同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法与流程

本发明涉及体外分子检测的技术领域，尤其是涉及一种同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。

背景技术：

柯萨奇病毒(coxsachievirus)是一种肠病毒，以血清学分析依据分为a和b两型，其中a型包含24种亚型，b型包含5种不同亚型。柯萨奇病毒a型感染表现为上呼吸道感染起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发热，全身不适；柯萨奇病毒b型感染引起特征性传染性胸肋痛，可合并脑膜脑炎、心肌炎、发热、肝炎、溶血性贫血和肺炎。

目前，在体外核酸检测技术领域中，实时荧光定量pcr技术作为国内外应用最为广泛的技术方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色taq-man荧光探针，结合相关荧光检测系统仪器，从而达到检测的目的。而在体外病毒rna的核酸检测方法中，主要包括一步法rt-pcr法，荧光染料rt-pcr法和荧光探针rt-pcr法，其中一步法rt-pcr法由于需要进行开盖电泳，容易导致实验室污染，不宜大范围使用；而荧光染料rt-pcr法由于其荧光显色原理导致其易出现假阳性结果，因此也不适合临床检测。荧光探针rt-pcr法由于其特异性高、灵敏度高等优势，目前是应用最为广泛的技术。

上述中的现有技术方案存在以下缺陷：现有的大多数检测试剂盒主要以单重单靶标检测技术为主，每一次操作仅能检测出一种病毒亚型，无法实现同时对多亚型病原体的分型检测，出于临床考虑，需要实现多靶标检测，以完成临床上对柯萨奇病毒的快速分型检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，从而能在一次反应中同时对柯萨奇病毒的四种b组亚型进行分型检测，以完成临床需求。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，包括以下引物和探针序列：

cb2上游引物序列caccaaagagaagaagtttgcseqidno：1；

cb2下游引物序列cgtgaacagttctaacttcctcseqidno：2；

cb2探针序列cagcttgcctaacactcaccttccatgseqidno：3；

cb3上游引物序列tgctgagtgggtgataacaseqidno：4；

cb3下游引物序列agctccaaatcaaacctcatatacseqidno：5；

cb3探针序列ttcttcgcagttgtaccgcctggcseqidno：6；

cb4上游引物序列ttcgttgtgacatggaactgseqidno：7；

cb4下游引物序列attatttgatgtgtctggaccgseqidno：8；

cb4探针序列tcaagagatgtccaccgccaccaactseqidno：9；

cb5上游引物序列tgggtgatcaataccagacaseqidno：10；

cb5下游引物序列ggactgttcttgtgtacttgttaseqidno：11；

cb5探针序列cgcaactacgccgcaagctggaseqidno：12。

通过采用上述技术方案，本发明设计了不同的荧光标记taq-man探针，并同时设计筛选除了最佳的引物与探针组合，从而减小了不同的引物探针组合之间因相互抑制、竞争等原因而出现交叉扩增的可能性，提高了检测的灵敏度与特异性，进而本发明中的核酸组合物能够对样本中柯萨奇病毒的b2型、b3型、b4型和b5型进行快速筛查，能在一次反应中同时对柯萨奇病毒的四种b组亚型进行分型检测，达到临床需求。

本发明的另一目的在于：提供一种同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，包括上述核酸组合物、dntps、rt-pcrbuffer、酶液和ddh2o。

通过采用上述技术方案，可以利用试剂盒对四种b组柯萨奇病毒亚型进行快速分型检测，从而方便了检测工作进行的同时提高了检测工作的效率，且具有实验结果准确，特异性好，重复性好及操作简便的优点。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述rt-pcrbuffer为10×rt-pcrbuffer，所述rt-pcrbuffer包括400mm的tris-base，0.5%的tritonx-100，80mm的mgcl2，5%甘油。

通过采用上述技术方案，rt-pcrbuffer能在pcr反应体系中起到缓冲作用，从而能为试剂盒中的酶液提供一个最适合酶催化反应的环境。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述dntps包括datp、dctp、dgtp、dutp。

通过采用上述技术方案，datp、dctp、dgtp、dutp这几种核苷酸,将以碱基互补原则,在酶的作用下与上游引物和下游引物进行连接,从而完成rt-pcr的扩增。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述酶液包括逆转录酶m-mlv、热启动化学修饰taqdna聚合酶、rna酶抑制剂以及udg酶。

通过采用上述技术方案，逆转录酶m-mlv为点突变去除了rnaseh的活性中心的逆转录酶，使得rnaseh的活性降低，从而减少了逆转录反应中rna的降解，提高了cdna第一链的得率，进而更容易获得全长cdna。热启动化学修饰taqdna聚合酶可以抑制或将pcr反应中的非特异性dna扩增最小化，而且激活时间更短，活性时间更长，短时间内就可以恢复5’-3’聚合酶活性和5’外切酶活性。rna酶抑制剂能够抑制作为模板的rna的降解，提高cdna第一链的得率，而udg酶则会对cdna中的碱基对进行检查，从而减少cdna中碱基对出现配对错误的可能性，进而提高了探针的识别率。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述逆转录酶m-mlv、热启动化学修饰taqdna聚合酶、rna酶抑制剂以及udg酶的比例为1：4：2：3。

本发明的另一目的在于：提供一种同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的方法，采用荧光探针rt-pcr法，荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl；

10×rt-pcrbuffer2.5μl；

50pmol/μlcb2上游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb2下游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb3上游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb3下游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb4上游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb4下游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb5上游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb5下游引物0.1-0.2μl；

50pmol/μlcb2探针0.03-0.08μl；

50pmol/μlcb3探针0.1-0.15μl；

50pmol/μlcb4探针0.05-0.1μl；

50pmol/μlcb5探针0.1-0.15μl；

酶液0.5-1.5μl；

核酸样本0.5~5μl；

ddh2o补至25μl。

通过采用上述技术方案，本发明构建了一种多重荧光pcr反应体系，且同时对体系中每一个成分的加入量进行了优化，进而保障了检测结果的准确性和重复性。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl；

10×rt-pcrbuffer2.5μl；

50pmol/μlcb2上游引物0.1μl；

50pmol/μlcb2下游引物0.1μl；

50pmol/μlcb3上游引物0.2μl；

50pmol/μlcb3下游引物0.2μl；

50pmol/μlcb4上游引物0.1μl；

50pmol/μlcb4下游引物0.1μl；

50pmol/μlcb5上游引物0.2μl；

50pmol/μlcb5下游引物0.2μl；

50pmol/μlcb2探针0.05μl；

50pmol/μlcb3探针0.12μl；

50pmol/μlcb4探针0.08μl；

50pmol/μlcb5探针0.12μl；

酶液1μl；

核酸样本0.5~5μl；

ddh2o补至25μl。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：荧光定量pcr反应程序为：42-50℃逆转录10-30min，1个循环；93~95℃预变性5~15min，1个循环；93~95℃变性10~20s，；55~60℃退火、延伸、信号采集30~60s；循环40~45次。

通过采用上述技术方案，本发明进一步确定了多重荧光pcr的反应程序，从而能对柯萨奇病毒的b2，b3，b4和b5亚型进行监测，且可同时作为一种技术储备，也可作为技术平台开发其他亚型的检测，以备未来所需。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：pcr扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。

综上所述，依据本发明可以得到以下至少一种的有益技术效果：

1.本发明中设计的探针组合，减小了不同的引物探针组合之间因相互抑制，竞争等原因而出现交叉扩增的可能性，提高了检测的灵敏度与特异性；

2.通过设定相应的rt-pcr反应体系，实现了对柯萨奇病毒b2、b3、b4和b5四种亚型的快速分型检测，完成了临床上对柯萨奇病毒b2、b3、b4和b5四种亚型的快速筛查。

附图说明

图1是柯萨奇病毒b2型/b3型/b4型/b5型的四重荧光定量pcr试剂盒核酸样本10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；

图2是柯萨奇病毒b2型的fam通道定量标准曲线图；

图3是柯萨奇病毒b3型的vic通道定量标准曲线图；

图4是柯萨奇病毒b4型的texasred通道定量标准曲线图；

图5是柯萨奇病毒b5型的cy5通道定量标准曲线图；

图6对照组1阳性参考品扩增曲线结果图；

图7对照组2阳性参考品扩增曲线结果图；

图8是本发明方法对阳性参考品和阴性参考品的扩增结果图；

图9是本发明方法对17例样本的扩增检测结果图；

图10是最佳实施例cb2精密性扩增结果图；

图11是最佳实施例cb3精密性扩增结果图；

图12是最佳实施例cb4精密性扩增结果图；

图13是最佳实施例cb5精密性扩增结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明中的柯萨奇b2型、b3型、b4型和b5型病毒及17个样本均来源于深圳市龙华区疾控中心；

提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)；体外转录试剂盒购自thermoscientifictranscriptaidt7highyieldtranscriptionkit#k0441；

本发明的探针和引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

本发明用于检测柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的四重荧光定量pcr仪包括但不限于：abi系列、bio-rad系列（icycler/mjopticon2）、stratagenemx系列、rochelightcycler、ccpheidsmartcycler、corbettrortor-gene、杭州博日系列。

1、靶基因筛选

分别选择柯萨奇病毒b2型，b3型，b4型，b5型特异性基因作为检测靶基因。

2、引物探针设计

本发明根据柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的核苷酸序列，分别设计了大量用于检测柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的四重荧光定量pcr的引物和探针。经过大量筛选后，挑选出一组灵敏度高和特异性强的引物和探针，序列如下：

cb2引物和探针

cb2fcaccaaagagaagaagtttgcseqidno：1

cb2rcgtgaacagttctaacttcctcseqidno：2

cb2pcagcttgcctaacactcaccttccatgseqidno：3

cb2质粒：

ccaccaaagagaagaagtttgccacatggaaggtgagtgttaggcaagctgcgcaactgaggaggaagttagaactgttcacgseqidno：13

cb3引物和探针

cb3ftgctgagtgggtgataacaseqidno：4

cb3ragctccaaatcaaacctcatatacseqidno：5

cb3pttcttcgcagttgtaccgcctggcseqidno：6

cb3质粒：

tgctgagtgggtgataacaactcgccaggcggtacaactgcgaagaaagttggagtttttcacgtatatgaggtttgatttggagctseqidno：14

cb4引物和探针

cb4fttcgttgtgacatggaactgseqidno：7

cb4rattatttgatgtgtctggaccgseqidno：8

cb4ptcaagagatgtccaccgccaccaactseqidno：9

cb4质粒：

ttcgttgtgacatggaactgacattcgtcattactagtcatcaagagatgtccaccgccaccaactctgatgtcccggtccagacacatcaaataatseqidno：15

cb5引物和探针

cb5ftgggtgatcaataccagacaseqidno：10

cb5rggactgttcttgtgtacttgttaseqidno：11

cb5pcgcaactacgccgcaagctggaseqidno：12

cb5质粒：

tgggtgatcaataccagacaggtcgcgcaactacgccgcaagctggaaatgttcacatacgccaggtttgatttggaactcacctttgtgataacaagtacacaagaacagtccseqidno：16

3、质粒制备

为了绘制四重荧光定量pcr的标准曲线，分别提取柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的rna核酸作为逆转录pcr模板，分别用相应扩增引物将对应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入puc57-kan载体中，分别获得含柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的靶基因序列的质粒，然后将质粒进行体外转录获得相应rna，即柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型核酸样本。

将上述柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的核酸样本进行10倍梯度稀释作为标准品来检测定量范围，并确定其灵敏度。pcr检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述的柯萨奇病毒b2/b3/b4/b5型基因探针上标记的荧光信号不相同。本发明选用了fam、vic、texasred和cy5荧光基团标记，但是本发明要求的权利不仅限于这4种固定荧光标记

在10¹～10⁶copies/ml范围内4种标准曲线均呈现良好的线性关系，检测灵敏度可达200copies/ml。

4.阳性标准品的四重荧光定量pcr检测

在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品分别进行扩增。

实施例1

荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl

10×rt-pcrbuffer2.5μl

50pmol/μl引物cvb2-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb2-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb3-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb3-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb4-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb4-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb5-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb5-r10.1μl

50pmol/μl探针cvb2-p10.03μl

50pmol/μl探针cvb3-p10.1μl

50pmol/μl探针cvb4-p10.05μl

50pmol/μl探针cvb5-p10.11μl

酶液0.5μl

阳性标准品5μl

ddh2o补至25μl

pcr扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。

实施例2

荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl

10×rt-pcrbuffer2.5μl

50pmol/μl引物cvb2-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb2-r10.2μl

50pmol/μl引物cvb3-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb3-r10.2μl

50pmol/μl引物cvb4-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb4-r10.2μl

50pmol/μl引物cvb5-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb5-r10.2μl

50pmol/μl探针cvb2-p10.08μl

50pmol/μl探针cvb3-p10.15μl

50pmol/μl探针cvb4-p10.1μl

50pmol/μl探针cvb5-p10.15μl

酶液1.5μl

阳性标准品0.5μl

ddh2o补至25μl

pcr扩增反应程序为：50℃逆转录10min；95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃退火、延伸、信号采集30s；循环45次

实施例3

荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl

10×rt-pcrbuffer2.5μl

50pmol/μl引物cvb2-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb2-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb3-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb3-r10.2μl

50pmol/μl引物cvb4-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb4-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb5-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb5-r10.2μl

50pmol/μl探针cvb2-p10.05μl

50pmol/μl探针cvb3-p10.12μl

50pmol/μl探针cvb4-p10.08μl

50pmol/μl探针cvb5-p10.12μl

酶液1μl

阳性标准品0.5~5μl

ddh2o补至25μl

pcr扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。

将核酸样本分别采用实施例1-3中的荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序进行扩增，实验结果表明，实施例1-3的荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序均能扩增出目的条带。图1-5为本发明筛选出的最优荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序的实验结果图。

检测结果如图1~5所示，图1为柯萨奇病毒b2\b3\b4和b5型核酸样本10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；图2为柯萨奇病毒b2型的fam通道核酸样本的梯度曲线图，图3为柯萨奇病毒b3型的vic通道核酸样本的梯度曲线图，图4为柯萨奇病毒b4型的texasred通道核酸样本的梯度曲线图,图5为柯萨奇病毒b5型的cy5通道核酸样本的梯度曲线图。从图中可以看出，在10¹～10⁶copies/ml范围内4种标准曲线均呈现良好的线性关系，检测灵敏度最低可达200copies/mll（图中由于10¹浓度太低，试剂盒检测灵敏度达不到，未在图中显示）。

上述结果说明，本发明含有柯萨奇病毒b2\b3\b4和b5型的特异性引物和taqman基因探针，在反应体系中含有柯萨奇病毒b2\b3\b4和b5型基因模板的情况下，可以实现rt-pcr反应，并释放荧光信号。利用荧光定量pcr仪器对pcr过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

5.选用其它引物和探针组合对核酸样本的四重荧光定量pcr检测

对比例1

选用柯萨奇病毒b4型引物cvb4-f2替换实施例3中的引物cvb4-f1进行反应，cvb4-f2的核苷酸序列如下：

cvb4-f2gatccaccatcaacttcaccseqidno：17

荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序等其它参数与实施例3相同

对比例2

选用柯萨奇病毒b3型引物cvb3-p2替换实施例3中的引物cvb3-p1进行反应，cvb3-p2的核苷酸序列如下：

cvb3-p2atcgctgtatccacatgcttccgctseqidno：18

荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序等其它参数与实施例3相同

实验结果如图6、图7所示，对比例1中的cvb4-f2组合会导致cb2和cb4通道出现非特异扩增，存在明显的柯萨奇病毒b4型的假阳性扩增；cvb3-p2组合会导致线性倾斜，柯萨奇病毒cb5通道出现明显扩增延后，同时导致灵敏度降低

6.样本检测

样本核酸提取：待提样品17例，包括5例阳性样本:2例cb2，1例cb3，1例cb4，1例cb5和12例阴性样本:2例ca2，1例ca4,2例ca5,1例ca8，2例ca6，2例ca10,2例ca16。

以提取的核酸为模板进行四重荧光定量pcr扩增。

其中，荧光定量pcr扩增反应体系为：

2.5mm/mldntps2μl

10×rt-pcrbuffer2.5μl

50pmol/μl引物cvb2-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb2-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb3-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb3-r10.2μl

50pmol/μl引物cvb4-f10.1μl

50pmol/μl引物cvb4-r10.1μl

50pmol/μl引物cvb5-f10.2μl

50pmol/μl引物cvb5-r10.2μl

50pmol/μl探针cvb2-p10.05μl

50pmol/μl探针cvb3-p10.12μl

50pmol/μl探针cvb4-p10.08μl

50pmol/μl探针cvb5-p10.12μl

酶液1μl

核酸样本0.5~5μl

ddh2o补至25μl

pcr扩增反应程序为：50℃逆转录15min；95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火、延伸、信号采集40s；循环40次。

同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型基因组的生理盐水溶液。阳性对照组为同时含有柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型和柯萨奇病毒b5型基因组的混合核酸样本的溶液，该混合核酸样本为各单一标准品106浓度按照等体积混合而成。

通过荧光扩增曲线图ct值的大小来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型。当扩增曲线图ct值≤38,并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图ct值>38或无ct值,结果表现为阴性；因此，为了在判断阴阳性时具有参照，检测样本时需要给柯萨奇病毒b2型、柯萨奇病毒b3型、柯萨奇病毒b4型、柯萨奇病毒b5型的四重荧光定量pcr检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。

检测结果如图8~9所示，其中图8为阳性对照和阴性对照扩增结果图；图9为阴、阳对照组和检测样本的扩增结果，其中检出，2例cb2，1例cb3，1例cb4，1例cb5和6例，其余阴性样本2例ca2，1例ca4,2例ca5,1例ca8，2例ca6，2例ca10,2例ca16全部为阴性，检测结果符合预期，准确率达100%。

7.精密性阳性参考品的四重荧光定量pcr检测

本发明的精密性阳性参考品的制备方法与核酸样本相同，精密性阳性参考品由混合核酸样本稀释获得。精密性阳性参考品的浓度为2.5×10⁵copies/ml。

选择实施例3的荧光定量pcr扩增反应体系和pcr扩增反应程序，检测精密性阳性参考品各10个复孔，实验结果如图10~13所示，结果表明各通道精密性均小于3％

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市艾伟迪生物科技有限公司

<120>同时检测四种b组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法

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