一株可降解单宁的植物乳杆菌及其应用

1.本发明涉及青贮饲料加工技术领域，具体涉及一株可降解单宁植物的乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.植物单宁是一种水溶性的酚类化合物，是植物在进化过程中形成的一种具有自我保护功能的次生代谢产物。单宁的多酚羟基化学结构及性质使其具有较强的抑菌和抗病毒作用，饲料中适量的单宁对畜禽是有益的，但是浓度过高会严重阻碍畜禽对营养物质的消化和利用。高浓度的单宁对动物生长和生产的负面影响主要是因为：植物缩合单宁可以与蛋白质、消化酶、生物碱、多糖和金属离子等结合或络合形成沉淀，降低动物机体对养分的消化吸收，降低适口性引起采食量低，对代谢产生不利影响并产生毒性。饲粮中缩合单宁大于50g
·
kg-1
dm或当牧草含60-120g
·
kg-1
dm时，畜禽采食量下降，瘤胃发酵受到抑制，显著降低了包括蛋白质在内的几乎所有养分消化率。水解单宁对动物的毒性更大，易引发反刍动物患急性疾病，与水解单宁毒性有关的疾病还有胃肠道出血、肝脏坏死、肾小管坏死等，大量采食水解单宁大于20％的植物不但会引起动物急性中毒还会致死。一般来说，不高于15g
·
kg-1
dm的单宁对猪和肉鸡生长无不良影响，牛耐受30-40g
·
kg-1
dm单宁；山羊耐受30g
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kg-1
dm以下的单宁；绵羊耐受48g
·
kg-1
dm以下的单宁。青贮饲料能够有效保存饲草原料中的营养物质，且不受天气影响，是饲料较为重要的贮藏方式。降解饲料单宁的方法，包括物理方法、化学方法、酶解法和微生物降解方法。其中，物理方法在青贮制作中较难实现，酶解法成本较高，化学聚乙二醇方法和微生物降解方法研究的较多，但其中聚乙二醇对动物的影响尚不明确。关于微生物降解的方法，前人研究的多是真菌，筛选的菌种不适用于青贮厌氧发酵。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何降低现有技术中青贮饲料的单宁含量而提高饲料的利用率或如何提高青贮饲料的青贮品质。
4.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一株植物乳杆菌。
5.本发明所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cav-m6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.17614。该菌株已于2019年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)。下文简称植物乳杆菌cav-m6。
6.植物乳杆菌cav-m6为革兰氏染色阳性杆菌，，葡萄糖同型发酵，耐酸性强(在ph3.0 可以正常生长)，生长速率高(mrs培养基培养24小时，od
620nm
》2.00)，产酸速度快(mrs培养基培养24小时，ph可降到4.0以下)，生育温域宽(5-50℃可正常生长)，在纯培养和青贮条件下高产乳酸。植物乳杆菌cav-m6的生理生化特征如表1所示，其碳源发酵实验如表2所示。植物乳杆菌cav-m6的16s rdna序列如seq id no.1所示。
7.植物乳杆菌cav-m6的培养物也属于本发明的保护范围。植物乳杆菌cav-m6的培养物是将植物乳杆菌cav-m6在微生物培养基中培养得到的物质(如含有植物乳杆菌 cav-m6和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有植物乳杆菌cav-m6和分泌到固体培养基内的物质)。
8.所述植物乳杆菌cav-m6是从黄梁木青贮饲料中分离得到的。所述植物乳杆菌 cav-m6含有单宁酶，菌株单宁酶酶活为4.85μmol/min
·
ml，可以快速降低青贮饲料的单宁含量。
9.植物乳杆菌cav-m6的下述a1-a5任意一种应用及a6-a7的产品也属于本发明的保护范围：
10.a1、植物乳杆菌cav-m6在提高青贮饲料青贮品质中的应用。
11.a2、植物乳杆菌cav-m6在降解单宁中的应用。
12.a3、植物乳杆菌cav-m6在制备青贮饲料中的应用。
13.a4、植物乳杆菌cav-m6在制备青贮饲料产品中的应用。
14.a5、植物乳杆菌cav-m6在制备青贮饲料添加剂产品中的应用。
15.a6、使用植物乳杆菌cav-m6制备的青贮饲料产品。
16.a7、含有植物乳杆菌cav-m6作为活性成分的青贮饲料添加剂产品。
17.为了解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。
18.本发明所提供的菌剂含有植物乳杆菌cav-m6或/和植物乳杆菌cav-m6的代谢物或 /和植物乳杆菌cav-m6的培养物。
19.上述菌剂的活性成分可为植物乳杆菌cav-m6或/和植物乳杆菌cav-m6的代谢物，上述菌剂的活性成分可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
20.所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，植物乳杆菌cav-m6或/和植物乳杆菌cav-m6的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
21.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
22.上文中，所述植物乳杆菌cav-m6的代谢物可为植物乳杆菌cav-m6的发酵液。植物乳杆菌cav-m6的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养植物乳杆菌cav-m6，收集发酵液(含有植物乳杆菌cav-m6和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为植物乳杆菌cav-m6的代谢物。
23.上文中，所述菌剂可为具有下述至少一种特性的菌剂：
24.1)降低青贮饲料水解单宁含量，
25.2)降低青贮饲料缩合单宁含量，
26.3)降低青贮饲料总单宁含量，
27.4)降低青贮饲料的ph值，
28.5)降低青贮饲料的氨态氮含量，
29.6)提高青贮饲料的乳酸含量，
30.7)提高青贮饲料的乳酸/乙酸比值，
31.8)降低青贮饲料的结合蛋白含量，
32.9)提高青贮饲料的真蛋白含量，
33.10)提高青贮饲料的体外粗蛋白消化率。
34.上文中，所述青贮饲料由青贮植物发酵而成。
35.本发明还提供了一种制备青贮饲料的方法。
36.本发明所提供的制备青贮饲料的方法包含使用所述的植物乳杆菌cav-m6、或植物乳杆菌cav-m6的培养物、或使用植物乳杆菌cav-m6制备的菌剂发酵青贮植物得到青贮饲料的步骤。
37.本文中，所述青贮植物可为下述任一种:
38.b1)木本植物，
39.b2)双子叶植物，
40.b3)茜草目植物，
41.b4)茜草科植物，
42.b5)团花属植物，
43.b6)黄梁木。
44.上述方法制备得到的青贮饲料(简称植物乳杆菌cav-m6发酵饲料)具有c1-c10 中的至少一种特性：
45.c1)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的水解单宁含量低于普通发酵青贮饲料的水解单宁含量，
46.c2)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的缩合单宁含量低于普通发酵青贮饲料的缩合单宁含量，
47.c3)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的总单宁含量低于普通发酵青贮饲料的总单宁含量，
48.c4)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的ph值低于普通发酵青贮饲料的ph值，
49.c5)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的氨态氮含量低于普通发酵青贮饲料的氨态氮含量，
50.c6)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的乳酸含量高于普通发酵青贮饲料的乳酸含量，
51.c7)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的乳酸/乙酸比值高于普通发酵青贮饲料的乳酸/ 乙酸比值，
52.c8)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的结合蛋白含量低于普通发酵青贮饲料的结合蛋白含量，
53.c9)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的真蛋白含量高于普通发酵青贮饲料的真蛋白含量，
54.c10)植物乳杆菌cav-m6发酵饲料的体外粗蛋白消化率高于普通发酵青贮饲料的体外粗蛋白消化率。
55.其中，所述普通发酵青贮饲料为经过如下方法制备的饲料：除不加所述植物乳杆菌、或所述培养物、或所述菌剂外，其它条件(青贮植物和发酵条件)均与上述方法相同。
56.上述方法中，所述发酵可为在15-45℃，厌氧发酵40-60天。
57.本发明还提供培养所述植物乳杆菌cav-m6的方法，该方法包括将所述植物乳杆菌 cav-m6在培养基上培养的步骤。
58.本发明从黄梁木中分离筛选得到了高产乳酸、耐酸并生长速度快的植物乳杆菌 cav-m6，并添加至青贮材料中进行发酵。实验证明，黄梁木原料在经过植物乳杆菌 cav-m6发酵后，水解单宁、缩合单宁和总单宁含量均显著降低，青贮饲料ph值及氨态氮含量均显著下降，结合蛋白含量显著降低而真蛋白含量显著增加，体外粗蛋白消化率显著提高。经过植物乳杆菌cav-m6发酵后，黄梁木的水解单宁含量降低了34.7％，缩合单宁含量降低了35.0％，总单宁含量降低了34.9％，体外粗蛋白消化率提高了 6.55％，说明植物乳杆菌cav-m6可以快速降低青贮饲料的单宁含量；快速降低青贮饲料的ph值，加速发酵过程，提高青贮速率；有效保存黄粱木营养；提高黄粱木的干物质消化率和粗蛋白消化率；可广泛使用。使用植物乳杆菌cav-m6制备的菌剂添加剂青贮效果较好，且成本低、安全、易于利用。
59.生物材料保藏说明
60.生物材料的分类命名：植物乳杆菌。
61.生物材料的拉丁文学名：lactobacillus plantarum。
62.生物材料的菌株编号：cav-m6。
63.保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
64.保藏单位简称：cgmcc。
65.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
66.保藏日期：2019年04月22日。
67.保藏编号：cgmcc no.17614。
附图说明
68.图1为植物乳杆菌cav-m6降解单宁透明圈。
具体实施方式
69.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
70.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
71.下述实施例中所述培养基的配置：
72.液体mrs培养基按照如下方法配置：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，吐温80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，用蒸馏水定容至1000ml，ph值为6.2。配好后的培养基在高压蒸汽灭菌锅中于121℃灭菌15min。
73.mrs固体培养基是在上述液体mrs培养基中加入琼脂后再灭菌得到的固体培养基。
74.实施例1：植物乳杆菌cav-m6的分离与鉴定
75.1、植物乳杆菌的分离
76.采用稀释平板法分离植物乳杆菌：无菌条件下称取黄粱木青贮料10g，置于装有 90ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，摇匀，即为稀释10倍的样品悬液，后按10倍稀释法直接连续稀释即可。选取合适稀释度，取0.1ml涂布在mrs培养基平板上，于30℃恒温箱中培养48h，进行平板计数。依据菌落大小、形态和颜色等特征，挑取典型菌落，进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株即可初步确定为乳酸菌，将其在mrs培养基上划线纯化两次，接种到mrs固体斜面培养基，4℃冰箱中保存备用。
77.2、可降解单宁的植物乳酸菌cav-m6的获得
78.制备含有1％单宁的mrs平板，待培养基冷却凝固后，用镊子将消毒灭菌的牛津杯置于培养基上，将菌液接种于牛津杯中。于30℃恒温厌氧培养48h后，观察是否产生透明圈，可以产生透明圈的菌株被认为有降解单宁的能力。通过筛选得到一株菌株编号为cav-m6的菌株(见图1)，即为本技术的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum) cav-m6，cgmcc no.17614(以下简称植物乳杆菌cav-m6)，后续测定其单宁酶活性。
79.3、植物乳杆菌cav-m6的生理生化特性
80.对植物乳杆菌cav-m6进行革兰氏染色、葡萄糖产气、过氧化氢酶试验、生育温度(5、10、45、50℃)和生育ph(3.0、3.5、4.0、4.5、9.0)、发酵碳源、发酵24h 内的ph值及od
620nm
等生理生化实验。
81.生理生化试验方法如下：
82.(1)革兰氏染色参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。
83.(2)植物乳杆菌生长ph调节使用2mol/l naoh和2mol/l hcl。
84.(3)葡萄糖产气试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱培养48h，挑取单菌落接种于含有5ml mrs液体培养基(ph6.5)的试管中(杜氏小管倒扣在试管内)，放置于普通恒温培养箱37℃培养48h，观察并记录结果，产生气泡的记为阳性，不产生气泡的则为阴性。
85.(4)过氧化氢酶测定试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱中培养48h，挑取单菌落涂布在滴加了3％(w/w)过氧化氢溶液的培养皿上，观察是否有气泡产生，产生气泡的为过氧化氢酶阳性，不产生气泡的则为阴性。
86.(5)糖发酵使用北京路桥技术股份有限公司生产的乳酸杆菌生化鉴定套装分析。对于革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性的实验菌株，采用含有8种碳源的生化鉴定套装，对照为一支麦氏浊度比浊管，试验方法依据说明书进行，37℃恒温培养48h，记录试验结果。
87.结果表明，植物乳杆菌cav-m6为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在5-50℃和 ph3.0-9.0条件下皆可生长，具有较强耐酸性，发酵24h ph降到4.0以下(表1)说明植物乳杆菌cav-m6产酸快且生长迅速，可发酵大多数糖类(表2)。
88.表1植物乳杆菌cav-m6的菌落形态及生理生化特性
[0089][0090]
注：-，不生长；+，正常生长。
[0091]
表2植物乳杆菌cav-m6的糖源发酵实验结果
[0092][0093]
注：-，不生长；+，正常生长。
[0094]
4、单宁酶的测定
[0095]
将过夜活化后的菌液接入含2g/l单宁酸的基础培养基(在液体mrs培养基中加入单宁酸至单宁酸的含量为2g/l，得到的液体)中，在37℃下150r/min振荡培养24h后将发酵液进行离心，取上清液(粗酶液)测定菌株单宁酶活力，结果表明菌株cav-m6的单宁酶酶活为4.85μmol没食子酸/min
·
ml发酵液。其中，单宁酶活力的测定原理和方法如下：没食子酸丙酯是由没食子酸与正丙醇酯化而成，能被单宁酶酶解，常被用作研究单宁酶特性的底物。单宁酶能催化没食子酸丙酯中酯键的断裂生成没食子酸，没食子酸与绕单宁反应生成的色团物质在碱性条件下显色，在520nm波长下测定吸光值，吸光度与没食子酸含量成正比，根据吸光度的大小来判断单宁酶活力的高低。
[0096]
4.1溶液配制
[0097]
①
0.1mol/l ph＝5.0的柠檬酸缓冲液：
[0098]
0.1mol/l柠檬酸：8.2ml+0.1mol/l柠檬酸钠：11.8ml
[0099]
②
没食子酸标准液：用0.1mol/l ph＝5.0的柠檬酸缓冲液配置。分别配置40、60、 80、100、120、140、160、180、200、240、260umol/l的没食子酸标准液。
[0100]
③
甲醇饶丹宁溶液(0.667％w/v)：称取0.0667g绕丹宁用甲醇定容到10ml。
[0101]
④
koh溶液(0.5mol/l)：称取1.4gkoh，定容到50ml。
[0102]
⑤
没食子酸丙酯溶液(pg)：配置10mmol/l的底物没食子酸丙酯。
[0103]
4.2测定方法
[0104]
空白管：0.25mlpg+0.25ml柠檬酸缓冲液
[0105]
测试管：0.25mlpg+0.25ml粗酶液
[0106]
对照管：0.25mlpg+0.25ml灭活粗酶液
[0107]
放入30℃水浴中保温5min。所有试管分别加入0.3ml乙醇绕丹宁(0.05mol/l)溶液,30℃水浴中再保温5min，再分别加入0.5mol/l的koh水溶液0.4ml，30℃再保温5min，然后每支试管再加4ml蒸馏水，30℃下保温5min后在520nm波长测定反应混合物的吸光值。所有测试都做3个平行实验，取算术平均值。
[0108]
酶活单位定义：在ph＝5.0、30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位。
[0109]
5、植物乳杆菌cav-m6的鉴定
[0110]
5.1形态学鉴定
[0111]
将处于对数生长期，且菌落大小稳定的植物乳杆菌cav-m6进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态、菌落边缘状态。
[0112]
结果表明菌株植物乳杆菌cav-m6菌落形态学特征为：圆形，表面光滑，细密、颜色浅黄，不透明。
[0113]
5.2 16s rdna序列同源性分析
[0114]
将植物乳杆菌cav-m6接种在0.5ml mrs液体培养基中，30℃，180rmp培养过夜，利用菌液pcr进行菌种鉴定。
[0115]
引物选用细菌的16s rdna基因扩增的通用引物(由美吉生物技术有限公司提供)：
[0116]
27f：5
’-
agagtttgatcctggctcag-3’(序列表中的seq id no.2)
[0117]
1492r：5
’-
ggttaccttgttacgactt-3’(序列表中的seq id no.3)
[0118]
pcr反应体系(50μl)：
[0119]
premix taq25μl27f(20μm)2.5μl1492r(20μm)2.5μl菌液5μlh2o15μl
[0120]
反应条件：
[0121][0122][0123]
扩增产物送美吉生物科技有限公司测序，测得16s rdna序列为序列表中seq idno.1所示，将其在ncbi上进行序列比对，结合菌株的生理生化数据，最终确定植物乳杆菌cav-m6属于植物乳杆菌。
[0124]
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rdna序列同源性分析结果，将植物乳杆菌cav-m6鉴定为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cav-m6 cgmcc no.17614。该植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)cav-m6已于2019年4月22日日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.17614。
[0125]
实施例2：植物乳杆菌cav-m6添加到青贮饲料中的应用效果
[0126]
1、青贮饲料的制备(以木本饲料黄粱木为例)
[0127]
在初花期刈割后，将未晾晒的黄粱木叶片短至2cm左右，混合均匀，得到青贮原料。
[0128]
2、植物乳杆菌cav-m6菌剂的制备
[0129]
将植物乳杆菌cav-m6接种在液体mrs培养基(ph值为6.5)中，37℃、150rpm 振荡培养24h，得到植物乳杆菌cav-m6的菌液，该植物乳杆菌cav-m6菌液中的植物乳杆菌cav-m6的含量为106cfu/ml，该植物乳杆菌cav-m6菌液即为植物乳杆菌cav-m6 菌剂。
[0130]
3、发酵青贮原料
[0131]
每种青贮原料设置4个实验组，分别为不添加青贮添加剂菌剂的对照组(ck)、添加单宁酶的对照组(ta)、添加无降解单宁能力植物乳酸菌菌剂的菌剂组(lp)和添加植物乳杆菌cav-m6的菌剂组(cav-m6)，每个实验组设置3个重复。对照组和菌剂组同时进行平行实验。
[0132]
添加植物乳杆菌cav-m6的菌剂组(cav-m6)：每千克青贮原料添加步骤2的植物乳杆菌cav-m6菌剂，菌剂的添加量满足每千克青贮原料添加106cfu植物乳杆菌 cav-m6，混合均匀，装袋青贮。取每种材料150g装入聚乙烯袋(30cm
×
20cm)中，用真空密封机抽气。每个处理重复3次，每次重复1袋，于室温(20-25℃)贮藏30d。
[0133]
添加无降解单宁能力植物乳酸菌菌剂的菌剂组(lp)：每千克青贮原料添加无降解单宁能力植物乳酸菌菌剂lp(菌剂制备方法与步骤2中方法相同)，菌剂的添加量满足每千克青贮原料添加106cfu植物乳酸菌，混合均匀，装袋青贮。取每种材料150g 装入聚乙烯袋(30cm
×
20cm)中，用真空密封机抽气。每个处理重复3次，每次重复 1袋，于室温(20-25℃)贮藏30d。无降解单宁能力植物乳酸菌菌剂筛选自饲料桑，取自河南洛阳农林科学院实验基地(北纬34.39，东经112.12，海拔250m，取样时间是2016年06月24日)，筛选方法为常规筛选方法，经检测无单宁降解能力。
[0134]
不添加青贮添加剂菌剂的对照组(ck)：每千克青贮原料添加与菌剂组中所添加的植物乳杆菌cav-m6菌剂等体积的步骤2的液体mrs培养基(ph值为6.5)(不含菌)，混合均匀后装袋青贮。取每种材料150g装入聚乙烯袋(30cm
×
20cm)中，用真空密封机抽气。每个处理重复3次，每次重复1袋，于室温(20-25℃)贮藏30d。
[0135]
添加单宁酶的对照组(ta)：每千克青贮原料添加与菌剂组中所添加的植物乳杆菌cav-m6菌剂等体积的含单宁酶的液体mrs培养基(在步骤2的液体mrs培养基(ph 值为6.5)中加入单宁酶得到的液体)，含单宁酶的液体mrs培养基的添加量满足2u单宁酶/每千克青贮原料，,混合均匀后装袋青贮。取每种材料150g装入聚乙烯袋(30cm
×
20cm)中，用真空密封机抽气。每个处理重复3次，每次重复1袋，于室温(20-25℃)贮藏30d。
[0136]
4、青贮饲料单宁含量测定
[0137]
青贮开袋后，取一定量青贮样品进行冷冻干燥。用于测定水解单宁和缩合单宁含量。
[0138]
水解单宁含量为总酚含量减去简单酚含量。
[0139]
其中总酚含量的测定方法为：采用folin-ciocalteu试剂比色法。准确称取200mg粉碎样品，置于25ml的烧杯中，加入5.00ml丙酮(70％)，室温超声波处理20min。将处理好的离心管，4℃3000g离心10min。收集上清液，冰浴保存，再用5ml丙酮(70％)将沉淀转移至烧杯，并室温超声波处理20min后如上所述离心并收集上清液。取0.2ml按上述方法制备好的单宁提取液，置于试管中，加蒸馏水将总体积补齐到1.00ml。加入0.5mlfolin试剂，2.5ml 碳酸钠溶液(20％)，涡漩混匀，25℃恒温匀速振荡40min后，725nm紫外分光光度计测定吸光度，为总酚含量，用没食子酸为标准品，绘制标准曲线。
[0140]
标准曲线绘制：取没食子酸0.0248g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml的容量瓶中，得质量浓度为0.0248mg/ml的对照品溶液。分别移取对照品0.2,0.4,0.6,0.8,1ml，加蒸馏水将总体积补齐到1.00ml。加入0.5mlfolin试剂，2.5ml碳酸钠溶液(20％)，涡漩混匀，25℃恒温匀速振荡40min后，725nm紫外分光光度计测定吸光度。以没食子酸标准液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，算标准曲线。
[0141]
简单酚含量的测定方法为：准确称取100.00mg交联不溶性聚乙烯吡咯烷酮，置于试管中，加入1ml的蒸馏水，然后加入1ml单宁提取液，涡漩混匀，在4℃下等待15min。再次涡漩， 3000g离心10min后，取上清液0.1ml置于试管中，加蒸馏水将总体积补齐到1ml。加入 0.5mlfolin试剂，2.5ml碳酸钠溶液(20％)，涡漩混匀，25℃恒温匀速振荡40min后，725nm 下紫外分光光度计测定吸光度，为简单酚含量。
[0142]
缩合单宁含量测定方法如下：采用vanilli-hcl法。准确称取粉碎样品0.1g，置于圆底离心管，加入5ml甲醇(含1％盐酸)，常温下振荡20h后将溶液换入尖底离心管中离心取上清液1ml，向其中加入5ml香兰素显色液(8％hcl:4％香兰素＝1:1)。常温等待20min后，在495nm处测定吸光值。选取儿茶素为标准品，绘制标准曲线。
[0143]
总单宁含量＝水解单宁+缩合单宁。
[0144]
试验所得数据用excel软件处理,并用sas 9.0软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析。黄粱木青贮前水解单宁含量为33.59g
·
kg-1
dm，缩合单宁为 45.63g
·
kg-1
dm，总单宁为79.22g
·
kg-1
dm。青贮后单宁含量结果如表3所示，黄粱木青贮原料在经过植物乳杆菌cav-m6发酵后，由ck结果可以看出，青贮会降低黄粱木水解单宁的含量，增加缩合单宁和总单宁含量。与ck相比，添加cav-m6显著降低了黄粱木水解单宁和缩合单宁的含量；且添加cav-m6的处理总单宁含量低于原料总单宁含量。经过植物乳杆菌cav-m6发酵后，黄梁木的水解单宁含量降低了34.7％，缩合单宁含量降低了35.0％，总单宁含量降低了34.9％。说明表明植物乳杆菌cav-m6能够有效促进青贮发酵，降低青贮饲料的单宁含量。
[0145]
表3黄粱木青贮后单宁含量(g
·
kg-1
dm)
[0146][0147]
注：ck，对照；ta，单宁酶；lp，不可降解单宁乳酸菌；每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异
[0148]
5、青贮饲料发酵品质测定
[0149]
黄粱木青贮饲料的发酵品质分析方法如下：
[0150]
氨态氮含量利用苯酚-次氯酸钠比色法测定；有机酸测定采用岛津gc-14型高效液相色谱仪(色谱柱：kc-811column，shimadzu，日本)，检测器：spd-m10avp，流动相： 3mmol l-1
高氯酸水溶液，流速1ml min-1
，柱温50℃，检测波长210nm，进样量5μl。分别以乳酸、乙酸和丙酸为标准品根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。
[0151]
试验所得数据用excel软件处理,并用sas 9.0软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析。黄粱木青贮后发酵品质如表4所示。与ck相比，添加植物乳杆菌 cav-m6可显著降低黄粱木青贮ph和氨态氮含量(p＜0.05)，并显著提高乳酸含量和乳酸/乙酸比值(p＜0.05)，即显著提高了黄粱木青贮品质。其中经过植物乳杆菌 cav-m6发酵后，黄梁木的ph值下降了12.5％，氨态氮含量下降了98.0％，乳酸含量提高了71.4％，乳酸/乙酸比值提高了44.7％。
[0152]
表4黄粱木青贮后发酵品质(g
·
kg-1
dm)
[0153][0154]
注：ck，对照；ta，单宁酶；lp，不可降解单宁乳酸菌；每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异
[0155]
6、青贮饲料蛋白组分分析
[0156]
黄粱木青贮饲料开袋后经烘箱65℃烘干48h，过40目筛粉碎，按照以下步骤进行蛋白组分的测定和计算。
[0157]
(1)粗蛋白(cp)
[0158]
采用凯氏定氮法，使用foss kj2300型全自动定氮仪测定。
[0159]
(2)可溶性蛋白(solp)
[0160]
可溶性蛋白组分的定义为瘤胃中溶于缓冲液的真蛋白，非蛋白氮(npn)不包括在内，测定方法依据licitra等(1996)改进的硼酸——磷酸缓冲液程序进行。
[0161]
硼酸——磷酸缓冲液的配制：称取12.2g磷酸二氢钠(nah2po4·
h2o)，8.91g硼酸钠(na2b4o7·
10h2o)，以及量取100ml叔丁醇于1000ml的容量瓶中蒸馏水定容。
[0162]
测定过程如下：
[0163]
1)称取0.5g粉碎后的风干样本放入125ml锥形瓶中，加入50ml硼酸-磷酸缓冲液，加入1ml叠氮化钠(10g叠氮化钠溶于100ml水)，室温放置3小时。
[0164]
2)使用定量滤纸抽滤。
[0165]
3)残渣再用150ml缓冲液冲洗。
[0166]
4)将滤纸以及残渣60℃低温烘干。
[0167]
5)采用凯氏定氮法测定滤纸与残渣的含氮量，测定以滤纸为空白。
[0168]
6)样品粗蛋白含量减去残渣不溶蛋白量即为可溶性粗蛋白。
[0169]
(3)非蛋白氮(npn)
[0170]
测定方法参考licitra等的方法(1996)。总蛋白减去钨酸溶解的真蛋白的部分。试
剂准备：
[0171]
1)10％的钨酸钠溶液(na2wo4·
h2o，100g/l)；
[0172]
2)0.5mol/l的硫酸(7ml浓硫酸(95％-98％)定溶于1l)。
[0173]
测定步骤：
[0174]
3)称取0.5g粉碎饲料样品置于125ml锥形瓶中，加入50ml冷的蒸馏水；
[0175]
4)加入8ml钨酸钠溶液，20-25℃温度下培养30min；
[0176]
5)加入约10ml 0.5m的硫酸调节ph值到2.0，室温放置过夜；
[0177]
6)采用定量滤纸过滤，用冷蒸馏水洗涤两次；
[0178]
7)将滤纸以及残渣60℃低温烘干。
[0179]
8)采用凯氏定氮法测定滤纸与残渣的含氮量，测定以滤纸为空白。
[0180]
9)样品粗蛋白含量减去残渣的氮即为非蛋白氮。
[0181]
(4)中性洗涤不溶氮(ndip)
[0182]
测定中性洗涤纤维测定后的滤袋及残渣的含氮量，以未加入饲料的经中性洗涤纤维测定程序的滤袋作为测定蛋白含量的空白值，计算得ndf中的含氮量即为ndip。
[0183]
(5)酸性洗涤不溶氮(adip)
[0184]
采用滤袋技术测定酸性洗涤纤维后，将滤袋及残渣置于凯氏定氮仪中测定含氮量，以未加入饲料的经酸性洗涤纤维测定程序的滤袋作为测定蛋白含量的空白值，计算得 adf中的含氮量即为adip。
[0185]
(6)cncps蛋白组分的计算方法如下：
[0186]
非蛋白氮fa(％cp)＝npn(％cp)
[0187]
快速降解蛋白fb1(％cp)＝solp(％cp)-fa(％cp)
[0188]
慢速降解蛋白fb3(％cp)＝ndip(％cp)-adip(％cp)
[0189]
结合蛋白fc(％cp)＝adip(％cp)
[0190]
中速降解蛋白fb2(％cp)＝100-fa(％cp)-fb1(％cp)-fb3(％cp)-fc(％cp)
[0191]
黄粱木青贮前蛋白组分含量分别是：非蛋白氮fa为3.36％cp，结合蛋白fc为15.50％cp，快速降解蛋白fb1为0.39％cp，中速降解蛋白fb2为47.70％cp，慢速降解蛋白fb3为31.01％cp，真蛋白fb为79.1％cp。
[0192]
黄粱木青贮后蛋白组分含量见表5。试验所得数据用excel软件处理,并用 spss17.0软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析和多重比较。由ck结果可以看出，青贮后非蛋白氮和结合蛋白含量有所上升，真蛋白含量有所下降。与ck 结果相比，添加植物乳杆菌cav-m6的处理显著降低了青贮材料的结合蛋白含量，提高了真蛋白含量，从而有效保存了青贮饲料营养物质，。其中，经过植物乳杆菌cav-m6 发酵后，黄梁木的结合蛋白(fc)含量下降了34.3％，真蛋白(fb)含量提高了11.0％。
[0193]
表5黄粱木青贮后蛋白组分含量(％cp)
[0194][0195]
注：每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差
异(p＜0.05)。“％”为质量百分含量。
[0196]
7、青贮饲料蛋白消化率
[0197]
利用体外消化的方式测定黄粱木饲料青贮前及青贮后的体外消化率。
[0198]
黄粱木青贮前，粗蛋白消化率为58.99％；青贮后结果如表6所示，试验所得数据用excel 软件处理,并用sas9.0软件中的单因素方差分析程序对数据进行方差分析。由ck结果可以看出，黄粱木粗蛋白消化率有所下降；与ck相比，添加植物乳杆菌cav-m6的处理显著提高了黄粱木的体外粗蛋白消化率，从而改善了青贮饲料消化率。经过植物乳杆菌cav-m6发酵后，黄梁木的体外粗蛋白消化率提高了13.0％。
[0199]
表6黄粱木青贮后体外粗蛋白消化率
[0200][0201]
注：ck，对照；ta，单宁酶；lp，不可降解单宁乳酸菌；ivcpd，体外蛋白消化率；每列数据具有相同字母尾标的代表无显著性差异，无相同字母则有显著性差异(p＜0.05)。“％”为质量百分含量。