检测rs1766位点多态性的试剂及其应用的制作方法

技术领域：
：本发明涉及分子生物学和医学领域，涉及人hla基因的单核苷酸多态性位点rs1766的检测试剂，及其在制备糖尿病相关性风险评估试剂中的应用。
背景技术：
：：糖尿病是一种以血糖水平升高为特征的一组异质性疾病。1型糖尿病和2型糖尿病表现出明显不同的病理生理过程。1型糖尿病(t1dm)是由t淋巴细胞介导的对胰岛β细胞破坏而导致胰岛素绝对缺乏的器官特异性自身免疫性疾病，胰岛素的缺乏不仅导致葡萄糖产生过多和细胞对葡萄糖的摄取减少，同时也使得脂肪分解和脂肪酸氧化增加，从而导致糖尿病酮症酸中毒。相反的，2型糖尿病(t2dm)的特征包括外周组织胰岛素抵抗，胰岛素缺乏相对较少或没有胰岛素缺乏，虽然其特异性病因不明，但t2dm与胰岛细胞的自身免疫无关。然而，在一些研究中，10％左右的t2dm表型患者在诊断时已证实了胰岛自身免疫，这一特殊亚型称为成人隐匿性自身免疫糖尿病。成人隐匿性自身免疫糖尿病(lada)是一种由成人发病、存在糖尿病相关自身抗体、诊断后一段时间内不需要胰岛素治疗的自身免疫性糖尿病，是成人型自身免疫性糖尿病中最常见的一种。糖尿病被认为是由遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂遗传病。越来越多的研究者们将目光聚集在了遗传因素对糖尿病发生发展的作用。hla基因又称为人类主要组织相容性复合体，位于第6对染色体的短臂上，整个复合体上有近60个基因座，根据编码分子特性的不同，可将整个复合体的基因分成三类：i类、ii类、iii类。ii类基因区位于着丝点的近端，是结构最为复杂的一个区，主要由dr、dq、dp三个亚区构成，每个亚区又有若干个位点，其中本发明研究的rs1766位点就是ii类基因上dq亚区的一个位点。到目前为止，已有的研究支持lada和t1dm之间存在相同的易感基因，但是，与t1dm相比，遗传易感基因对lada的影响更小。近年来，全球t1dm及lada的发病率呈逐年递增势态，世界各国糖尿病的发病率差异较大。庞大的人口基数、逐渐增加的发病率加之严重的临床结局，使得糖尿病成为中国重大公共卫生问题之一。为了最终实现治疗lada及t1dm，本领域迫切需要寻求lada及t1dm的易感基因，并开发检测lada和t1dm易感基因的方法、试剂盒，以及相关治疗药物,以达到早期诊断以及治疗lada及t1dm的目的。技术实现要素：本发明的首要目的是提供一种检测rs1766位点多态性的试剂在制备预测糖尿病患病风险制剂中的应用。该多态性位点是首次被发现与糖尿病患病风险相关，且该位点基因型用于判定lada或t1dm患病风险，预测准确性高，可信度大。进一步的，本发明所述的糖尿病分型包括：t1dm或lada。进一步的，所述的rs1766位点多态性为：gg,ag或aa。本发明发现携带rs1766aa基因型的人群中正常人人数远高于lada或者t1dm患者人数，提示aa基因型患lada或者t1dm的风险低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比。本发明以t1dm病例和正常对照各500例左右进行rs1766基因型频率比较试验发现：携带rs1766gg基因型的人群，其患t1dm的风险显著升高，比值比or＝20.791，是aa基因型的20.791倍；ag基因型的比值比or＝2.366，是aa基因型风险的2.366倍，且p值均小于0.05，具有显著性差异。同样，以lada病例和正常对照各500例左右进行rs1766基因型频率比较试验发现携带rs1766gg基因型的人群，其患lada的风险显著升高，比值比or＝6.598，是aa基因型的6.598倍；ag基因型的比值比or＝1.944，是aa基因型风险的1.944倍，且p值均小于0.05，具有显著性差异。进一步的，本发明得到的结论为糖尿病患病风险为：gg＞ag＞aa，确切的说应该是患lada或者t1dm风险为：gg＞ag＞aa。上述检测rs1766位点多态性的试剂可以预测以下几种情形：(1)用于预测未出现糖尿病临床症状的普通人患lada或者t1dm的风险。(2)用于预测出现糖尿病临床症状但尚未确诊糖尿病的人患lada或t1dm的风险。(3)用于预测确诊糖尿病，但尚未确诊具体是哪一种糖尿病的患者患lada或者t1dm的风险。本发明的第二个目的是提供一种检测rs1766位点多态性的试剂在制备预测糖尿病分型患病风险制剂中的应用。该多态性位点是首次发现能够用于预测区分lada或t1dm和t2dm，且该位点用于判定的标准为基因型，预测准确性高，可信度大。进一步的，糖尿病分型包括：t1dm，t2dm和lada。进一步的，所述的rs1766位点多态性为：gg,ag或aa。由于携带rs1766aa基因型的人群中t2dm患者人数远高于lada或t1dm患者人数，提示aa基因型患lada或t1dm而不是t2dm的概率低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比。本发明以t1dm病例和t2dm病例各500例左右进行基因型频率比较试验发现：携带rs1766gg基因型的人群，其患t1dm而不是t2dm的概率显著升高，比值比or为9.604,是aa基因型患t1dm而不是t2dm的概率的9.604倍，且p值小于0.05，具有显著性差异。但ag基因型比值比or为1.602，p值大于0.05，差异不显著，因此，rs1766ag基因型不足以判断患t1dm而不是t2dm的概率。本发明以t2dm病例和lada病例各500例左右进行rs1766基因型频率比较试验发现：携带rs1766gg基因型的人群，其患lada而不是t2dm的概率显著升高，比值比or为3.048，是aa基因型患lada而不是t2dm的概率的3.048倍，且p值小于0.05，具有显著性差异。但ag基因型比值比or为1.316，p值大于0.05，差异不显著，因此，rs1766ag基因型不足以判断患lada而不是t2dm的概率。进一步的，本发明得到结论为：在区分lada或t1dm和t2dm时，患t1dm或lada而非t2dm的概率rs1766位点gg＞aa基因型。上述检测rs1766位点多态性的试剂能够预测以下几种情形：(1)用于预测未出现糖尿病临床症状的普通人患lada或t1dm而不是t2dm的概率。(2)用于预测出现糖尿病临床症状但尚未确诊糖尿病的人患lada或t1dm而不是t2dm的概率。(3)用于预测确诊糖尿病，但尚未确诊具体是哪一种糖尿病的患者患lada或t1dm而不是t2dm的概率。本发明的第三个目的是提供一种预测糖尿病患病风险的试剂盒。该试剂盒是基于本发明新发现的与预测糖尿病患病风险的snp位点而设计的，预测准确性高，可信度大。该试剂盒具体为检测rs1766位点多态性的试剂。进一步的，所述的试剂盒：包含特异性扩增rs1766位点的引物以及测序引物。进一步的，优选扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca,见seqidno.1；r：ttttcatgtgcttctcttgagc,见seqidno.2；但本发明试剂盒不限于该扩增引物序列。优选测序引物序列为：ttttcatgtgcttctcttgagc,见seqidno.3。但本发明试剂盒不限于该测序序列。本发明检测的lada和t1dm易感基因是hlaii类基因dq亚区的rs1766位点的基因型，rs1766的核苷酸序列可参见网址：http://genome.ucsc.edu/。本发明配套的检测方法包括以下步骤：(a)提取样品中的基因组dna；(b)pcr扩增获得包含rs1766位点的产物；(c)对产物进行测序，对该位点的基因型进行分析。本发明的检测对象是亚洲人种，尤其是中国人。上述方法中涉及的测序、扩增、提取基因组dna等技术均可采用本领域的常规操作方法。本发明经过多年研究，首次证明了hlaii类基因的dq亚区的rs1766位点的单核苷酸多态性与lada和t1dm的发病风险相关。rs1766基因型的改变将导致lada和t1dm的发病风险升高，其中关联研究结果显示，rs1766g→a在病例和对照组中的分布存在显著性差异(p<0.05)；且该位点用于判定的标准为基因型，预测准确度更高。此外，本发明还发现该多态性位点是首次发现能够用于预测区分lada或t1dm和t2dm，且该位点用于判定的标准也为基因型，预测准确性高，可信度大；因此能够简单高效的将lada或t1dm与2型糖尿病区分开来，对糖尿病患者进行更加精准的治疗意义重大。本发明可用于对个体的lada和t1dm易感性进行早期诊断，包括步骤：(1)提取样本的基因组dna。(2)用rs1766的特异性扩增引物通过pcr扩增样品的基因组dna，得到扩增产物。(3)设计测序引物，对扩增产物的rs1766位点进行测序。检测该个体的hla基因rs1766位点的基因型，以此判断该个体患lada或t1dm的发病风险是否高于普通人群。本发明为lada和t1dm的诊断与治疗提供了更加简便易行的方法。本发明还公开了相应的检测试剂盒，盒中包括扩增该位点的特异性引物以及测序引物。利用本发明检测rs1766位点的基因型，方法简单易行、快速高效、成本低廉，为lada和t1dm的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。附图说明：图1为实施例1中样本的基因组dna浓度和质量检测结果。图2为用琼脂糖凝胶电泳检测实施例1中样本基因组dna长度均大于10kb。图3为实施例2部分样本的rs1766位点扩增电泳结果。图4为实施例2中rs1766位点扩增测序结果截图；三种基因型示例图；上图为rs1766gg基因型；中图为rs1766ag基因型；下图为rs1766aa基因型。图5为实施例3中rs1766位点扩增测序结果截图；三种基因型示例图；上图为rs1766gg基因型；中图为rs1766ag基因型；下图为rs1766aa基因型。图6为实施例4中rs1766位点扩增测序结果截图；三种基因型示例图；上图为rs1766gg基因型；中图为rs1766ag基因型；下图为rs1766aa基因型。图7为实施例5中rs1766位点扩增测序结果截图；三种基因型示例图；上图为rs1766gg基因型；中图为rs1766ag基因型；下图为rs1766aa基因型。具体实施方式：下面结合具体的实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于描述本发明而并不限制本发明的范围。未注明具体条件的实验方法均按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：pcr扩增一、实验材料pcr仪：德国eppendorf公司；聚合酶链反应液：金牌mix,北京擎科生物科技有限公司。二、引物设计与合成以hlaii类基因的包括rs1766位点的部分序列为模板，使用primer3软件分析和设计引物，并由北京擎科生物科技有限公司合成。测序引物序列为：ttttcatgtgcttctcttgagc；扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca，r：ttttcatgtgcttctcttgagc三、样本检测1.实验检测lada患者,t1dm患者,t2dm患者及正常对照人群，每例收集5ml血样标本，提取基因组dna，提取结果用赛默飞公司的nanodrop2000检测。2.按如下体系进行pcr扩增：3.表1pcr反应体系加入试剂加入量金牌pcrmix27ulf1ulr1uldna1ul表2pcr反应程序四、基因型检测结果基因组dna抽提的检测结果：所有样本的基因组dna符合检测要求：260/280>1.8,浓度>10ng/ul,如附图1所示。用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna长度均大于10kb，见图2。直接测序法是公认最准确的基因分型方法，也是世界卫生组织hla命名委员会推荐的hla分型方法的“金标准”。可以直接用pcr产物测序，但某些snp多态性位点在有些个体中是缺失的，导致无法得到扩增产物，另外导致测序结果出现双峰而难以判别。一种办法是对pcr产物克隆后测序。但pcr产物克隆后测序的整体流程非常麻烦，而且测序费用很高，所以难以广泛使用。另一种方法是用特异性引物扩增和测序，这种方法相对简单、成本较低。本发明采用了后一种方法，进行了多次尝试，使用了多对引物进行扩增和测序，针对共有区设计了特异性引物解决了这一难题。所使用过的引物如下：第一组：扩增引物rs1766-1f：gtgatttcctgcctctgctc,见seqidno.4,rs1766-1r：aattcccaactgcctgtgtc,见seqidno.5,测序引物rs1766-seq1：gtgatttcctgcctctgctc；见seqidno.6,第二组：扩增引物rs1766-2f：gatttcctgcctctgctcaa,见seqidno.7,rs1766-2r：aattcccaactgcctgtgtc,见seqidno.8,测序引物rs1766-seq2：gatttcctgcctctgctcaa；见seqidno.9,第三组：扩增引物rs1766-3f：ggtcatctcctttcatccccars1766-3r：ttttcatgtgcttctcttgagc测序引物rs1766-seq3：ttttcatgtgcttctcttgagc；最后，只有第3组引物能够很好的扩增和测序，其余组的引物出现双峰，难以判别。实施例2用测序法检测hlaii类基因的rs1766位点。挑选503名t1dm患者及514名正常对照人群进行测序判断rs1766的基因型。t1dm患者共503例，男性267例，女性236例，年龄为21(11-34)岁，正常对照514例，男性265例，女性249例，年龄为42(33-53)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。t1dm患者纳入标准：纳入标准：①符合who于1999年制定的糖尿病诊断标准；②急性起病，且起病半年之内无明显诱因出现糖尿病酮症或有糖尿病酮症酸中毒倾向；③诊断半年内即依赖胰岛素治疗；④血清中至少一种胰岛自身抗体阳性：gada、ia-2a或者znt8a。排除标准：①继发性糖尿病；②妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病；③合并有其他类型的自身免疫性疾病；④合并有恶性肿瘤。正常对照纳入标准：①无血缘关系的湖南汉族人；②口服糖耐量试验(oralglucosetolerancetest,ogtt)显示空腹血糖<5.6mmol/l，2小时后血糖<7.8mmol/l。排除标准：①有心、脑、肝、肾等慢性疾病及内分泌疾患；②合并有其他类型的自身免疫性疾病；③有糖尿病家族史；④合并有恶性肿瘤。一、实验方法扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca；r：ttttcatgtgcttctcttgagc；测序引物为：ttttcatgtgcttctcttgagc。扩增的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的产物送至北京擎科生物有限公司进行测序。用lasergene软件进行分析。二、hlaii类基因rs1766位点基因型的检测结果示意图见图4。三、hlaii类基因rs1766基因型和t1dm和正常易感的关联分析hlaii类基因rs1766在t1dm患者和正常对照中分布的比较采用卡方检验，用spss软件进行统计分析，由于携带rs1766aa基因型的人群中正常人人数远高于t1dm患者人数，提示aa基因型患t1dm的风险低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比。检测结果及spss软件分析结果如下表3所示：携带rs1766gg基因型的人群，其患t1dm的风险显著升高，比值比or＝20.791，是aa基因型的20.791倍；ag基因型的比值比or＝2.366，是aa基因型风险的2.366倍，且p值均小于0.05，具有显著性差异。表3t1dm患者和正常对照的rs1766基因型频率比较注：or:比值比；95％ci:95％置信区间，*代表显著性差异。实施例3用测序法检测hlaii类基因的rs1766位点。挑选491名lada患者和514名正常对照人群进行测序判断rs1766的基因型。lada患者共491例，男性289例，女性202例，年龄为49(38-58)岁，正常对照514例，男性265例，女性249例，年龄为42(33-53)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。lada患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②一种或多种胰岛自身抗体阳性：抗体检测采用放射配体法，阳性判定标准为：405例健康人抗体指数的第99百分位点作为阳性判断阈值：gada≥0.05、ia-2a≥0.0078、znt8a≥0.011；③确诊糖尿病后6个月内不依赖胰岛素治疗；④年龄≥18岁。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。正常对照纳入标准：①无血缘关系的湖南汉族人；②口服糖耐量试验(oralglucosetolerancetest,ogtt)显示空腹血糖<5.6mmol/l，2小时后血糖<7.8mmol/l。排除标准：①有心、脑、肝、肾等慢性疾病及内分泌疾患；②合并有其他类型的自身免疫性疾病；③有糖尿病家族史；④合并有恶性肿瘤。一、实验方法扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca；r：ttttcatgtgcttctcttgagc；测序引物为：ttttcatgtgcttctcttgagc。扩增的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的产物送至北京擎科生物有限公司进行测序。用lasergene软件进行分析。二、hlaii类基因rs1766位点基因型的检测结果示意图见图5。三、hlaii类基因rs1766基因型和lada和正常的关联分析hlaii类基因rs1766在lada患者和正常对照中分布的比较采用卡方检验，用spss软件进行统计分析，由于携带rs1766aa基因型的人群中正常人人数远高于lada患者人数，提示aa基因型患lada的风险低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比。检测结果及spss软件分析结果如下表所示：携带rs1766gg基因型的人群，其患lada的风险显著升高，比值比or＝6.598，是aa基因型的6.598倍；ag基因型的比值比or＝1.944，是aa基因型风险的1.944倍，且p值均小于0.05，具有显著性差异。表4lada患者和正常对照的rs1766基因型频率比较注：or:比值比；95％ci:95％置信区间，*代表显著性差异。实施例4用测序法检测hlaii类基因的rs1766位点。挑选503名t1dm患者及504名t2dm患者进行测序判断rs1766的基因型。t1dm患者共503例，男性267例，女性236例，年龄为21(11-34)岁，t2dm患者共504例，男性258例，女性246例，年龄为52(44-60)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。t1dm患者纳入标准：纳入标准：①符合who于1999年制定的糖尿病诊断标准；②急性起病，且起病半年之内无明显诱因出现糖尿病酮症或有糖尿病酮症酸中毒倾向；③诊断半年内即依赖胰岛素治疗；④血清中至少一种胰岛自身抗体阳性：gada、ia-2a或者znt8a。排除标准：①继发性糖尿病；②妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病；③合并有其他类型的自身免疫性疾病；④合并有恶性肿瘤。t2dm患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②自起病以来不依赖胰岛素治疗，胰岛自身抗体为阴性。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。一、实验方法扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca；r：ttttcatgtgcttctcttgagc；测序引物为：ttttcatgtgcttctcttgagc。扩增的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的产物送至北京擎科生物有限公司进行测序。用lasergene软件进行分析。二、hlaii类基因rs1766位点基因型的检测结果示意图见图6。三、hlaii类基因rs1766基因型和t1dm以及t2dm易感的关联分析hlaii类基因rs1766在t1dm患者和t2dm中分布的比较采用卡方检验，用spss软件进行统计分析，由于携带rs1766aa基因型的人群中t2dm患者人数远高于t1dm患者人数，提示aa基因型患t1dm而不是t2dm的概率低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比；检测结果及spss软件分析结果如下表5所示：携带rs1766gg基因型的人群，其患t1dm而不是t2dm的概率显著升高，比值比or为9.604,是aa基因型患t1dm而不是t2dm的概率的9.604倍，且p值小于0.05，具有显著性差异。但ag基因型比值比or为1.602，p值大于0.05，差异不显著。表5t1dm患者和t2dm的rs1766基因型频率比较注：or:比值比；95％ci:95％置信区间，*代表显著性差异。实施例5用测序法检测hlaii类基因的rs1766位点。挑选491名lada患者及504名t2dm患者进行测序判断rs1766的基因型。lada患者共491例，男性289例，女性202例，年龄为49(38-58)岁。t2dm患者共504例，男性258例，女性246例，年龄为52(44-60)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。lada患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②一种或多种胰岛自身抗体阳性：抗体检测采用放射配体法，阳性判定标准为：405例健康人抗体指数的第99百分位点作为阳性判断阈值：gada≥0.05、ia-2a≥0.0078、znt8a≥0.011；③确诊糖尿病后6个月内不依赖胰岛素治疗；④年龄≥18岁。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。t2dm患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②自起病以来不依赖胰岛素治疗，胰岛自身抗体为阴性。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。一、实验方法扩增引物序列为：f：ggtcatctcctttcatcccca；r：ttttcatgtgcttctcttgagc；测序引物为：ttttcatgtgcttctcttgagc。扩增的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的产物送至北京擎科生物有限公司进行测序。用lasergene软件进行分析。二、hlaii类基因rs1766位点基因型的检测结果示意图见图7三、hlaii类基因rs1766基因型和lada以及t2dm易感的关联分析hlaii类基因rs1766在lada患者和t2dm中分布的比较采用卡方检验，用spss软件进行统计分析，由于携带rs1766aa基因型的人群中t2dm患者人数远高于lada患者人数，提示aa基因型患lada而不是t2dm的概率低，另外两种基因型gg和ag均以aa基因型为参比。检测结果及spss软件分析结果如下表6所示：携带rs1766gg基因型的人群，其患lada而不是t2dm的概率显著升高，比值比or为3.048，是aa基因型患lada而不是t2dm的概率的3.048倍，且p值均小于0.05，具有显著性差异。但ag基因型比值比or为1.316，p值大于0.05，差异不显著。表6lada患者和t2dm的rs1766基因型频率比较注：or:比值比；95％ci:95％置信区间，*代表显著性差异。序列表<110>中南大学湘雅二医院<120>检测rs1766位点多态性的试剂及其应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggtcatctcctttcatcccca21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttttcatgtgcttctcttgagc22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttttcatgtgcttctcttgagc22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtgatttcctgcctctgctc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aattcccaactgcctgtgtc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gtgatttcctgcctctgctc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gatttcctgcctctgctcaa20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aattcccaactgcctgtgtc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gatttcctgcctctgctcaa20当前第1页12