本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类2，3，4-三取代四氢吡咯烷类化合物、其制备方法、并包含其药物制剂及其医药用途。
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：恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，防控形势严峻。2019年1月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据显示：2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症。与历史数据相比，癌症负担呈持续上升态势。近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。肺癌、肝癌、上消化系统肿瘤及结直肠癌、女性乳腺癌等依然是我国主要的恶性肿瘤。肺癌位居男性发病第1位，而乳腺癌为女性发病首位。随着城镇化、老龄化进程的不断加快和生活方式的改变，炎症性疾病已成为影响全球人群健康的重要威胁之一，包括许多传染性疾病和自身免疫性疾病、恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病等慢性非传染性重大疾病都属于炎症性疾病范畴，这些疾病正在全球范围蔓延并且已演变成严重危害人类健康和社会经济可持续发展的重要公共卫生问题，抓住炎症发生发展这一众多疾病的共性机制开展研究，将为疾病的预防、诊断和治疗提供新的策略，越来越受到各国政府和社会展开的高度重视。由于癌症和炎症性疾病的发病率呈逐年升高的趋势，其病理机制非常复杂，因此，发现结构多样性的药物来缓解癌症和迫在眉睫。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供一类2，3，4-三取代四氢吡咯烷类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法、药物组合物以及其在制备预防和/或治疗与sphk1功能异常相关的疾病中的应用。为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：本发明技术方案的第一方面是提供如通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐：其中，r为优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为更优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为进一步优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为更进一步优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为本发明上述任一化合物药学上可接受的盐为有机酸盐或无机酸盐，其中有机酸包括乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述化合物的制备方法，本发明的通式(i)化合物可用下述方法制备：r’＝r为将化合物ii溶解于二氯甲烷中，于氮气保护下，加入相应烯烃，grubbs2nd，加热回流反应7h，以tlc检测反应原料消失；反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得化合物粗品(iii)；将化合物粗品(iii)溶解于乙腈中，于氮气保护下加入碳酸铯，苯硫酚，50℃反应3h，以tlc检测反应原料消失；反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得化合物粗品(iv)；将化合物粗品(iv)溶解于甲醇中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液用硅藻土过滤，旋干溶剂，得化合物粗品(v)；将化合物粗品(v)溶解于乙腈/水(体积比1:4)中，加入硝酸铈铵，室温反应3h，反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)，得目标化合物。本发明技术方案的第三方面是提供包含第一方面所述化合物的药物组合物其药学上可接受的盐与一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物，为临床上或药学上可接受的任一剂型，优选为口服制剂或注射剂。其中含有生理有效量的通式(i)所示的化合物0.01g～10g，可以为0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.04g、0.05g、0.1g、0.125g、0.2g、0.25g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.75g、1g、1.25g、1.5g、1.75g、2g、2.5g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g等。本发明任一化合物、其药学上可接受的盐，可以口服或肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于肠胃外给药时，可制成注射剂。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，可选用水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、ph值调节剂、增溶剂、填充剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用药用辅料。本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。本发明的化合物临床所用剂量为0.01-1000mg/天，也可根据病情的轻重或剂型的不同偏离此范围。本发明技术方案的第四方面是提供包含第一方面所述化合物以及第三方面所述药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。所述癌症包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺腺癌、黑色素瘤、食管癌。本发明技术方案的第四方面是提供包含第一方面所述化合物以及第三方面所述药物组合物在制备治疗炎症性疾的药物中的应用，所述炎症性疾病包括炎症性肠病、肝炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎或多发性硬化症。有益技术效果：药理实验结果标明，本发明的化合物对肺腺癌(a549)、人黑色素瘤细胞(a375)、人结肠癌(lovo)、人肝癌(hepg2)具有较强的抑制作用，化合物p6对人食管癌(te-1)具有较强的抑制作用。本发明的化合物对人类风湿性关节炎滑膜细胞具有较强的抑制作用。此外，本发明提供的制备方法具有不需要中间体分离，反应条件温和、操作简单等特点。具体实施方式下面结合具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。将化合物ii(0.186mmol)溶解于二氯甲烷(6ml)中，于氮气保护下，加入烯烃(0.744mmol)，grubbs2nd(0.037mmol)，加热回流反应7h，以tlc检测原料消失。反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得化合物粗品(iii)。将所得粗品(iii)溶解于乙腈(6ml)中，于氮气保护下加入碳酸铯(0.372mmol)，苯硫酚(0.28mmol)，50℃反应3h，以tlc检测原料消失。反应液冷却至室温并通过短的短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得化合物粗品(iv)。将所得粗品(iv)溶解于甲醇(6ml)中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液经硅藻土过滤，旋干溶剂，得化合物粗品(v)。将所得粗品(v)溶解于乙腈/水(1:4)中，加入硝酸铈铵(0.372mmol)，室温反应3h。反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)，得p系列四氢吡咯烷类目标化合物。化合物ii结构说明如下：实施例1(2r,3s,4s)-4-氨基-2-十四烷基吡咯烷-3-醇的制备(p1)的合成将化合物ii(0.186mmol)溶解于二氯甲烷(6ml)中，于氮气保护下，加入1-十三烯(0.744mmol)，grubbs2nd(0.037mmol)，加热回流反应7h，以tlc检测原料消失(乙酸乙酯-二氯甲烷-石油醚3:2:5)。反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得粗品。将所得粗品溶解于乙腈(6ml)中，于氮气保护下加入碳酸铯(0.372mmol)，苯硫酚(0.28mmol)，50℃反应3h，以tlc检测原料消失(甲醇-二氯甲烷7:93)。反应液冷却至室温并通过短的短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得粗品。将所得粗品溶解于甲醇(6ml)中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液经硅藻土过滤，旋干溶剂，得粗品。将所得粗品溶解于乙腈/水(1:4)中，加入硝酸铈铵(0.372mmol)，室温反应3h。反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)得化合物p1。白色固体，产率：25％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.48(t,j＝5.6hz,1h),3.29–3.43(m,2h),2.82(q,j＝5.6hz,1h),2.60(dq,j＝11.6,6.0,5.5hz,1h),1.84(brs,4h),1.54–1.63(m,1h),1.25(s,25h),0.88(t,j＝6.7hz,3h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):75.72,65.00,53.15,51.73,34.02,31.85,29.55,29.58(2c),29.62(4c),29.48,29.29,26.75,22.61,14.00.ir(kbr,cm-1):3348,3242,2918,2850,1558,1469,1458,1377,1350,1118,1080,1028,956,908,894,869,825,719.hrms(esi):m/zcalcdforc18h38n2o(m+h)+:299.3062.found:299.3047.实施例2-12中化合物p2-p16的制备方法同实施例1，区别在于使用不同的烯烃试剂合成，具体每个实施例中使用的烯烃原料在相应实施例中有记载：实施例2(2r,3s,4s)-4-氨基-2-十二烷基吡咯烷-3-醇的制备(p2)所用烯烃试剂为1-十一烯。产物为白色固体，产率:36％,1hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):3.62–3.66(m,1h),3.22(q,j＝6.7hz,1h),3.17(dd,j＝11.0,6.7hz,1h),2.90(q,j＝5.8hz,1h),2.62(dd,j＝11.0,7.4hz,1h),1.58–1.65(m,1h),1.24–1.51(m,21h),0.92(t,j＝7.0hz,3h).13cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):75.93,64.58,53.38,50.68,33.65,31.69,29.44,29.42,29.40,29.38,29.36,39.30,29.10,26.66,22.36,13.07.ir(kbr,cm-1):3350,3244,2920,2850,2667,2546,1641,1591,1467,1377,1352,1311,1116,1080,1029,954,906,871,823,719cm-1；hrms(esi):m/zcalcdforc16h34n2o(m+h)+:271.2749.found:271.2629.实施例3(2r,3s,4s)-4-氨基-2-(11-(环己基)十一烷基)吡咯烷-3-醇的制备(p6)所用烯烃试剂为((癸-9-烯-1-氧基)甲基)环己烷。产物为粘稠油状，产率：23％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.52(t,j＝5.3hz,1h),3.36(h,j＝6.7hz,4h),3.19(d,j＝6.6hz,2h),2.86(d,j＝5.2hz,1h),2.63(dd,j＝9.6,6.1hz,1h),2.31(brs,4h),1.10–1.81(m,29h),0.90(q,j＝10.9,10.1hz,2h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):76.83,75.80,71.15,65.54,53.26,52.97,38.05,34.40,30.18(2c),29.75(2c),29.59(2c),29.56,29.55,29.50,26.91,26.69,26.18,25.91(2c).ir(kbr,cm-1):3348,3244,2922,2850,2792,1558,1541,1465,1448,1406,1375,1124,1014,954,889,821,721.hrms(esi):m/zcalcdforc22h44n2o2(m+h)+:369.3481.found:369.3477.实施例4(2r,3s,4s)-4-氨基-2-(9-(苄基氧基)壬基)吡咯烷-3-醇的制备(p8)所用烯烃试剂为((辛-7-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：37％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.23–7.41(m,5h),4.50(s,2h),3.48(dt,j＝21.9,6.1hz,3h),3.33(h,j＝6.9hz,2h),2.85(q,j＝5.8hz,1h),2.61(dq,j＝11.7,6.5,5.7hz,1h),2.31(brs,4h),1.06–1.68(m,16h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):138.71,128.33(2c),127.61(2c),127.45,75.84,72.85,70.53,66.51,53.30,53.06,34.47,29.77,29.74,29.53,29.50,29.46,26.90,26.18.ir(kbr,cm-1):3346,3242,2924,2850,2659,2536,1585,1496,1454,1363,1311,1114,1074,1035,964,921,910,875,825,734,698,634,609.hrms(esi):m/zcalcdforc20h34n2o2(m+h)+:335.2699.found:335.2696.实施例5(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[10-(1-苯基乙氧基)癸基]吡咯烷-3-醇的制备(p9)所用烯烃试剂为1-氯-4-(1-(壬-8-烯-1-氧基)乙基)苯。产物为白色固体，产率：34％,1hnmr(cd3od,400mhz)δ(ppm):7.28(dp,j＝21.3,7.2hz,5h),4.40(q,j＝6.5hz,1h),3.63(t,j＝5.3hz,1h),3.30(dt,j＝13.4,7.6hz,3h),3.18(ddd,j＝17.6,11.9,6.6hz,2h),2.89(q,j＝5.8hz,1h),2.60(dd,j＝10.6,7.1hz,1h),1.08–1.66(m,24h).13cnmr(cd3od,100mhz)δ(ppm):143.88,128.07(2c),127.10,125.82(2c),77.94,75.91,68.37,64.59,53.38,50.72,33.68,29.55,29.45,29.32,29.30,29.29,29.15,26.66,25.90,23.15.ir(kbr,cm-1):3344,3267,3028,2926,2852,1647,1558,1541,1456,1406,1369,1280,1207,1105,815,759,700,611,559.hrms(esi):m/zcalcdforc22h38n2o2(m+h)+:363.3012.found:363.2998.实施例6(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[1-(4-氟苯基)乙氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p10)所用烯烃试剂为1-氟-4-(1-(壬-8-烯-1-氧基)乙基)苯。产物为白色固体，产率：38％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.27(t,j＝6.7hz,2h),7.02(t,j＝8.6hz,2h),4.36(q,j＝6.3hz,1h),3.52(t,j＝4.8hz,1h),3.35(dq,j＝16.2,6.7hz,2h),3.25(p,j＝9.0,7.6hz,2h),2.80–2.89(m,1h),2.56–2.69(m,1h),1.03–1.71(m,25h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):162.03(d,j＝243.0hz),140.03,127.65(d,j＝7.0hz,2c),115.14(d,j＝21.0hz,2c),77.18,75.81,68.73,65.53,53.29,53.01,34.44,29.91,29.75,29.55,29.54(2c),29.43,26.90,26.17,24.20.ir(kbr,cm-1):3400(br),3253,2926,2854,1645,1606,1560,1510,1456,1369,1340,1224,1103,1016,887,837,725,640,580.hrms(esi):m/zcalcdforc22h37fn2o2(m+h)+:381.2917.found:381.2761.实施例7(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[1-(4-氟苯基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p11)所用烯烃试剂为2-氯-4-氟-1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：26％；1hnmr(cd3od,400mhz)δ(ppm):7.29–7.38(m,2h),7.05(t,j＝8.7hz,2h),4.46(s,2h),3.63(t,j＝5.3hz,1h),3.47(t,j＝6.5hz,2h),3.18(ddd,j＝17.5,12.0,6.7hz,2h),2.89(q,j＝5.8hz,1h),2.61(dd,j＝10.7,7.2hz,1h),1.20–1.67(m,22h).13cnmr(cd3od,100mhz)δ(ppm):162.32(d,j＝242.0hz),134.50,129.35(d,j＝8.0hz,2c),114.63(d,j＝21.0hz,2c),75.85,71.71,70.08,64.60,53.33,50.62,33.58,29.41,29.35,29.31,29.27,29.26,29.14,26.63,25.88.ir(kbr,cm-1):3348,3242,2922,2850,2791,2659,2528,1514,1465,1363,1298,1240,1120,1016,966,921,879,821,767,721,634,567.hrms(esi):m/zcalcdforc21h35fn2o2(m+h)+:367.2761.found:367.2761.实施例8(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[(2,3,5,6-四氟-4-甲基苄基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p12)所用烯烃试剂为1,2,4,5-四氟-3-甲基-6-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：33％,1hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):4.59(s,2h),3.67(t,j＝5.4hz,1h),3.49(t,j＝6.5hz,2h),3.26(q,j＝6.7hz,1h),3.19(dd,j＝11.2,6.7hz,1h),2.91–2.97(m,1h),2.66(dd,j＝11.3,7.5hz,1h),2.28(s,3h),1.59(ddt,j＝27.5,14.0,7.6hz,3h),1.22–1.49(m,19h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):146.20,145.92,143.86,143.56,116.25(t,j＝19.0hz,1c),113.64(t,j＝18.0hz,1c),75.81,70.90,65.54,59.74,53.31,52.99,34.43,29.74,29.55,29.52(3c),29.37,26.89,25.99,7.61.ir(kbr,cm-1):3350,3244,2920,2850,2686,2538,1633,1581,1487,1409,1367,1284,1109,1072,1031,956,923,875,837,752,719,667,597.hrms(esi):m/zcalcdforc22h34f4n2o2(m+h)+:435.2635.found:435.2453.实施例9(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-{[4-(三氟甲基)苄基]氧基}癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p13)所用烯烃试剂为1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)-4-(三氟甲基)苯。产物为白色固体，产率：35％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.60(d,j＝8.0hz,2h),7.45(d,j＝7.9hz,2h),4.55(s,2h),3.50(dt,j＝19.5,6.0hz,3h),3.30–3.43(m,2h),2.87(d,j＝5.3hz,1h),2.64(dd,j＝9.7,6.1hz,1h),2.40(brs,4h),1.11–1.68(m,18h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):142.90,129.60(d,j＝32.0hz),127.46(2c),125.26(q,j＝3.8hz,2c),122.85,75.76,72.02,70.93,65.52,53.14,52.94,34.33,29.73(2c),29.56,29.54(2c),29.46,26.89,26.17.ir(kbr,cm-1):3350,3240,2926,2850,1622,1558,1469,1406,1340,1165,1124,1066,1018,970,921,879,823,758,646,594.hrms(esi):m/zcalcdforc22h35f3n2o2(m+h)+:417.2729.found:417.2721.实施例10(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[(2,4-二甲氧基苄基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p14)所用烯烃试剂为2,4-二甲氧基-1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：19％,1hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):7.09(d,j＝8.3hz,1h),6.42(d,j＝2.3hz,1h),6.38(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),4.33(s,2h),3.70(s,3h),3.69(s,3h),3.54–3.57(m,1h),3.36(t,j＝6.6hz,2h),3.14(q,j＝6.7hz,1h),3.08(dd,j＝11.2,6.7hz,1h),2.82(q,j＝6.1hz,1h),2.54(dd,j＝11.2,7.5hz,1h),1.44–1.54(m,3h),1.15–1.40(m,19h).13cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):161.01,158.72,130.32,118.56,103.89,97.80,75.63,69.79,67.08,64.62,54.46,54.37,53.16,50.31,33.30,29.36,29.31,29.27,29.25,29.23,29.11,26.58,25.82.ir(kbr,cm-1):3433(br),3269,2926,2850,1618,1510,1259,1209,1138,1093,970,920,869,829,790,719,634,565.hrms(esi):m/zcalcdforc23h40n2o4(m+h)+:409.3066.found:409.2900.实施例11(2r,3s,4s)-4-氨基-2-(10-羟基癸基)吡咯烷-3-醇的制备(p15)所用烯烃试剂为2-((壬-8-烯-1-基氧基)甲基)萘。产物为白色固体，产率：28％,1hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.59(t,j＝6.6hz,3h),3.20–3.31(m,2h),3.12(brs,5h),2.90(q,j＝6.6,5.9hz,1h),2.62(dd,j＝10.1,6.7hz,1h),1.08–1.65(m,18h).13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):75.74,65.00,62.49,53.18,51.84,34.03,32.52,29.50,29.38,29.31,29.29,29.26,26.66,25.63.ir(kbr,cm-1):3342,3248,2922,2850,2659,2528,1649,1558,1467,1431,1354,1321,1109,1062,1020,966,920,877,831,786,719,634,570,513.hrms(esi):m/zcalcdforc14h30n2o2(m+h)+:259.2386.found:259.2380.实施例124-(((10–((2r,3s,4s)-4-氨基-3-羟基吡咯烷-2-基)癸基)氧基)甲基)苄腈(p16)所用烯烃试剂为4-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯甲腈。产物为白色固体，产率：26％,1hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):7.22(d,j＝8.0hz,2h),7.16(d,j＝7.9hz,2h),4.45(s,2h),3.64(dd,j＝6.0,4.9hz,1h),3.47(t,j＝6.6hz,2h),3.14–3.24(m,2h),2.90(dt,j＝7.2,5.5hz,1h),2.62(dd,j＝11.0,7.4hz,1h),1.56–1.64(m,3h),1.26–1.51(m,15h).13cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):137.03,135.34,128.56(2c),127.59(2c),75.89,72.34,69.87,64.59,50.65,33.61,29.41,29.33,29.31,29.27,29.25,29.13,26.63,25.86,19.83.ir(kbr,cm-1):3348,3242,2920,2850,2657,2520,1720,1587,1516,1465,1367,1114,1020,960,920,877,833,800,754,719,682,655,632,567.hrms(esi):m/zcalcdforc22h35n3o2(m+na)+:396.2627.found:396.6080.本发明化合物的部分药理学试验及结果如下：实验例1：本发明化合物抗肿瘤活性研究1.1.实验材料化合物p1-p16，分别用二甲基亚砜(dmso，终浓度0.4％)溶解，用含15％胎牛血清rpmi-1640培养基配制成1mg/ml备用，用时稀释成所需浓度。人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞系，均购买于中国科学院细胞库，使用含15％胎牛血清的dmem(highglucose)培养基，置于37℃，5％的co2培养箱内培养。1.2抗肿瘤活性实验1.2.1mtt配制方法5mg/ml的mtt溶液配制：称取mtt粉末500.0mg，溶于温的100mlpbs中，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤得滤液，小剂量分装于高压灭菌后的ep管中，置于-20℃下冷冻避光保存。1.2.2细胞培养及实验方法将保存有肿瘤细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃恒温箱中，不停摇动，直到融化。用75％酒精擦拭冻存管盖边缘后，吸取细胞悬液转入10ml离心管中，补加5ml培养基。低速离心(25℃,3000r/min,5min)，弃上清，加培养基再重复离心清洗一次。加适量培养基稀释后，用吸管将细胞吹散制成悬液，转入培养瓶中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养。次日更换培养液，置于37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养。人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞均为贴壁细胞，根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的贴壁肿瘤细胞洗涤，经0.25％的edta胰酶消化，调整细胞数为1×105/ml接种于96孔板内，每孔100μl，37℃下于co2孵箱内培养，24h后给药。给药组加入不同浓度药物(化合物p1-p17)，每个药物设置5个剂量组，分别为100.00、10.00、1.00、0.10、0.01μm/l，每个浓度设三个复孔。设置空白对照、dmso(0.8％)溶剂对照和顺铂阳性对照。在37℃co2培养箱内培养48h后，用mtt法测定od值，计算细胞抑制率。1.2.3细胞ic50值的计算人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞培养48h后，终止，然后每个孔中加入10μl0.5％mtt溶液放置于co2培养箱中，4h后，除去每个孔中的液体，然后再分别加入0.2ml的dmso溶液，在摇床上低频充分振荡，使蓝紫色结晶的甲瓒充分溶解，置于酶标仪中，于490nm波长处记录od值，计算不同浓度的三个平行孔的平均值od值，根据平均值计算不同浓度下的每一种受试药物的细胞抑制率以及ic50值(见表3)。抑制率(％)＝[1-供试品od值/阴性对照组od值]×100％1.2.4结果判断中药新药临床前研究指导原则表明，天然产物ic50≤30μmol/ml时认为有一定抑制作用；合成药物ic50≤10μmol/ml时认为有一定抑制作用。表3化合物抗癌细胞增殖的ic50值2.3结果抗肿瘤细胞增殖活性表明，化合物p1，p2，p6，p8，p9，p10，p11，p12，p13，p14，p15，p16对人肺腺癌(a549)、人黑色素瘤细胞(a375)的ic50值均小于10μm，化合物p1，p2，p6，p8，p9，p10，p11，p12，p13，p15，p16对人结肠癌(lovo)、人肝癌(hepg2)的ic50值均小于10μm，化合物p6对人食管癌(te-1)的ic50值小于10μm，符合合成药物ic50≤10μmol/ml时认为有一定抑制作用的标准。实验例2：本发明化合物对人类风湿性关节炎滑膜细胞的抗炎活性筛实验材料：化合物p1，p2，p6，p8,p9,p10,p11,p12,p13,p14,p15,p16,分别用二甲基亚砜(dmso，终浓度0.4％)溶解，用含15％胎牛血清rpmi-1640培养基配制成1mg/ml备用，用时稀释成所需浓度。hfls-ra细胞购买于湖南丰晖生物科技有限公司，实验最终采用第3-5代的hfls-ra用于后续试验，细胞培养于高糖dmem+10％fbs+1％双抗培养基中。阳性对照药甲氨蝶呤是购买于mce公司。mtt法检测待测化合物对hfls-ra细胞增殖的影响ra-flss细胞(5×103个/孔/100μl)接种在96孔培养板中，孵育24h后，加入不同浓度的待测化合物(浓度设定：0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μm)和mtx(浓度设定：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μm)，继续孵育24h后加入lps(终浓度：5μg/ml)诱导处理24h，然后用冷的pbs洗涤细胞，加入含有终浓度为0.5mg/mlmtt的完全培养基，在37℃条件下孵育4h，吸走上清，加入100μldmso溶解甲瓒，利用多功能酶标仪在570nm处测定吸光度，计算不同化合物在lps诱导的hfls-ra细胞中的抑制率ic50(μm)。实验结果编号p1p2p6p8p9p10ic5010.68±2.1994.78±3.6046.27±1.4315.09±4.2524.82±11.1018.91±7.97p11p12p13p14p15p16ic5010.65±4.5011.40±7.4619.55±7.5414.27±1.31115.87±9.8310.19±1.81mtxic505.48±1.06对于人类风湿性关节炎滑膜hfls-ra细胞，化合物p1、p6、p8、p10、p11、p12、p13、p14、p16对人类风湿性关节炎滑膜细胞具有较强的抑制作用。其中化合物p1、p11、p16效果最优。当前第1页12