一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法 。
背景技术：
2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2d培养与3d培养两大类。2d培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3d培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3d培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
3.干细胞3d培养载体是影响干细胞3d培养产业链的关键要素，有众多厂家进行干细胞3d培养载体研究开发，但多数干细胞3d培养载体都存在有干细胞接种活性低的问题，通过干细胞3d培养载体的表面改性在一定程度上增强了干细胞向干细胞3d培养载体的富集，但干细胞收获时出现了干细胞难于同3d培养载体分离的新难题。
技术实现要素：
4.针对上述不足，本发明提供一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法，其实质是在干细胞3d培养微载体表面及内部孔道上交联带正电荷的氨基酸，这些氨基酸能够通过正电荷吸引作用将表面带负电荷干细胞吸附到干细胞3d培养微载体上，有效强化接种效果；当干细胞在3d培养微载体中生长增殖过程时，这些氨基酸可以被 干细胞水解并吸收利用，消除3d培养微载体与干细胞之间的电荷吸附作用，干细胞在3d培养微载体中正常生长；既提升了干细胞接种时干细胞种子在3d培养微载体的吸附效果，又利用干细胞对营养物质的吸收利用功能消除带正电荷的氨基酸，解除干细胞收获时出现的干细胞难于同3d培养载体分离的难题。
5.本发明克服现有干细胞培养载体在接种时不易于吸附干细胞种子的不足，发明的一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法，具体步骤如下：s1 将在生理条件下带正电荷的氨基酸形成的小肽溶解于碱性溶液中，加入干细胞3d培养用胶原微载体充分搅拌，使小肽吸附于干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s2将充分吸附小肽的干细胞3d培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，通过形成磷酸酯键将小肽交联固定在干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s3 充分清洗去除交联剂及未交联小肽，并使交联后的干细胞3d培养用胶原微载体达到ph7.2-7.4；s4 交联后的干细胞3d培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3d培养，或保存备用。
6.优选地，s1中小肽是由在生理条件下带正电荷的赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种或几种与侧链带有羟基的丝氨酸或苏氨酸通过肽键连接形成。
7.优选地，s1中小肽可以是一种单独使用，也可以是多种混合使用。
8.优选地，s2中小肽与干细胞3d培养用胶原微载体是通过磷酸酯链交联在一起，优选地，s2中利用碱性溶液中的三偏磷酸钠完成小肽与干细胞3d培养用胶原微载体的交联。
9.优选地，优先使用碳酸钠溶液与碳酸钾溶液，也可以使用其他碱性溶液。
10.有益效果：本发明提供一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法，其实质在干细胞3d培养用载体上交联仅仅在干细胞接种阶段发挥功能的带正电荷的氨基酸（小肽），在接种阶段利用电荷的相互吸引将带负电荷的干细胞种子吸附到带正电荷的干细胞3d培养用载体上，强化接种性能；当干细胞在载体上生长与增殖时，干细胞直接吸收利用这些带正电荷的氨基酸（小肽），干细胞3d培养用载体恢复修饰前的生理状态保证干细胞的正常生长增殖。
11.下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3d培养制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
12.实施例1（1）干细胞3d培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）s1 将丝氨酰精氨酸二肽溶解于碱性的碳酸钠溶液中，加入干细胞3d培养用胶原微载体充分搅拌，使二肽吸附于干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s2将充分吸附二肽的干细胞3d培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，二肽交联固定在干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s3 充分清洗去除交联剂及未交联小肽，并使交联后的干细胞3d培养用胶原微载体达到ph7.2-7.4；s4 交联后的干细胞3d培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3d培养，或保存备用。
13.（2）以交联后的干细胞3d培养微载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用多孔微载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
14.s7 利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放msc细胞，对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.67%)、cd 44(99.56%)、cd73 (99.76%)、cd90 (99.86%)、cd 105(99.76%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.09%)、cd31 (0.17%)、cd34 (0.18%)、cd45 (0.07%)、
hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
15.实施例2（1）干细胞3d培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）s1 将丝氨酰精氨酰赖氨酸三肽溶解于碱性的碳酸钾溶液中，加入干细胞3d培养用胶原微载体充分搅拌，使三肽吸附于干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s2将充分吸附三肽的干细胞3d培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，三肽交联固定在干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s3 充分清洗去除交联剂及未交联小肽，并使交联后的干细胞3d培养用胶原微载体达到ph7.2-7.4；s4 交联后的干细胞3d培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3d培养，或保存备用。
16.（2）以交联后的干细胞3d培养微载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用多孔微载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
17.s7 利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放msc细胞，对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(97.67%)、cd 44(97.56%)、cd73 (97.96%)、cd90 (97.86%)、cd 105(99.96%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.01%)、cd31 (0.10%)、cd34 (0.11%)、cd45 (0.07%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
18.实施例3（1）干细胞3d培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）s1 将丝氨酰精氨酸二肽与苏氨酰赖氨酸二肽、丝氨酰组氨酸二肽混合溶解于碱性的碳酸钠溶液中，加入干细胞3d培养用胶原微载体充分搅拌，使混合二肽吸附于干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s2将充分吸附混合二肽的干细胞3d培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，二肽交联固定在干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s3 充分清洗去除交联剂及未交联二肽，并使交联后的干细胞3d培养用胶原微载体达到ph7.2-7.4；s4 交联后的干细胞3d培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3d培养，或保存备用。
19.（2）以交联后的干细胞3d培养微载体进行msc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞
3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用多孔微载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
20.s7 利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放msc细胞，对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc细胞按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(97.77%)、cd 44(99.88%)、cd73 (98.76%)、cd90 (98.86%)、cd 105(99.96%); cd14 (0.12%)、cd19 (0.09%)、cd31 (0.11%)、cd34 (0.12%)、cd45 (0.07%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
21.实施例4（1）干细胞3d培养用载体的修饰（相应操作均在无菌条件下完成）s1 将丝氨酰精氨酸二肽与苏氨酰赖氨酸二肽、丝氨酰组氨酸二肽混合溶解于碱性的碳酸钠溶液中，加入干细胞3d培养用胶原微载体充分搅拌，使混合二肽吸附于干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s2将充分吸附混合二肽的干细胞3d培养用胶原微载体转移到三偏磷酸钠溶液中，二肽交联固定在干细胞3d培养用胶原微载体表面及内部孔道壁上；s3 充分清洗去除交联剂及未交联二肽，并使交联后的干细胞3d培养用胶原微载体达到ph7.2-7.4；s4 交联后的干细胞3d培养用胶原微载体经过无菌检测等质检合格后，可直接用于干细胞3d培养，或保存备用。
22.（2）以交联后的干细胞3d培养微载体进行hsc干细胞3d培养s5利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s6将以干细胞3d培养用多孔微载体与hsc干细胞种子混合，按每百万个hsc用500mg多孔微载体的比例进行接种，接种后进行hsc干细胞3d培养增殖。
23.s7 利用胶原蛋白酶和磷酸酯酶裂解多孔微载体并释放hsc细胞，按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果:cd3
+
cd8
+
、cd3-cd（56+16）
+
、cd3
+
cd56
+
超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
24.本发明的一种强化接种活性的干细胞3d培养微载体及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。