一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法及应用。

背景技术：

心血管疾病是影响我国人口健康的重大致死疾病之一，其根本原因在于成年哺乳动物无法修复与再生受损的心肌组织。热带爪蛙(xenopustropicalis)是爪蛙属中唯一具有真正二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有个体小、发育快、体外受精、繁殖量大、培育费用低、早期胚胎透明等特点。而且，热带爪蛙蝌蚪阶段的尾巴、神经系统及变态期的肢体均能进行有效的修复与再生，已经发展成为再生医学领域的理想模式动物。最新研究进展表明，成体热带爪蛙的心尖组织用外科手术方法切除后，损伤的心肌组织能够有效的进行自我修复与再生(liaoetal.,heartregenerationinadultxenopustropicalisafterapicalresection.cellbiosci.2017,7:70)，进而提示我们：成体热带爪蛙的心脏具有很强的再生能力。因此，热带爪蛙模式动物可为心脏修复与再生的机制研究、药物筛选及干预疗法建立提供良好的模型与研究思路，已经成为再生医学领域的研究热点与前沿。

目前，基于上述动物模型开展的心脏修复与再生领域的研究主要利用外科手术造模的方法：即开胸后，对心尖组织进行切除，进而建立心肌损伤模型，并用于研究心肌修复与再生的作用机制、药物筛选及再生疗法建立等。然而，这种通过开胸暴露心脏组织，并手术切除心尖等部位的心肌损伤模型的造模方法仍然存在严重不足：1)手术建模对动物个体本身将造成严重的创伤；2)伤口感染不易控制，容易引起动物死亡；3)切除心尖组织的大小难以标准化；4)对手术人员的技术要求较高；5)手术造模的重复性难以控制等。上述不利因素将对造模的成功率、动物存活率及实验结果产生重要的不利影响。而且，利用上述手术方法对野生型模式动物造模后，对于再生的心肌组织的细胞来源也难以进行精确的分析，仍然需要借助于额外的用于研究细胞命运示踪的遗传修饰品系等手段才能实现。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法，包括如下步骤：

(1)克隆热带爪蛙心肌特异性基因mlc2的启动子序列；

(2)以热带爪蛙为宿主，对ntr基因和dendra2基因的编码序列进行密码子优化(optimizing,opt)，合成密码子优化后的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框；

(3)将步骤(1)中mlc2的启动子序列克隆到pbs-iscei载体的xhoi与ecori酶切位点之间，再将步骤(2)的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框及sv40polya(pa)终止信号序列(ntr-t2a-dendra2opt-pa)克隆到mlc2的启动子下游的ecori与noti酶切位点之间，得到靶基因密码子优化后的转基因载体(pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt)；

(4)将步骤(3)的转基因载体与i-scei归位内切酶共同注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选心脏特异性表达绿色荧光的f0胚胎，培养至成蛙；

(5)将步骤(4)的成蛙与野生型杂交，筛选具有生殖传递能力的f1代胚胎，培养至成蛙，鉴定，得到热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系(mlc2-ntr-t2a-dendra2opt)。

步骤(1)中所述的mlc2的启动子序列为mlc2基因tss上游3.1kb大小的dna片段。

所述的mlc2的启动子序列的扩增引物如下：

mlc2-f(xhoi)：

5’-ccctcgagatctgggaatgcgtaaagatgctcctac-3’；

mlc2-r(ecori)：

5’-cggaattcgcagaggaactctgaggccactctgatc-3’。

上述扩增引物中的下划线及5’端碱基为额外加入的酶切位点序列及其保护碱基。

步骤(2)中所述的密码子优化后的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框dna序列如下所示：

上述序列中下划线是指经密码子优化后的ntr编码区，小写字母是指经密码子优化后的t2a连接肽编码区，方框内的序列是指经密码子优化后的dendra2编码区。

步骤(3)中所述的转基因载体中ecori酶切位点与ntr起始密码子之间添加gccacc碱基序列；dendra2与pa之间加入hpai酶切位点。

步骤(4)中所述的转基因载体与i-scei归位内切酶的注射方式为：200ng转基因载体和20ui-scei归位内切酶以无菌水配置成10μl的注射液，每个受精卵注射2nl。

步骤(4)中所述的共同注射热带爪蛙受精卵为注射入1细胞期受精卵的动物极。

步骤(4)中所述的孵育为孵育胚胎至45期(st45)。

步骤(4)和(5)中所述的筛选采用荧光体式显微镜。

步骤(5)中所述的具有生殖传递能力的f1代转基因胚胎为心脏特异性表达dnendra2绿色荧光的胚胎。

步骤(5)中所述的鉴定为利用原位杂交技术检测f1代的蝌蚪中转基因的表达模式，并在f1代的热带爪蛙成体心脏组织中检测转基因的表达与功能。

上述热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法在筛选促进心肌修复与再生的药物或疗法中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用热带爪蛙心肌细胞特异性启动子mlc2及密码子优化技术，成功构建了热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系mlc2-ntr-t2a-dendra2opt，该品系不但可以特异性地标记或删除心肌细胞，而且可利用uv照射及dendra2蛋白的荧光转换特性，对心肌损伤后再生的心肌细胞进行标记与示踪。同时，该品系可用于高通量筛选，为筛选有效促进心肌修复与再生的药物及疗法提供了有力的模型工具。

附图说明

图1是ntr-t2a-dendra2融合基因的结构及其密码子优化情况检测结果图；其中，a为ntr-t2a-dendra2融合基因编码框的结构图；b为以热带爪蛙为表达宿主对融合基因进行密码子优化的结果。

图2是pbs-iscei载体的图谱。

图3是靶基因密码子优化后的转基因载体pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt的图谱。

图4是发育至st28期和st38期的f1代转基因品系阳性蝌蚪的原位杂交检测结果图。

图5是发育至st45期的f1代转基因品系阳性蝌蚪的原位杂交及荧光成像检测结果图；其中，a为野生型及转基因品系爪蛙胚胎中dnedra2基因的原位杂交检测结果(myh6探针用作阳性对照)；b为野生型及转基因爪蛙胚胎中dendra2蛋白的荧光成像检测结果；c为野生型及转基因品系爪蛙胚胎用mtz(1mm)连续诱导7天后的存活率及死亡率统计结果。

图6是f1代成体热带爪蛙的表型验证结果图；其中，a为野生型及转基因品系热带爪蛙的形态学比较；b为野生型及转基因品系热带爪蛙心脏组织中dendra2蛋白的荧光成像检测结果；c为dendra2蛋白的荧光转换检测结果。

图7是优化前(野生型，wt)的ntr-t2a-dendra2编码框在热带爪蛙中的功能验证结果图；其中，a为pmlc2-ntr-t2a-dendra2wt载体的结构图谱及基因型鉴定引物(f/r)设计示意图；b为f1代蝌蚪的基因型鉴定结果；c为f1代阳性蝌蚪心脏组织中dendra2蛋白的表达情况；d为f1代阳性蝌蚪用mtz(1mm)连续处理7天后，蝌蚪存活率及死亡率的统计结果。

图8是pcmv-ntr-t2a-dendra2wt载体在哺乳动物细胞中的表达情况检测结果图；其中，a为pcmv-ntr-t2a-dendra2wt载体的结构图谱；b为pcmv-ntr-t2a-dendra2wt载体转染293t细胞24小时，并用mtz药物诱导24小时后进行细胞活性检测的结果；c为pcmv-ntr-t2a-dendra2wt载体转染293t细胞，48小时后进行细胞荧光拍照的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt转基因载体的构建

(1)热带爪蛙mlc2基因启动子的克隆

利用genebank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)查找热带爪蛙mlc2基因(geneid:100135705)的序列与结构，设计pcr引物，以热带爪蛙基因组dna为模板，扩增mlc2基因tss上游3.1kb大小的dna片段作为靶基因的启动子序列。pcr产物由上海捷瑞生物工程有限公司进行dna测序验证。

pcr引物序列如下：

mlc2-f(xhoi)：5’-ccctcgagatctgggaatgcgtaaagatgctcctac-3’

mlc2-r(ecori)：5’-cggaattcgcagaggaactctgaggccactctgatc-3’。

其中，引物中的下划线及5’端碱基为额外加入的酶切位点序列及其保护碱基。

(2)ntr及dendra2基因编码序列的密码子优化及基因合成

以ntr基因(nc_000913.3)及dendra2基因(mk448012.1)的编码区dna为模板，以热带爪蛙为表达宿主，利用vectorbuilder在线软件(https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html)进行密码子优化(图1)，并合成密码子优化(opt)后的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框(其中，t2a连接肽同时进行热带爪蛙表达宿主的密码子优化)。经密码子优化后的融合基因交由上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成。经密码子优化后的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框dna序列(seqidno.1)如下所示：

其中，下划线是指经密码子优化后的ntr编码区，小写字母是指经密码子优化后的t2a编码区，方框内的序列是指经密码子优化后的dendra2编码区。

(3)转基因载体pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt的构建与鉴定

以pbluescriptiiks(-)载体(genbank：x52330.1)为模板，在其多克隆位点(mcs)上游及下游分别插入正向(5’-tagggataacagggtaat-3’)及反向(5’-attaccctgttatcccta-3’)的i-scei归位内切酶的识别位点,合成新载体pbs-iscei(图2)。然后以pbs-iscei载体为模板，首先将步骤(1)的mlc2启动子亚克隆到pbs-iscei载体的xhoi与ecori酶切位点之间，并将步骤(2)经过密码子优化的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框dna序列及sv40polya(pa)终止信号序列(ntr-t2a-dendra2opt-pa)亚克隆到mlc2启动子下游的ecori与noti酶切位点之间，进而构建pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt转基因载体(图3)。其中，转基因载体中ecori酶切位点与ntr起始密码子之间添加gccacc碱基序列；dendra2与pa之间添加hpai酶切位点。

实施例2：转基因品系的构建

(1)胚胎显微注射及阳性胚胎筛选

将实施例1构建成功的pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt转基因载体与i-scei归位内切酶共同注射(将200ng转基因载体与20u的iscei核酸酶(neb)用无菌水配置成10μl的注射液，每个受精卵注射2nl)到热带爪蛙受精卵(1细胞期)的动物极，注射后的受精卵放置于0.1×mbs胚胎培养液(由5×mbs(配置方法：称取nacl25.9g、hepes11.9g、nahco31.0g、kcl0.4g、mgso40.5g、ca(no3)20.8g、cacl20.2g，加入800ml去离子水并混匀，ph调至7.4，容量瓶定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存备用)稀释而成)中，并在21℃的培养箱中孵育过夜，于第二天早上将培养箱温度调至25℃继续孵育胚胎发育至st45期，利用荧光体式显微镜筛选心脏特异性表达绿色荧光(dendra2)的f0胚胎，并培养至成蛙。

(2)生殖传递能力检测

将心脏特异性表达绿色荧光的f0代胚胎继续饲养至性成熟，然后再与野生型爪蛙交配，利用荧光体式显微镜筛选具有生殖传递能力(心脏特异性表达dnendra2绿色荧光)的f1代转基因胚胎，并饲养至性成熟，获得阳性的f1代转基因品系。

实施例3转基因品系的表型鉴定

(1)f1代转基因品系蝌蚪的鉴定

选取实施例2获得的f1代转基因品系蝌蚪及野生型蝌蚪，利用胚胎原位杂交技术对心脏特异性表达的myh6基因(阳性对照)及转基因ntr与dendra2进行检测，用以比较及判定转基因的心脏特异性表达模式(图4)。

1)热带爪蛙myh6基因mrna探针的制备按以下方法进行：

利用trizol(molecularresearchcenterinc.,usa)提取热带爪蛙心脏组织的总rna，并利用revertraqpcrrtkit(toyobo,japan)合成cdna。设计带有酶切位点的pcr引物扩增myh6基因cds编码区的778bp片段，并克隆到pcs2+载体的ecori与xbai酶切位点之间，进而将目标片段反向插入到pcs2+载体中。利用digrnalabelingkit(sp6/t7)(roche,usa)试剂盒体外转录合成dig标记的反义rna探针。

其中，所用pcr引物如下：

myh6-f：5’-gctctagagcccagaaacatcaagggga-3’；

myh6-r：5’-cggaattcacccatgaaagcacggatgt-3’。

上述myh6-f引物中下划线序列(tctaga)是指xbai酶切位点，上述myh6-r引物中下划线序列(gaattc)是指ecori酶切位点。

2)ntr及dendra2基因mrna探针的制备按照以下方法进行：

以实施例1制备的pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt转基因载体为模板，设计带有酶切位点的pcr引物，分别扩增本发明中已进行密码子优化的ntr及dendra2的基因编码区，并克隆到pcs2+载体的bamhi与ecori酶切位点之间，进而将目标片段反向插入到pcs2+载体中，然后利用digrnalabelingkit(sp6/t7)(roche,usa)试剂盒体外转录合成dig标记的反义rna探针。

其中，所用pcr引物的序列如下所示：

ntr-f：5’-cggaattcatggatattatttctgtggc-3’；

ntr-r：5’-cgggatcccacttctgtcagtgtaatat-3’；

dendra2-f：5’-cggaattcatggcttctaatacaccagg-3’；

dendra2-r：5’-cgggatcccactcctgtagatccagaag-3’。

上述ntr-f及dendra2-f引物中下划线部分(gaattc)是指ecori酶切位点，上述ntr-r及dendra2-r引物中下划线部分(ggatcc)是指bamhi酶切位点。

3)爪蛙胚胎原位杂交检测按照以下方法进行：

利用上述合成的dig标记的反义rna探针及碱性磷酸酶标记的dig单克隆抗体(roche,usa)进行常规胚胎原位杂交实验，并利用nbt/bcip(roche,usa)对杂交信号进行显色，进而分析比较转基因ntr及dendra2在热带爪蛙胚胎中的空间表达模式。

4)转基因的表达与功能鉴定：

选择发育至st28期和st38期的转基因品系的蝌蚪，利用胚胎原位杂交技术检测靶基因ntr的时空表达模式(以心肌特异性表达基因myh6为阳性对照)。由图4可知，转基因ntr的时空表达模式与已知的心肌特异性表达基因myh6的时空表达模式一致，说明靶基因ntr能在心肌细胞中特异性表达。同时，选择发育至st45期的转基因品系的蝌蚪，利用胚胎原位杂交技术检测靶基因dendra2的时空表达模式(以心肌特异性表达基因myh6为阳性对照)。由图5a可知，转基因dendra2的时空表达模式与已知的心肌特异性表达基因myh6的时空表达模式一致；而且，胚胎荧光体视显微镜检测结果表明，转基因品系蝌蚪的心脏组织能特异性表达绿色荧光(dendra2)(图5b)。上述结果说明靶基因dendra2能在心肌细胞中特异性表达。

选取发育至st45期的野生型和转基因品系的蝌蚪，利用mtz(1mm)药物连续诱导7天，分别统计蝌蚪的存活率和死亡率。结果表明，经过mtz药物诱导后，转基因品系蝌蚪的死亡率接近50％，明显高于野生型蝌蚪，说明转基因品系蝌蚪心肌组织中表达的ntr能与mtz相互作用，产生细胞毒性并造成心肌细胞损伤或清除，从而导致蝌蚪死亡(图5c)。

(2)f1代转基因品系成蛙的鉴定

选取实施例2获得的f1代阳性成体热带爪蛙及野生型成体热带爪蛙，拍照(图6a)。将爪蛙麻醉后暴露心脏组织，然后利用荧光体式显微镜观察心脏组织的绿色荧光(dendra2)的表达情况；同时，利用uvled光源对心脏组织进行照射(心脏器官的uv照射条件：利用uvled点光源(405nm)照射20秒，间隔30秒，连续5个循环)，观察dendra2蛋白的荧光转换情况(dendra2蛋白正常情况下表达绿色荧光，但经uv照射后，将由绿色荧光转换成红色荧光)。

结果表明，f1代阳性转基因品系成体热带爪蛙心脏组织中能特异性表达绿色荧光(dendra2)，而野生型热带爪蛙心脏中并无荧光表达(图6b)；而经过uv照射后，转基因热带爪蛙心脏组织中的绿色荧光能有效转化为红色荧光，但野生型热带爪蛙心脏组织中uv照射前后均无任何荧光表达(图6c)。

对比例1优化前的ntr-t2a-dendra2wt编码框在热带爪蛙中无法有效表达

以实施例1所构建的pmlc2-ntr-t2a-dendra2opt转基因载体(图3)为模板，用ecori与hpai双酶切，去除密码子优化的ntr-t2a-dendra2opt表达框，回收载体框架备用。以野生型ntr基因(nc_000913.3)及dendra2基因(mk448012.1)的编码区dna为模板，由上海捷瑞生物工程有限公司直接合成未经过密码子优化的ntr-t2a-dendra2wt表达框(seqidno.2)，并将其克隆到上述回收的载体框架中，构建pmlc2-ntr-t2a-dendra2wt转基因载体(图7a)，注射热带爪蛙受精卵，构建转基因热带爪蛙(方法同实施例1)。利用genotyping鉴定稳定遗传的f1代热带爪蛙，并进行转基因的功能验证：(1)基因型鉴定为阳性(tg，图7b)的f1代蝌蚪发育到st45期后，利用全自动荧光体视显微镜检测心脏中dendra2蛋白的表达情况，结果表明：密码子优化前的dendra2基因在热带爪蛙中的表达水平极低(图7c)；(2)f1代阳性蝌蚪(st45期)用mtz(1mm)连续处理7天(每天更换一次培养液)，统计蝌蚪的死亡情况，结果表明：密码子优化前的ntr基因在热带爪蛙中无法通过mtz诱导而有效杀伤细胞，不能有效诱导蝌蚪死亡(图7d)。

基因型鉴定引物：

f：5’-ttgacgccgccatcctcgat-3’；

r：5’-gaacacccggttgccgtagt-3’。

对比例2优化前的ntr-t2a-dendra2wt编码框能在哺乳动物细胞(293t)中有效表达

以对比例1所构建pmlc2-ntr-t2a-dendra2wt载体(图7a)为模板，用xhoi与ecori双酶切，去除mlc2启动子，并将广谱性启动子cmv(seqidno.13)克隆到上述载体的xhoi与ecori酶切位点之间，进而构建pcmv-ntr-t2a-dendra2wt载体(图8a)。用该表达载体转染293t细胞(人肾上皮细胞，acs-4500^tm)，进行功能验证：(1)转染细胞24小时后，细胞中加入mtz药物进行诱导(50μm)，并于药物处理24小时后利用cck8试剂盒检测细胞活性，结果表明：优化前的ntr基因能在哺乳动物细胞中通过mtz诱导而有效杀伤细胞(图8b)；(2)细胞转染48小时后进行绿色荧光拍照，检测dendra2荧光蛋白的表达情况，结果表明：优化前的dendra2基因能在哺乳动物细胞中有效表达绿色荧光(图8c)；同时，利用蓝光激发细胞2分钟，然后检测红色荧光表达情况，用于判断dendra2蛋白的荧光转换情况，结果表明：蓝光激发后，dendra2蛋白能由绿色荧光转换为红色荧光(图8c)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法与应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1449

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>经密码子优化后的ntr-t2a-dendra2opt融合基因编码框dna序列

<400>1

atggatattatttctgtggctctgaagagacactctacaaaggcttttgatgcttctaag60

aagctgacaccagaacaggctgaacagattaagacactgctgcagtattctccatcttct120

acaaattctcagccatggcactttattgtggcttctacagaagaaggaaaggctagagtg180

gctaagtctgctgctggaaattatgtgtttaatgaaagaaagatgctggatgcttctcac240

gtggtggtgttttgcgctaagacagctatggatgatgtgtggctgaagctggtggtggat300

caggaagatgctgatggaagatttgctacaccagaagctaaggctgctaatgataaggga360

agaaagttttttgctgatatgcacagaaaggatctgcacgatgatgctgaatggatggct420

aagcaggtgtatctgaatgtgggaaattttctgctgggagtggctgctctgggactggat480

gctgtgccaattgaaggatttgatgctgctattctggatgctgaatttggactgaaggaa540

aagggatatacatctctggtggtggtgccagtgggacaccactctgtggaagattttaat600

gctacactgccaaagtctagactgccacagaatattacactgacagaagtggaaggaaga660

ggatctctgctgacatgcggagatgtggaagaaaatccaggaccaatggcttctaataca720

ccaggaattaatctgattaaggaagatatgagagtgaaggtgcacatggaaggaaatgtg780

aatggacacgcttttgtgattgaaggagaaggaaagggaaagccatatgaaggaacacag840

acagctaatctgacagtgaaggaaggagctccactgccattttcttatgatattctgaca900

acagctgtgcactatggaaatagagtgtttacaaagtatccagaagatattccagattat960

tttaagcagtcttttccagaaggatattcttgggaaagaacaatgacatttgaagataag1020

ggaatttgcacaattagatctgatatttctctggaaggagattgcttttttcagaatgtg1080

agatttaagggaacaaattttccaccaaatggaccagtgatgcagaagaagacactgaag1140

tgggaaccatctacagaaaagctgcacgtgagagatggactgctggtgggaaatattaat1200

atggctctgctgctggaaggaggaggacactatctgtgcgattttaagacaacatataag1260

gctaagaaggtggtgcagctgccagatgctcactttgtggatcacagaattgaaattctg1320

ggaaatgattctgattataataaggtgaagctgtatgaacacgctgtggctagatattct1380

ccactgccatctcaggtgtggtctggagattctggagtgtataaggcttctggatctaca1440

ggagtgtaa1449

<210>2

<211>1449

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>密码子优化前的ntr-t2a-dendra2编码框dna序列

<400>2

atggatatcatttctgtcgccttaaagcgtcattccactaaggcatttgatgccagcaaa60

aaacttaccccggaacaggccgagcagatcaaaacgctactgcaatacagcccatccagc120

accaactcccagccgtggcattttattgttgccagcacggaagaaggtaaagcgcgtgtt180

gccaaatccgctgccggtaattacgtgttcaacgagcgtaaaatgcttgatgcctcgcac240

gtcgtggtgttctgtgcaaaaaccgcgatggacgatgtctggctgaagctggttgttgac300

caggaagatgccgatggccgctttgccacgccggaagcgaaagccgcgaacgataaaggt360

cgcaagttcttcgctgatatgcaccgtaaagatctgcatgatgatgcagagtggatggca420

aaacaggtttatctcaacgtcggtaacttcctgctcggcgtggcggctctgggtctggac480

gcggtacccatcgaaggttttgacgccgccatcctcgatgcagaatttggtctgaaagag540

aaaggctacaccagtctggtggttgttccggtaggtcatcacagcgttgaagattttaac600

gctacgctgccgaaatctcgtctgccgcaaaacatcaccttaaccgaagtggagggcaga660

ggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggctagtaacacc720

ccgggaattaacctgatcaaggaggacatgcgcgtgaaggtgcacatggagggcaacgtg780

aacggccacgccttcgtgatcgagggcgagggcaagggcaagccctacgagggcacccag840

accgccaacctgaccgtgaaggagggcgcccccctgcccttcagctacgacatcctgacc900

accgccgtgcactacggcaaccgggtgttcaccaagtaccccgaggacatccccgactac960

ttcaagcagagcttccccgagggctacagctgggagcgcaccatgaccttcgaggacaag1020

ggcatctgcaccatccgcagcgacatcagcctggagggcgactgcttcttccagaacgtg1080

cgcttcaagggcaccaacttcccccccaacggccccgtgatgcagaagaagaccctgaag1140

tgggagcccagcaccgagaagctgcacgtgcgcgacggcctgctggtgggcaacatcaac1200

atggccctgctgctggagggcggcggccactacctgtgcgacttcaagaccacctacaag1260

gccaagaaggtggtgcagctgcccgacgcccacttcgtggaccaccgcatcgagatcctg1320

ggcaacgacagcgactacaacaaggtgaagctgtacgagcacgccgtggcccgctacagc1380

cccctgcccagccaggtgtggtccggcgacagcggcgtgtacaaggctagcggatccacc1440

ggtgtctaa1449

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>mlc2-f(xhoi)

<400>3

ccctcgagatctgggaatgcgtaaagatgctcctac36

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>mlc2-r(ecori)

<400>4

cggaattcgcagaggaactctgaggccactctgatc36

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>myh6-f

<400>5

gctctagagcccagaaacatcaagggga28

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>myh6-r

<400>6

cggaattcacccatgaaagcacggatgt28

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ntr-f

<400>7

cggaattcatggatattatttctgtggc28

<210>8

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ntr-r

<400>8

cgggatcccacttctgtcagtgtaatat28

<210>9

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>dendra2-f

<400>9

cggaattcatggcttctaatacaccagg28

<210>10

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>dendra2-r

<400>10

cgggatcccactcctgtagatccagaag28

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>基因型鉴定引物f

<400>11

ttgacgccgccatcctcgat20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>基因型鉴定引物r

<400>12

gaacacccggttgccgtagt20

<210>13

<211>532

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>cmv启动子的序列

<400>13

ccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgccc60

attgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacg120

tcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatat180

gccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgccca240

gtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat300

taccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacg360

gggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatca420

acgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcg480

tgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatc532