcmurrayhr,mccancedj.humanpapillomavirustype16e6activatestertgenetranscriptionthroughinductionofc-mycandreleaseofusf-mediatedrepression[j].jvirol,2003,77(18):9852-9861]。因此hpv-l1表达消失提示病毒基因组己整合在宿主基因组，可用于宫颈癌cin3期的诊断。lanminin-5是一种与肿瘤侵袭密切相关的肿瘤标志物，在多种不同类型恶性肿瘤中lanminin-5基因的表达常与肿瘤的进展密切相关。在宫颈癌的发生过程中，laminin-5主要表达在肿瘤的早期阶段，特别是在微小浸润的皮损处，因此其可用于宫颈鳞状细胞浸润早期的检测。mib-i具有与ki-67类似的表达模式，即在显著的高表达于gins各期的增殖状态活跃的肿瘤细胞，结合ki-67检测可用于辅助分析肿瘤细胞所处的周期状态。因此mib-1是另一重要的检测不典型增生过程中细胞增殖活性的一个重要指标。综上所述，目前虽然己有多种肿瘤标志物用于临床宫颈癌的诊断，但是己有肿瘤标志物因在正常情况下组成性表达、或在非恶性肿瘤疾病中水平也升高，缺乏肿瘤特异性。因此，亟待寻找肿瘤特异性抗原作为生物标志，用于临床宫颈癌的早期诊断和预后判定。技术实现要素：根据本发明的一个方面，本发明提供了检测linc02178表达的产品在制备诊断宫颈癌的工具中的应用。进一步，上面所提到的检测产品包括：通过反转录pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测linc02178的表达水平以诊断宫颈癌的产品。进一步，所述通过反转录pcr检测linc02178表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增linc02178的引物；所述通过实时定量pcr检测linc02178表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增linc02178的引物；所述通过原位杂交检测linc02178表达水平以诊断宫颈癌的产品包括：与linc02178的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测linc02178表达水平以诊断宫颈癌的产品包括与linc02178的核酸序列杂交的探针。在本发明的具体实施方案中，所述通过实时定量pcr检测linc02178表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括的一对特异扩增linc02178的引物如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明还提供了一种诊断宫颈癌的工具，所述工具能够通过检测样本中linc02178的表达来诊断宫颈癌。进一步，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测linc02178转录水平的针对linc02178的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测linc02178转录水平的试剂；所述试纸包括用于检测linc02178转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测linc02178转录水平的试剂。更进一步，所述检测linc02178转录水平的试剂包括针对linc02178的引物和/或探针。与linc02178的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。在本发明的具体实施方案中，所述针对linc02178的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。用于诊断宫颈癌的linc02178来源包括但不限于组织和体液，体液包括血液、组织液等存在dna的体内液体成分。在本发明的具体实施方案中，用于诊断宫颈癌的linc02178的来源是组织。本发明的linc02178(geneid:105371248)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。本发明提供了一种用于治疗宫颈癌的药物组合物，所述药物组合物包括促进linc02178的试剂。进一步，所述试剂不受限制，只要是可以促进linc02178表达水平或促进linc02178功能活性即可。所述试剂包括linc02178的过表达载体。本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。本发明还提供了linc02178在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。本发明还提供了促进linc02178的试剂在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。进一步，所述药物限定同前面所述的。在本发明的上下文中，“诊断宫颈癌”既包括判断受试者是否已经患有宫颈癌、也包括判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险。附图说明图1显示利用qpcr检测lncrna在宫颈癌组织与癌旁组织中的差异表达的统计图。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1宫颈癌患者的癌组织中异常表达lncrna研究1、组织收集收集医院妇产科提供的宫颈鳞癌组织43例，来源于经子宫切除术(锥切或全切)术后病理诊断为宫颈鳞癌的患者，其中癌旁正常组织作为对照组。所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗。2、组织rna提取取-80℃冻存的癌组织和周边癌旁组织约50mg，放入液氮中进行研磨，至无大颗粒组织时转移至1.5mlep管中，加入1mltrizol用于总rna提取和实时定量pcr分析，具体流程如下：1)在上述含有1mltrizol的组织悬液中加入200μl氯仿，手动充分震荡混匀后室温静置10min；2)12000rpm，4℃离心15min；3)待离心完毕后，轻柔吸取ep管上层水相至新的1.5mlep管中，加入600μl异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置20min(或-20℃放置2h，可增加rna的析出)；4)12000rpm，4℃离心15min；5)弃去上清，加入depc水稀释的75％乙醇，用枪头轻轻吹吸悬浮沉淀；6)12000rpm，4℃离心15min；7)弃去上清，用枪头吸取残余的液体，室温下晾置5min；8)取20μlrnaase-free水溶解沉淀，定量后使用或冻存-80℃冰箱待用。3、qpcr1)逆转录反应采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min。将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。2)引物的设计与制备本申请所用实时定量pcr引物序列如下(委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成)：linc01537引物：上游引物：5’-aatgttatgccagagtca-3’(seqidno.1)，下游引物：5’-ccagattcctacctaagag-3’(seqidno.2)；linc02178引物：上游引物：5’-cagtcagaagcacataca-3’(seqidno.3)，下游引物：5’-ctaatgaaagccagataaagg-3’(seqidno.4)；gapdh基因引物：上游引物：5’-gacctgacctgccgtcta-3’(seqidno.5)，下游引物：5’-aggagtgggtgtcgctgt-3’(seqidno.6)。3)实时定量pcr用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。采用2-△△ct相对定量法分析lncrna的表达水平，ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值。计算方法为：δδct＝(ct目的基因-ct内参基因)宫颈癌组织实验组-(ct目的基因-ct内参基因)对照组织组，2-△△ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，实验数据分析由bio-rad分析软件完成。4、统计学分析采用统计学软件spss19.0进行数据分析，应用配对t检验判断宫颈癌组织与癌旁组织样本中lncrna的表达是否存在统计学意义上的差异。统计检验都为双侧检验，p＜0.05为差异有统计学意义。5、结果以癌旁组织作为基准进行目标基因的标准化，即癌旁组织相对表达量为1。相比癌旁组织，宫颈癌组织中linc01537、linc02178的表达量均显著下调。统计结果如图1所示，差异具有统计学意义(p＜0.05)。实施例2lncrna表达与宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的关系研究1、细胞培养人宫颈癌siha细胞常规培养于含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，于37℃、饱和湿度及含5％co2的培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。2、过表达载体构建根据ncbi中lncrna序列信息设计特异性引物，进行扩增获得相应lncrna，将扩增片段胶回收后分别与表达载体pegfp-c1进行连接后转化入dh5α感受态细胞中，挑取阳性克隆经pcr和测序鉴定后获得pegfp-c1-lncrna重组质粒。3、细胞转染转染前1d将2～3×105细胞接种于6孔板中，当细胞融合度达60％～70％时，按lipofectamine3000脂质体说明书转染细胞。实验设2个组：阴性对照组(pegfp-c1，转染空载体)、pegfp-c1-lncrna过表达组(转染lncrna重组质粒)。4、细胞转染效率检测利用实施例1中记载的qpcr方法进行靶基因过表达情况测定，结果见表1所示，组间差异具有统计学意义(p<0.05)。表1质粒转染效率检测pegfp-c1(相对表达量)pegfp-c1-lncrna(相对表达量)linc015370.9643±0.02497.382±0.9937linc021780.9643±0.024912.081±1.34025、细胞增殖实验wst-1法检测lncrna表达对siha细胞增殖的影响。调整细胞密度至1×102/μl，接种于96孔板(100μl/孔)，每组设置3个复孔。37℃、5％co2培养72h，加入10μlwst-1孵育2h后，于酶标仪在波长450nm处检测细胞的光密度(d)值，根据d值绘制细胞增殖曲线。结果见表2所示，组间差异具有统计学意义(p<0.05)。表明促进linc01537、linc02178表达后可抑制宫颈癌细胞增殖。表2宫颈癌细胞增殖5、transwell实验检测lncrna表达对宫颈癌siha细胞迁移及侵袭能力的影响细胞迁移实验：吸取10μl纤连蛋白(1μg/μl)均匀涂抹在transwell下室的膜上，37℃培养箱放置4h。用无血清培养基dmem调整细胞密度至5×102/μl，取100μl细胞悬液加至上室，下室加入600μl含20％fbs的dmem培养液，各设3个复孔。37℃，5％co2孵育48h后，用棉签轻轻擦去上室膜上未迁移的细胞，pbs洗2次，甲醇固定30min。自然晾干后，用0.1％结晶紫染色20min。弃染液，双蒸水洗2次。光学显微镜(×200)下计数上、下、左、右、中5个不同视野的总细胞数，取其平均值。重复3次实验。细胞侵袭实验：取200μlmatrigel胶原液用300μl无血清培养基dmem稀释。取100μl稀释后的matrigel胶加至transwell小室的上室中，置于37℃孵箱中孵育2h使matrigel胶凝固。余下步骤与迁移实验相同。结果见表3和表4，组间差异具有统计学意义(p<0.05)。表明促进linc01537、linc02178表达后可抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭。表3宫颈癌细胞迁移pegfp-c1(细胞数)pegfp-c1-lncrna(细胞数)linc01537122.1±5.575.9±8.3linc02178122.1±5.591±4.6表4宫颈癌细胞侵袭pegfp-c1(细胞数)pegfp-c1-lncrna(细胞数)linc0153759±633.1±2.8linc0217859±644.2±1.1本发明的实验结果表明，促进linc01537、linc02178表达可用于治疗宫颈癌。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>青岛泱深生物医药有限公司<120>linc02178作为宫颈癌的诊治标志物的应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aatgttatgccagagtca18<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccagattcctacctaagag19<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cagtcagaagcacataca18<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctaatgaaagccagataaagg21<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gacctgacctgccgtcta18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aggagtgggtgtcgctgt18当前第1页12