miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及mir-1468-5p在评估宫颈癌患者pd-l1表达中应用。

背景技术：

pd-l1也称为b7-h1或cd274，通过与程序性死亡1(pd-1)受体结合而促进t细胞功能障碍。作为主要的免疫检查点，pd-l1在塑造免疫抑制性肿瘤微环境中起着关键作用。多数肿瘤高表达pd-l1蛋白，与其不良预后密切相关。目前检测pd-l1的方式主要是免疫组化法，但是存在以下问题：1.采用“免疫组化法”直观检测肿瘤组织中pd-l1蛋白表达，但不能实现实时检测；2.免疫组化抗体多样性，评估层次不均一。因此，如何高效准确的判断肿瘤组织pd-l1表达量对评估患者临床预后至关重要。

液态活检是指以非侵入方式从体液中获得生物标记物并对其分析，从而反映其来源组织的相关信息的检测技术。随着社会的进步和医学技术的不断发展，对于恶性肿瘤精准诊治的要求不断提高。随着对肿瘤分子机制逐渐深入地研究，使得液态活检所涉及的研究内容从传统的肿瘤循环细胞(circulatingtumorcell,ctc)和肿瘤循环dna(circulatingtumordna,ctdna)发展至肿瘤细胞来源的外泌体。

肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)富含肿瘤细胞特征性物质，尤其是mirnas，并普遍存在于患者体液中，其能够将这些遗传信息或肿瘤信号通路转移至肿瘤微环境中，促进肿瘤转移，在应用于肿瘤的早期筛查和临床诊断中有显著优势。因此，开发一种能够通过液态活检对pd-l1表达进行评估的方法具有重要的意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种通过对宫颈癌(cca)患者血浆外泌体mir-1468-5p表达水平的检测实时评估pd-l1表达，从而有效评估宫颈癌临床预后的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：mir-1468-5p在评估宫颈癌患者pd-l1表达中应用。

本发明还要求保护mir-1468-5ppcr引物在制备pd-l1表达诊断试剂或试剂盒中的应用。

具体地，通过mir-1468-5ppcr引物检测宫颈癌患者样品中mir-1468-5p的表达，从而评估pd-l1表达。

作为本发明的优选实施方式，所述宫颈癌患者样品为血样。

本发明还要求保护mir-1468-5ppcr引物在制备宫颈癌临床预后诊断试剂或试剂盒中的应用。

具体地，通过mir-1468-5ppcr引物检测宫颈癌患者样品中mir-1468-5p的表达，从而评估pd-l1表达，进而实现宫颈癌临床预后的评估。

作为本发明的优选实施方式，所述宫颈癌患者样品为宫颈癌患者血样。

本发明还提供了一种通过血浆评估pd-l1表达的方法，包括如下步骤：

(1)、提取血浆外泌体；

(2)、通过mir-1468-5ppcr引物检测mir-1468-5p的表达量；

(3)、若mir-1468-5p的相对表达量≥1.793，说明pd-l1高表达，否则pd-l1低表达。

相对于组织切片，血浆的获取更容易，优选通过提取血浆中的外泌体，检测其中mir-1468-5p的含量，从而对pd-l1的表达进行评估。相比于血浆外泌体mir-1468-5p低表达组，高表达组的临床预后更差。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中血浆外泌体的提取的具体过程为：

(1a)、收集宫颈癌患者血浆的全血样本，离心获取血浆；

(1b)、离心步骤(1a)所述血浆，去除残余血细胞；

(1c)、离心步骤(1b)去除残余血细胞后的血样，去除细胞碎片；

(1d)、将步骤(1c)获得的混合物与pbs等比例稀释，离心得到所述血浆外泌体。

更优选地，所述血浆外泌体的制备方法如下：

(1)、收集2mlcca患者全血样本，4℃，3000g，离心30分钟，获取约1ml的血浆；

(2)、4℃，8000g，离心30分钟，去除残余血细胞；

(3)、4℃，12000g，离心30分钟，去除细胞碎片；

(4)、将离心去除血细胞和细胞碎片后的血浆用等体积的pbs稀释，4℃，160000g，离心16小时，富集得到所述血浆外泌体。

本发明还要求保护用于评估宫颈癌患者pd-l1表达或宫颈癌临床预后的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括mir-1468-5ppcr引物。

作为本发明的优选实施方式，所述mir-1468-5ppcr引物包括核苷酸序列如seqidno.1所示的引物。

更优选地，还包括和引物mrq3’。

核苷酸序列如seqidno.1(ctccgtttgcctgtttcgctg)所示的引物为正向引物；引物mrq3’为反向引物，为takara公司的mir-xtmmirnafirst-standsynthesisandsybrrqrt-pcr试剂盒内含的组分。

其检测的pcr扩增程序为：

(1)预变性：95℃30s；

(2)扩增：95℃5s，60℃34s，共40个循环。

作为本发明的优选实施方式，所述包括mir-1468-5p的pcr引物的检测试剂盒还包括内参基因的引物。

更优选地，所述内参基因为u6。

作为本发明的优选实施方式，所述检测mir-1468-5p表达量的检测试剂为mir-1468-5ppcr引物。

本发明首次发现了mir-1468-5p的表达水平与pd-l1表达呈正相关，因此可以通过cca患者mir-1468-5p的表达水平对pd-l1表达进行评估；由于mir-1468-5p的表达水平可通过血浆外泌体进行检测，因此可以通过检测血浆外泌体中mir-1468-5p的表达水平即可实现pd-l1表达水平的评估，实时性、灵敏性更强，且更方便；本发明还进一步提供了通过血浆外泌体中mir-1468-5p的表达水平对pd-l1进行评估具体的方法，拓阔了pd-l1检测渠道，且检测更准确，重复性好，对于宫颈癌临床预后评估具有重要的意义。

附图说明

图1为hcep和siha细胞外泌体的提取和鉴定；a为细胞外泌体的提取和鉴定流程图，b为通过透射电子显微镜观察外泌体的形态，c为通过wb对外泌体特异标记物进行检测的检测结果。

图2为hcep和siha细胞外泌体中rna的分析结果；a为外泌体rna表达热图，b为瞬转rna至hcep细胞对pd-l1表达的影响结果，c为不同宫颈癌系外泌体中mirnas的表达情况。

图3为血浆外泌体的提取和鉴定；a为血浆外泌体的提取和鉴定流程图，b为通过透射电子显微镜观察外泌体的形态，c为通过wb对外泌体特异标记物进行检测的检测结果。

图4为血浆外泌体mir-1468-5p与pd-l1的相关性分析结果；a为不同类型样本血浆外泌体mir-1468-5p的相对表达量，b为不同类型样本血浆外泌体mir-1468-5p的相对表达量，***，p＜0.001，c为通过spearman相关性分析对血浆外泌体中mir-1468-5p的相对表达量与pd-l1的相关性分析结果，d为通过roc曲线分析得到mir-1468-5p表达的临界值。

图5为利用kaplan-meier生存曲线得到的血浆外泌体中mir-1468-5p不同表达水平对cca临床预后的评估结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

选取正常宫颈细胞(hcep)和宫颈癌细胞(siha)，提取并鉴定其分泌的外泌体，具体流程如下(图1a)：

①收集48ml细胞上清，4℃，300g，离心10分钟，去除残余细胞；

②4℃，2000g，离心10分钟，去除细胞碎片；

③4℃，10000g，离心30分钟，去除残余细胞器；

④4℃，110000g，离心70分钟，富集外泌体；

⑤外泌体鉴定：透射电镜形态学鉴定，表面特异性蛋白标志物wb鉴定；

⑥提取外泌体rna；

⑦外泌体rna进行高通量二代测序；

⑧qrt-pcr验证测序结果。

hcep和siha外泌体通过透射电镜形态学鉴定和表面特异性蛋白标志物wb鉴定的结果如图1b、1c，结果显示提取产物符合外泌体特征。

提取hcep和siha外泌体及细胞中的rna进行高通量二代测序，并进行3次生物学重复，制得hcep和siha外泌体rna表达热图(如图2a)，结果表明hcep外泌体，siha外泌体，hcep细胞，siha细胞4组间mirnas差异表达明显(测序数据已上传geo数据库，编号：gse143339)。

筛选测序结果中差异表达最显著的16个mirnas为：mir-7704，mir-5787，mir-127-3p，mir-126-5p，mir-4492，mir-142-5p，mir-4488，mir-3656，mir-1468-5p，mir-126-3p，mir-5096，mir-199-3p，mir-409-3p，mir-223-3p，mir-4466和mir-144-5p。将上述16个mirnasmimics瞬时转染至hcep，结果表明仅有mir-1468-5p能够上调pd-l1表达(图2b)。

进一步提取其他宫颈癌细胞系，包括c33a，ms751，hela，caski，me180等细胞中的外泌体及其中的mirnas，进行qrt-pcr检测，结果表明(如图2c)：相比于hcep细胞和外泌体，mir-1468-5p在所有宫颈癌细胞中明显高表达，尤其是宫颈癌外泌体，提示mir-1468-5p是上调pd-l1表达的重要mirna。

实施例2

分别收集67例正常人和102例cca患者的临床血样，提取并鉴定其分泌的外泌体，具体流程如下(图3a)：

①收集2ml全血样本，4℃，3000g，离心30分钟，获取1ml血浆；

②4℃，8000g，离心30分钟，去除残余血细胞；

③4℃，12000g，离心30分钟，去除细胞碎片；

④将离心后的1ml血浆用1mlpbs等比例稀释，4℃，160000g，离心16小时，富集血浆外泌体；

⑤外泌体鉴定：透射电镜形态学鉴定和表面特异性蛋白标志物wb鉴定；

⑥外泌体rna提取和qrt-pcr检测。

提取的血浆外泌体经透射电镜形态学鉴定和表面特异性蛋白标志物wb鉴定的结果如图3b、3c，结果显示提取产物符合其基本特征。

利用mirneasymini试剂盒提取血浆外泌体mirnas，并通过qrt-pcr检测血浆外泌体mir-1468-5p表达，检测使用takara公司的mir-x^tmmirnafirst-standsynthesisandqrt-pcr试剂盒，配制pcr体系(cdna根据试剂盒体系反转录得到)如下：

表1pcr反应体系

其中，正向引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，核苷酸序列为：ctccgtttgcctgtttcgctg(seqidno.1)，反向引物为试剂盒中的mrq3’引物。内参使用u6，正向引物为attggaacgatacagagaagat，反向引物为ggaacgcttcacgaattt。

扩增程序为：

检测结果表明(如图4a)：相比于正常人，cca患者血浆外泌体mir-1468-5p的表达明显增高。

同时在和临床血样相匹配的宫颈组织病理切片上通过免疫组化检测pd-l1表达，采用h-score评分：h-score＝σpi(i+1)，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表染色强度。结果表明(如图4b)：相比于正常人，cca患者pd-l1表达明显增高。

进一步通过spearman相关性分析发现(如图4c)，cca患者血浆外泌体mir-1468-5p相对表达量和肿瘤组织pd-l1表达量呈显著正相关(r＝0.698,p<0.001)。

根据肿瘤组织pd-l1表达的h-score评分，定义h-score≥8为pd-l1高表达；定义h-score<8为pd-l1低表达。结合roc曲线进一步发现(如图4d)，cca患者血浆外泌体mir-1468-5p相对表达量能够有效评估肿瘤组织pd-l1表达(roc曲线下面积：0.907,p<0.001)，youden’s指标表明cca患者血浆外泌体mir-1468-5p评估肿瘤组织pd-l1表达量的最优界值为1.793，即cca患者血浆外泌体mir-1468-5p相对表达量≥1.793，肿瘤组织pd-l1呈高表达；cca患者血浆外泌体mir-1468-5p相对表达量<1.793，肿瘤组织pd-l1呈低表达。

利用kaplan-meier生存曲线完成血浆外泌体mir-1468-5p不同表达水平对cca临床预后的评估，结果表明(如图5)：相比于血浆外泌体mir-1468-5p低表达组，高表达组的临床预后更差(p＝0.0026，时序检验)。

综上，这些结果提示cca患者血浆外泌体mir-1468-5p相对表达量能够有效评估肿瘤组织pd-l1表达水平及cca临床预后。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)

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