本发明属于基因检测的
技术领域：
：，具体涉及一种增强测序灵敏度的基因富集方法。
背景技术：
：：目前，肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性肿瘤死亡人数很高的均为肺癌。肿瘤专家指出，近年来在我国癌症发病的可能呈明显上升趋势，但得到规范治疗的患者却不足一半。例如，肺癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，并且肺癌发病及死亡年龄自40岁以后迅速上升，70岁达到高峰，75岁以后略有下降。女性和男性年龄发病的可能和死亡人数的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡人数迅速上升的同时，不同时期的肺癌死亡人数年龄曲线显示，肺癌死亡人数高峰出现前移。也就是说，我国肺癌的发病及死亡年龄有年轻化的趋向。精准医疗将肿瘤基因分型与靶向治疗相结合用于肺癌的治疗，改变了肿瘤临床治疗的格局。egfr、kras、braf、msi等基因是肿瘤靶向治疗或者免疫治疗的重要靶点，其同步检测已被欧洲esmo、中国诊疗专家达成共识并推荐，是让患者从精准医疗中获益的有效策略。以期最大程度地延长患者生存时间、控制疾病进展程度、提高生活质量。例如，目前非小细胞肺癌的靶向药物有多种，nccn临床指南也明确要求非小细胞肺癌患者在接受治疗以前要先进行egfr突变的检测。但是这些基因发生突变在肿瘤细胞中均呈一定的比例，1‰～100％不等。这里所说的肿瘤中基因发生的突变大多为体细胞突变即获得性突变，是在生产发育过程中或者环境因素影响下后天获得的突变，也就是指部分细胞中带有的突变，这一类细胞中基因突变含量一般在1％～100％，甚至低于1％。还有一类突变为胚系突变即生殖细胞突变，来源于精子或卵子这些生殖细胞的突变，因此通常身上所有细胞都带有突变，这一类细胞中基因突变含量一般在50％～100％左右。以下是目前对于基因突变的检测方法有以下几种：taqman方法：针对特异性突变位置变异设计特异性的探针，探针标记成本较高；采用荧光淬灭及双末端标记技术，有淬灭难以彻底、本底较高的缺陷；采用酶外切活性，定量时受酶性能的影响。dhplc技术和质谱分析：分别需要用到高效液相色谱仪与质谱仪，设备昂贵，难以在临床诊测中推广。dna芯片：由于高通量等优点在snp检测中得到大量应用，但其依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测，由于不同位点之间的杂交动力学差异不同，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差，易出现假阳性假阴性结果。微测序：作为一种基于阵列的突变分析，目前还面临着如何降低假阴性率和靶核苷酸序列组成的变异等关键问题。限制性酶切方法(rflp)：准确性较好,费用也较低.但只能对一部分含有现成酶切位点的多态位点进行分型。snapshot法：基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，通常用于10-30个snp位点分析。高分辨率熔解曲线法(hrm)：是近几年兴起的snp研究工具该方法，无需设计探针，成本低，但结果准确度较低。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)又称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，hpce)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。常规的毛细管电泳检测基因突变的灵敏度为15％-20％左右。通常肿瘤组织中基因突变含量为1％-100％之间，少量样本会在1％以下。但是对于液体活检样本例如尿液或者血浆游离dna，其中基因突变含量很低，一般在1‰-10％之间，因此普通的毛细管电泳方法检测基本无法进行低突变含量样本的检测。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的是提供一种增强测序灵敏度的基因富集方法，解决了常规测序检测灵敏度低的问题，避免了检测成本高、可重复性差、适用范围小和结果准确度低的缺陷。为了实现上述目的，本发明提供的一种增强测序灵敏度的基因富集方法，包括以下步骤：将dna突变基因富集预处理的基因引物、基因探针、与dna基因野生型序列特异性结合的封闭引物blocker和待测基因样品进行混合，pcr扩增，得到dna突变基因突变的富集产物；所述dna基因突变富集预处理的基因引物包括基因正向引物和基因反向引物，封闭引物blocker为ddc3’端修饰。进一步地，野生型序列与封闭引物blocker的结合自由能比突变型序列与封闭引物blocker的结合自由能高出至少2kcal·mol-1。进一步地，pcr扩增引物对突变型序列的扩增能力比pcr扩增引物对野生型序列的扩增能力高至少70％。优选地，所述dna突变基因为egfrt790m基因，所述基因正向引物为egfrt790m-f：cctcacctccaccgtgc(seqidno.1)；所述基因反向引物为egfrt790m-r：ggtactgggagccaatattgt(seqidno.2)；所述基因探针为egfrt790m-fp：cctcctggactatgtccgggaac(seqidno.3)，其中egfrt790m-fp的5’端进行fam修饰，3’端进行bhq1修饰；所述封闭引物blocker的序列为egfrt790m-blocker：cgtgcagctcatcacgcagctc-ddc(seqidno.4)。优选地，进行一次检测时，egfrt790m-f(10μm)加入量0.1-1.0μl，egfrt790m-r(10μm)加入量0.1-1.0μl，egfrt790m-fp(10μm)加入量0.05-0.5μl，egfrt790m-blocker(20μm)加入量0.1-1.0μl。优选地，所述dna突变基因为kras基因，所述基因正向引物为kras-f：gaaaatgactgaatataaacttgtggt(seqidno.5)；所述基因反向引物为kras-r：agatttacctctattgttggatcatatt(seqidno.6)；所述基因探针为kras-fp：gacgatacagctaattcagaatcattttgtgga(seqidno.7)，其中kras-fp的5’端进行fam修饰，3’端进行bhq1修饰；所述封闭引物blocker的序列包括kras-blocker1：tggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgc-ddc(seqidno.8)，kras-blocker2：ttgtggtagttggagctggtggcgt-ddc(seqidno.9)，kras-blocker3：acttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaaga-ddc(seqidno.10)。优选地，进行一次检测时，kras-f(10μm)加入量0.1-1.0μl，kras-r(10μm)加入量0.1-1.0μl，kras-fp(10μm)加入量0.05-0.5μl，kras-blocker1(20μm)加入量0.1-1.0μl，kras-blocker2(20μm)加入量0.1-1.0μl，kras-blocker3(20μm)加入量0.1-1.0μl。本发明提供的一种增强测序灵敏度的基因富集方法，具有如下有益效果：1、blocker引物需要对野生型模板更强的封闭能力，并且blocker引物不能与突变型模板进行结合，封闭效果好，blocker引物ddc3’端的修饰进行体系筛选，满足多突变位点检测不受影响；2、通过一个反应毛细管电泳法反应体系就能检测出多种突变形式，而且能直观的判读是哪一个碱基发生了改变；3、根据毛细管电泳分析，突变检测能够达到10拷贝/ul，相当于1‰突变含量，测序灵敏度高，能够进行低突变含量样本的检测；4、本发明采用这种技术进行相关基因检测，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准；5、将野生型模板进行封闭，从而将突变型模板充分释放出来，因为blocker引物的封闭作用，使扩增引物对突变模板的扩增能力比扩增引物对野生模板的扩增增加80％，这样使得野生型模板在整个循环中得到的扩增产物不断减少，突变型模板得到的扩增产物不断增多，对突变位点起到一个很好的富集作用，对于blocker引物3’端的修饰进行体系筛选，最终确定ddc3’端修饰，能够打破常规测序检测灵敏度低(灵敏度20％左右)的瓶颈，发明一种简单快速且检测灵敏度达到突变1‰的检测方法。附图说明图1为本实施例1中egfrt790m基因突变质粒的毛细管电泳检测结果示意图。图2为本实施例2中kras基因突变质粒的毛细管电泳检测结果示意图。图3为本实施例3中微卫星msi突变质粒的毛细管电泳检测结果示意图。具体实施方式为了使本
技术领域：
：的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。本发明提出的一种增强测序灵敏度的基因富集方法，通过涉及特异性的引物，有选择性的扩增野生或突变模版，通过扩增产物的量来确定是否为野生型或突变型，利用pcr引物的3’端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性pcr扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现pcr扩增带，从而检测出突变。本发明主要利用毛细管电泳平台进行技术升级，以能够达到检测灵敏度为1％，甚至更低的可能性。对引物进行独特设计，引入blocker，封闭野生型模板，抑制野生型片段，对blocker引物ddc3’端起到完全封闭作用，使引物能特异性的结合突变模板，从而增强整个反应中突变模板的扩增拷贝数，以达到放大低突变检测的目的。实施例1选取egfrt790m进行此基因富集方法的实验验证人类表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路，所以egfr成为非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。在引物与blocker之间的设计，在含有1％突变的样本中，要使低突变模板被目标引物所捕获，需要将野生型模板进行封闭，从而将突变型模板充分释放出来。为了达成这个目的，封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(δgwt)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(δgvar)要强，即自由能(δδg60℃＝δgwt-δgvar)≥3kcalmol-1，因为blocker引物的封闭作用，使扩增引物对突变模板的扩增能力比扩增引物对野生模板的扩增增加80％，这样使得野生型模板在整个循环中得到的扩增产物不断减少，突变型模板得到的扩增产物不断增多，对突变位点起到一个很好的富集作用。对于blocker引物而言，它所起最大的作用就是封闭野生型模板，但blocker引物本身是与野生型模板完全配对的序列，对其的要求只有封闭作用，不能参与引物的扩增，因此对于其引物3’端的修饰尤其重要，必须对blocker引物3’端起到完全封闭作用，如果引物3’端封闭效果不佳，可能导致blocker引物参与扩增，进而增加野生型模板的扩增，使得突变型的扩增产物占比不断减少，以至于灵敏度较差。所以对于blocker引物3’端的修饰进行体系筛选，最终确定ddc3’端修饰。对egfrt790m进行引物设计，旨在得到超灵敏性检测引物组合，从而打破常规的一代测序灵敏度低的瓶颈。选取经过人工合成egfrt790m突变质粒，均梯度稀释至104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl，接着利用筛选的引物体系进行检测。本实施例的检测体系中的组合物为egfrt790m基因正向引物f、egfrt790m基因反向引物r、egfrt790m基因探针fp和egfrt790m基因封闭引物blocker，其序列分别为：egfrt790m-f：cctcacctccaccgtgc；egfrt790m-r：ggtactgggagccaatattgt；egfrt790m-fp：fam-cctcctggactatgtccgggaac-bhq1；egfrt790m-blocker：cgtgcagctcatcacgcagctc-ddc。其中egfrt790m基因探针fp的5’端进行fam修饰，3’端进行bhq1修饰。本实施例的检测体系中还包括常规的pcr反应液，包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、mg2+等。egfrt790m基因富集方法的步骤包括：(1)提取相应突变的质粒，提取试剂盒均来自天根生化科技有限公司；(2)配制pcr反应液：dna聚合酶、dntps、mg2+、10×dna聚合酶buffer、目的基因引物探针组合物，利用上述的引物探针组合物以及pcr反应液进行荧光定量pcr；dnapcr扩增反应体系的配制：目的基因引物探针组合物，egfrt790m扩增反应液(加blocker和不加blocker)：(3)pcr反应条件：37℃udg酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，60退火延伸35s，45个循环。信号收集，60℃收集fam信号。(4)pcr产物进行毛细管电泳分析。利用上述检测体系对梯度稀释的相应突变的质粒104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl进行检测，如图1所示。根据毛细管电泳分析结果表明：egfrt790m突变检测能够达到10拷贝/μl，相当于1‰突变含量；毛细管电泳能够清楚看到egfrt790m突变峰，不含blocker引物检测结果最低检测分布比例至103拷贝/μl。实施例2选取kras进行此基因富集方法的实验验证kras基因在调节细胞生长和分化方面具有重要作用，kras基因激活与促进恶性骨肿瘤细胞的浸润及转移有关。kras基因绝大部分突变位置在12、13位密码子突变有关，其他密码子突变在59、61位上。对于kras基因12、13位密码子的突变主要有7种，分别为g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d，但是在这两个密码子上还包含其他种类的突变形式。实施例1的egfrt790m在引物扩增区域只有一个位点可能发生突变，但是对于kras基因12和13密码子相隔2-3个碱基，这个区域可能发生突变有7种以上。本发明旨在通过一个反应毛细管电泳法反应体系就能检测出多种突变形式，而且能直观的判读是哪一个碱基发生了改变。本发明主要考虑的还是在引物与blocker之间的设计，在含有1％突变的样本中，要使低突变模板被目标引物所捕获，需要将野生型模板进行封闭，从而将突变型模板充分释放出来。为了达成这个目的，封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(δgwt)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(δgvar)要强，即自由能(δδg60℃＝δgwt-δgvar)≥5kcalmol-1，不同自由能的选择体现blocker引物封闭能力的不同，对于多突变点区域来说，blocker引物需要对野生型模板更强的封闭能力，并且确保blocker引物不能与突变型模板进行结合，导致突变型模板被封闭，因此在blocker引物设计上一定要满足上述要求。在此基础上为了起到更好的封闭效果，满足多突变位点检测不受影响，引入三条blocker引物，覆盖到kras基因主要的7种突变形式。选取经过人工合成g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d突变质粒，均梯度稀释至104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl，接着利用筛选的引物体系进行检测。本实施例的检测体系中的组合物为kras基因正向引物f、kras基因反向引物r、kras基因探针fp和kras基因封闭引物blocker1、kras基因封闭引物blocker2、kras基因封闭引物blocker3，其序列分别为：kras-f：gaaaatgactgaatataaacttgtggtkras-r：agatttacctctattgttggatcatattkras-fp：fam-gacgatacagctaattcagaatcattttgtgga-bhq1krasblocker1：tggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgc-ddckrasblocker2：ttgtggtagttggagctggtggcgt-ddckrasblocker3：acttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaaga-dd其中kras基因探针fp的5’端进行fam修饰，3’端进行bhq1修饰。本实施例的检测体系中还包括常规的pcr反应液，包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、mg2+等。kras基因富集方法的步骤包括：(1)提取相应突变的质粒，提取试剂盒均来自天根生化科技有限公司；(2)配制pcr反应液：dna聚合酶、dntps、mg2+、10×dna聚合酶buffer、目的基因引物探针组合物，利用上述的引物探针组合物以及pcr反应液进行荧光定量pcr；dnapcr扩增反应体系的配制：目的基因引物探针组合物，kras扩增反应液(加blocker和不加blocker)：(3)pcr反应条件：37℃udg酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，60退火延伸35s，45个循环。信号收集，60℃收集fam信号。(4)pcr产物进行毛细管电泳分析。利用上述检测体系对梯度稀释的相应突变的质粒104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl进行检测，如图2所示。根据毛细管电泳分析结果表明：g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d突变检测能够达到10拷贝/μl，相当于1‰突变含量；毛细管电泳能够清楚看到kras基因g12a、g12d、g12r、g12c、g12s、g12v、g13d突变峰，不含blocker引物检测结果最低检测分布比例至103拷贝/μl。实施例3，针对毛细管电泳片段分析测序的实验验证微卫星是由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记应用广泛。在肿瘤细胞中，错配修复系统中相关基因(mismatchrepair,mmr)缺失时,可导致微卫星重复序列不稳定(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定(microsatelliteinstability,msi)。根据msi不稳定的程度，可分为微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability-high,msi-h)，微卫星低度不稳定(microsatelliteinstability-low,msi-l)和微卫星稳定(microsatellitestable,mss)型。2015年在新英格兰医学杂志发表的nct01876511研究结果表明，pd-1单抗治疗对msi-h的mcrc表现出高缓解率，因此pembro单抗治疗msi-h的mcrc获得fda突破性疗法认定。2016年asco年会上发布的checkmate-142，ⅱ期研究的数据表明，msi-h的mcrc患者不仅可从pd-1免疫治疗获益，而且对pd-1和ctla-4联合治疗的临床活性和生存期都远远超过了单独使用pd-1的疗效。2017年5月23日，美国fda批准了默沙东公司的“明星”pd-1抗体pembrolizumab(商品名：keytruda)用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤，具体来说，keytruda被批准用于治疗携带“msi-h/dmmr亚型”的成人和儿童实体瘤患者。本发明中选取检测msi单核苷酸重复位点bat-26、bat-25、nr-21、nr-24、nr-27、mono-27，旨在增强整个msi检测的特异性和灵敏度。目前国内医院开展msi多通过pcr法结合毛细管电泳法来检测msi状态。该方法为目前的金标准检测。但目前市场上多数产品由于受一代测序技术限制，灵敏度只能达到20％左右。然而对于肿瘤体细胞突变而言，突变率检测应低至1％才能满足临床需求。并且msi的检测并不像egfr点突变一样可通过arms-pcr检测进行弥补一代测序检测灵敏度的不足，但msi检测目前通过测序手段来进行，对于片段分析这块亟需超灵敏的毛细管电泳检测方法。本发明提供的一种用于检测微卫星不稳定性的组合物，为了提高6个单核苷重复位点检测灵敏度，对其位点进行特殊的设计，以期其通过一代测序能检测到低至1％的突变类型。在含有1％突变的样本中，要使低突变模板被目标引物所捕获，需要将野生型模板进行封闭，从而将突变型模板充分释放出来。为了达成这个目的，封闭引物(blocker引物)与野生型模板的结合自由能(δgwt)需要比blocker引物与突变型模板的结合自由能(δgvar)要强，即自由能(δδg60℃＝δgwt-δgvar)≥4kcalmol-1，由于msi是单碱基的多重复序列，因此封闭引物极易受重复序列的影响，导致封闭效果失败。因此在设计上要严格控制封闭引物与模板的结合自由能。选取经过细胞系sw620和hct116，sw620为msi-h型，hct116为mss型。用hct116(人结肠癌细胞)将sw620(人结肠癌细胞)稀释到1％突变，接着利用筛选的引物体系进行检测。检测体系中包含的主要成分包括：引物、blocker引物，具体引物序列如下：nr-21基因正向引物f(nr-21-f)：fam-atttttatatttaaatgtatgtctcc，nr-21基因反向引物r(nr-21-r)：cattcacactttctggtcac，nr-21基因blocker(nr-21-b)：cccctggcctttttttttttttttttttttagcaacac-ddc；nr-27基因正向引物f(nr-27-f)：fam-aaccatgcttgcaaacc，nr-27基因反向引物r(nr-27-r)：cttgtcaaaattcagaatttc；nr-27基因blocker(nr-27-b)：accactggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccac-ddc；mono-27基因正向引物f(mono-27-f)：fam-gacagagcaagactctgcc，mono-27基因反向引物r(mono-27-r)：aaacatttattttcagtgctaacat，mono-27基因blocker(mono-27-b)：cctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcctggt-ddc；bat-25基因正向引物f(bat-25-f)：hex-taaagagttttgtgttttgtttt，bat-25基因反向引物r(bat-25-r)：aaaatccaatacttttgttttaaa，bat-25基因blocker(bat-25-b)：ttttttgatttttttttttttttttttttttttgagaa-ddc；bat-26基因正向引物f(bat-26-f)：hex-gcccttaacctttttcaggt，bat-26基因反向引物r(bat-26-r)：gaggggagagaaaaatacag，bat-26基因blocker(bat-26-b)：ggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggttaaa-ddc；nr-24基因正向引物f(nr-24-f)：tmr-cagagtgagactctgtctcac，nr-24基因反向引物r(nr-24-r)：atttaaggtctgccttaacg，nr-24基因blocker(nr-24-b)：cacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaataggactg-ddc；pentad基因正向引物f(pentad-f)：fam-agttcctgtctctctgcca，pentad基因反向引物r(pentad-r)：gctgtagccttttgcc；pentac基因正向引物f(pentac-f)：hex-agcagaggttttctaaata，pentac基因反向引物r(pentac-r)：aagtcgtctttggacagg；amel基因正向引物f(amel-f)：tmr-ggcgcgcgacaccgcag，amel基因反向引物r(amel-r)：ccctttctcaagggaacc；除了相应的引物探针之外，还包括常规的pcr反应液，包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、mg2+等。具体的实验步骤是：(1)提取相应突变的质粒；提取试剂盒均来自天根生化科技有限公司；(2)配制pcr反应液：dna聚合酶、dntps、mg2+、10×dna聚合酶buffer、目的基因引物探针组合物，利用上述的引物探针组合物以及pcr反应液进行荧光定量pcr；dnapcr扩增反应体系的配制：msi扩增反应体系(加blocker和不加blocker)(3)pcr反应条件：37℃下udg酶反应2min；95℃预变性3min；94℃变性15s，55℃下退火延伸45s，30个循环。(4)pcr产物进行毛细管电泳分析，取扩增产物1μl、rox-500分子量内标1μl和hi-diformamide(高纯甲酰胺)8μl置于0.2mlpcr单管中涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。按照毛细管电泳机器的上样说明，在合适的毛细管电泳检测机器上进行检测。(5)结果分析如图3所示。根据毛细管电泳分析结果表明：bat-26、bat-25、nr-21、nr-24、nr-27、mono-27突变检测能够达到1％。不含blocker引物检测结果最低检测分布比例至20％，含blocker引物检测结果最低检测分布比例至1％。本发明主要采用pcr-毛细管电泳法，额外添加多条blocker引物，严格控制非特异性条带的扩增，使整个技术平台检测灵敏度更高、特异性更好，提高平台的检测样本适用性。本申请保护的基因富集方法在dna碱基测序和片段分析测序方面对基因突变检测都具有很大优势。本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本
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