一种丁酸梭菌的快速筛选方法与流程

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种丁酸梭菌的快速筛选方法。
背景技术：
：菌种是发酵的根本，每一发酵产品的生产水平跨越式提高都与菌种技术进步密不可分。因而提高丁酸发酵的工业生产水平，对丁酸工业产生菌进行选育，获得高产、遗传稳定的菌株，始终是丁酸研究工作中的一个热点，其中菌种筛选技术是获得高产菌株的关键。目前丁酸生产主要以合成法为主，关于发酵法生产丁酸的高产菌种的获得，文章和专利可见的研究较少。发酵法生产丁酸的高产菌种的常规筛选程序包括突变体文库构建，平板分离初步筛选，摇瓶发酵筛选和hplc定量鉴定。常规筛选方法具有以下缺点：首先，传统的平板分离初步筛选是在普通的平板培养基下，平板上只是长出单菌落，但是单菌落的好坏未知，需要后续通过摇瓶考察其效价的高低来确定，筛选效率不高且操作较为繁琐；其次，摇瓶培养过程对于物料和人工的消耗都较大；再次，hplc的高成本和低效率进一步限制了高通量筛选目标的达成。尽管还有许多其他检测丁酸的分析方法，但所有方法都是费时或高成本的，导致无法有效、经济地检测丁酸。因此，迫切需要开发一种简单，快速，低成本的高通量筛选方法来筛选具有良好性能的丁酸菌。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌的快速筛选方法。本发明提供的筛选方法，提高了平板挑选菌落的目的性，可以大大的提高具有一定生产水平的丁酸梭菌菌株的筛选效率。为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、nacl2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。本发明提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛方法，包括以下步骤：将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于上述的平板分离初筛培养基中，于35℃-37℃厌氧培养24-48h，测量平板分离初筛培养基上单菌落产生的变色圈直径，变色圈直径≥0.5cm且分离度好的单菌落即为初筛合格的丁酸梭菌。本发明还提供了一种丁酸梭菌的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)将上述初筛合格的丁酸梭菌进行孔板复筛得到丁酸梭菌的种子液，检测所得种子液的丁酸含量；(2)选取步骤(1)中丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作为复筛优株进行试管斜面培养和摇瓶培养，检测摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量；摇瓶培养后所得种子液中较复筛优株丁酸含量提升≥5％的菌株即为筛选得到的丁酸梭菌。优选的，所述孔板复筛包括96孔板厌氧培养和48孔板厌氧培养；所述96孔板厌氧培养时间为12-17h；所述48孔板厌氧培养时间为24-48h。优选的，所述试管斜面培养为厌氧培养；所述厌氧培养的温度为35℃-37℃，所述厌氧培养的时间为24-48h。优选的，所述试管斜面培养的培养基，以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖0.5-1g/l、nacl2-7g/l、琼脂1.3-1.6g/l。优选的，所述摇瓶培养包括摇瓶液体种子培养和摇瓶液体发酵培养；所述摇瓶培养的温度为35℃-37℃。优选的，所述摇瓶液体种子培养的培养基以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖5-8g/l、nacl2-7g/l以及溶剂水；所述摇瓶液体发酵培养的培养基以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖10-12g/l、nacl2-7g/l以及溶剂水。优选的，所述摇瓶液体种子培养的时间为12-17h；所述摇瓶液体发酵培养的时间为24-48h。与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：1、本发明提供了一种利用平板变色圈快速筛选丁酸梭菌的方法，该方法将肉眼观察不到的产量性状转化为可见的形态变化，利用指示剂，在平板单菌落上就能进行初步的筛选，克服了初筛的盲目性，可以大大的提高筛选效率。2、本发明提供了一种丁酸梭菌的96孔板高通量筛选方法，确认了一套完整的孔板筛选工艺，检测时间降低了1.5倍，检测的菌株数量提高了9.6倍，为丁酸梭菌高产菌株的筛选提供了快速高效的方法。附图说明图1本发明丁酸梭菌筛选方法流程图。图2传统丁酸梭菌菌株筛选方法流程图。图3丁酸含量标准曲线图。具体实施方式本发明是基于工业微生物具有一定生产水平的丁酸梭菌菌株的快速筛选方法，建立了一套完善的丁酸的快速的高通量筛选方法，提高了菌株的筛选效率，避免了微生物在长期传代使用的过程中，产生退化，效能降低的问题，大大的提高了筛选效率。本发明提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、nacl2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。本发明中，筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基中添加有指示剂溴甲酚绿。本发明中，所述溴甲酚绿在所述平板分离初筛培养基的质量百分含量优选为0.5％-0.7％，更优选为0.6％。本发明所述的溴甲酚绿可与目标产物丁酸反应产生变色圈，发生颜色变化且不影响菌株的生长，能够通过变色圈大小快速的判定产目标产物丁酸的多少，提高筛选效率。本发明提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛方法，包括以下步骤：将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于上述所述的平板分离初筛培养基中，于35℃-37℃厌氧培养24-48h，测量平板分离初筛培养基上单菌落产生的变色圈直径，变色圈直径≥0.5cm的单菌落即为初筛合格的丁酸梭菌。本发明中，将丁酸梭菌菌株接种于液体种子培养基中进行活化。本发明中所述液体种子培养基以水作为溶剂，优选包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖5-8g/l、nacl2-7g/l；更优选为包括以下组分：蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖6g/l、nacl5g/l。本发明中，所述活化优选于厌氧条件下进行。所述活化的温度优选为35℃-37℃，更优选为36℃；所述活化的时间优选为12-17h，更优选为15h。本发明中，将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于平板分离初筛培养基前优选的还包括将所述活化后的丁酸梭菌菌株种子液进行稀释。本发明中所述稀释的方法优选为：取活化完的种子液1ml加入装有9ml无菌水的试管中摇匀即为10-1。本发明中将丁酸梭菌菌株种子液优选的稀释至10-2-10-8，更优选的稀释至10-5-10-7。本发明将丁酸梭菌菌株种子液涂布前进行稀释，避免菌落生长过密，有利于单菌落的收集。本发明还提供了一种丁酸梭菌的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)将所述初筛合格的丁酸梭菌进行孔板复筛得到丁酸梭菌的种子液，检测所得种子液的丁酸含量；(2)选取步骤(1)中丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作为复筛优株进行试管斜面培养和摇瓶培养，检测摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量；摇瓶培养后所得种子液中较复筛优株丁酸含量提升≥5％的菌株即为筛选得到的丁酸梭菌。本发明中，所述孔板复筛包括96孔板厌氧培养和48孔板厌氧培养。本发明中，所述孔板复筛的温度优选为35℃-37℃，更优选为36℃；在本发明中，所述孔板复筛优选的在厌氧条件下进行培养；所述96孔板培养时间优选为12-17h，更优选为15-16h；所述48孔板培养时间优选为24-48h，更优选为28-36h。在本发明中，所述孔板复筛后需要检测种子液的丁酸含量。本发明孔板复筛后所述种子液中丁酸含量优选的采用酶标仪进行检测。本发明所述酶标仪检测丁酸含量的方法优选为：将孔板复筛后所述种子液进行离心，用酶标仪检测离心后所得上清液的吸光值，将测得的吸光值根据标准曲线计算出丁酸含量。本发明对所述酶标仪的型号和来源并没有特殊要求，采用本领域常规的酶标仪即可。在本发明具体实施例中，所述标准曲线获得的方法具体为：取丁酸含量为99.97％的丁酸标准品1支，取6支10ml容量瓶，分别称取100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg丁酸标准品于6支容量瓶中，再在每个容量瓶中加入1ml质量分数为0.5％的酚酞溶液，然后定容，即得到10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/mll的标准溶液，然后测定波长600nm下的吸光值得到下表1：表1不同浓度标准溶液的吸光值浓度(mg/ml)102030405060吸光值0.1220.1790.2400.2870.3580.414根据上述表1所述的吸光值可得标准曲线如附图3所示。所述标准曲线方程为：y＝0.0058x+0.062。本发明中，所述筛选得到的复筛优株需要进行试管斜面培养。所述的试管斜面培养优选为厌氧培养。本发明所述试管斜面培养的培养基，以水为溶剂，优选的包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖0.5-1g/l、nacl2-7g/l、琼脂1.3-1.6g/l，更优选的包括以下组分：蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖0.8g/l、nacl5g/l、琼脂1.5g/l。本发明所述试管斜面培养的温度优选为35℃-37℃，更优选为36℃；所述试管斜面培养的时间优选为24-48h，更优选为28-36h。本发明所述试管斜面培养主要是为了扩大培养，获得大量的优株菌体。本发明中，所述的复筛优株进行试管斜面培养后还需要进行摇瓶培养。所述摇瓶培养优选的包括摇瓶液体种子培养和摇瓶液体发酵培养。本发明所述摇瓶培养的温度优选为35℃-37℃，更优选为36℃；。本发明中，所述摇瓶液体种子培养的培养基，以水作为溶剂，优选的包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖5-8g/l、nacl2-7g/l，更优选的包括以下组分：蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖6g/l、nacl5g/l。本发明所述摇瓶液体发酵培养的培养基以水作为溶剂，优选的包括以下组分：蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉8-12g/l、葡萄糖10-12g/l、nacl2-7g/l，更优选的包括以下组分：蛋白胨10g/l、酵母浸粉10g/l、葡萄糖11g/l、nacl6g/l。本发明中，所述摇瓶液体种子培养的时间优选为12-17h，更优选为15-16h；所述摇瓶液体发酵培养的时间优选为24-48h，更优选为28-36h。本发明中，所述摇瓶培养后需要检测所得种子液的丁酸含量。本发明中摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量优选的采用分光光度计进行检测。本发明对所述分光光度计的型号和来源并没有特殊限定，采用本领域常规的分光光度计即可。本发明优选的采用722s可见分光光度计检测摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量。本发明所述采用722s可见分光光度计检测丁酸含量的方法优选为：将摇瓶液体发酵培养完成的丁酸种子液进行过滤获得滤液，用722s可见分光光度计检测所得滤液的吸光值，将测得的吸光值根据标准曲线计算出丁酸含量。本发明对具体实施方式所述试剂和仪器的来源并没有特殊限定，如无特殊说明，采用本领域常规市售产品即可。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1(1)选取待筛选的具有一定生产丁酸性能的丁酸梭菌菌株在厌氧操作台上用接种针刮取适量菌体接种于液体种子培养基中，然后于厌氧培养箱中36℃培养16h进行活化。(2)平板分离初筛：将蛋白胨10％、酵母浸粉12％、葡萄糖1％、nacl5％、溴甲酚绿0.6％、琼脂1.5％和余量的水组成的平板分离初筛培养基倾倒平板，然后取活化完的种子液1ml加入装有9ml无菌水的试管中摇匀即为10-1，然后继续稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度各0.1ml并涂布于不同的平板上，厌氧培养箱中34℃培养36h，通过平板上单菌落产生的变色圈的大小进行直观快速的初筛，挑选变色圈直径≥0.5cm且分离度较好的单菌落进行后续的复筛。(3)孔板复筛：将初筛后的单菌落接入96孔板中，厌氧培养箱中36℃培养15h，将培养好的孔板种子液在厌氧操作台上转入48孔板中，厌氧培养箱中36℃培养36h，然后将培养完成的丁酸种子液进行离心，用酶标仪检测离心后所得上清液的吸光值，将测得的吸光值根据附图3所示标准曲线计算出丁酸含量，将丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株确认为复筛优株。(4)试管斜面培养：从96孔板种子液中挑取复筛优株接入固体试管斜面中进行扩培，将接种后的试管斜面放入厌氧培养箱中36℃培养36h。(5)摇瓶培养：刮取试管斜面菌体接种至摇瓶液体种子培养基，36℃培养15h，移种至摇瓶液体发酵培养基，36℃培养36h，将摇瓶液体发酵培养完成的丁酸种子液进行过滤获得滤液，用分光光度计检测所得滤液的吸光值，将测得的吸光值根据所述标准曲线计算出丁酸含量，挑选摇瓶培养后所得种子液中较复筛优株丁酸含量提升≥5％的菌株进行保藏。实施例2选取产酸水平5mg/l的丁酸梭菌菌株cb001、产酸水平40mg/l的丁酸梭菌菌株cb004、产酸水平43mg/l的丁酸梭菌菌株cb009，分别采用实施例1以及如附图2所示的传统的丁酸梭菌菌株筛选方法在相同的环境条件下进行丁酸梭菌的筛选。1、取产酸水平5mg/l的丁酸梭菌菌株cb001，分别以传统方法和实施例1所述的方法进行筛选，筛选结果如表2所示。表2不同筛选方法筛选丁酸梭菌菌株cb001的结果2、取产酸水平40mg/l的丁酸梭菌菌株cb004，分别以传统方法和实施例1所述的方法进行筛选，筛选结果如表3所示。表3不同筛选方法筛选丁酸梭菌菌株cb004的结果3、取产酸水平43mg/l的丁酸梭菌菌株cb009，分别以传统方法和实施例1所述的方法进行筛选，筛选结果如表4所示。表4不同筛选方法筛选丁酸梭菌菌株cb009的结果可以看出，传统的筛选方法需要三轮摇瓶筛选，菌株考察培养的容器为摇瓶及开放式摇床，摇床容量小，1个摇瓶接1个菌株，1批考察50个菌株。传统的筛选方法采用分光光度计检测，流程复杂，1批50个摇瓶即50个样品需要预处理及检测时间6h/人。而本发明所述筛选方法用变色圈直径大小筛选替代摇瓶筛选，96孔微孔板培养，培养容器为孔板摇床，容量大，1块孔板接96个菌株，1批培养480-960个菌株。同时本发明采用酶标仪检测，5个孔板即480个样品需要检测时间4h/人，检测时间降低了1.5倍，检测的菌株数量提高了9.6倍。由以上实施例可以看出，本发明提供了一种利用平板变色圈快速筛选丁酸梭菌的方法，该方法利用指示剂将肉眼观察不到的产量性状转化为可见的形态变化，在平板单菌落上就能进行初步的筛选，同时确认了一套完整的孔板筛选工艺，大大的提高了丁酸梭菌的筛选效率。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12