一种多肽及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种具有抗幽门螺旋杆菌的活性多肽，以及该活性多肽的制备方法。

背景技术：

禽蛋能够在缺乏完整免疫机制的情况下完成正常孵化，得益于其卵清和卵黄的抗菌特性。1889年，klemperer便发现卵黄中富含抗体。随着卵黄抗体研究的不断深入，发现卵黄抗体igy的功能与哺乳动物igg相似，但其结构较为特殊，不会激发补体系统，从而避免了产生强烈的炎症反应，使其具有广泛的应用前景。

目前，卵黄抗体对人体疾病治疗应用的研究较多，其中，针对幽门螺杆菌的应用更是近期热点。如中国专利cn109400705a公开了一种抗幽门螺杆菌鸭卵黄抗体及其制备方法；中国专利cn108440667a公开了一种抗幽门螺旋杆菌脂多糖的卵黄抗体及制备方法与应用；中国专利cn106632672a公开了一种含抗幽门螺旋杆菌igy的卵黄抗体的制备方法及其应用；中国专利cn109503710a公开了一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法与应用等等。上述专利公开的技术方案中，卵黄均来源于定向免疫的家禽体。使用特定抗原对产蛋家禽进行多次免疫，使其机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存于卵黄中，随后对卵黄进行提取纯化以获得对应的卵黄抗体。

通过上述操作能够在较短的时间获得较为可观量的卵黄抗体，但抗体效价水平由家禽的特异性免疫应答情况决定。由于免疫应答情况难以测控，因此，须对家禽进行多次特异性免疫操作，从而导致人力成本的增加。且卵黄抗体产品作为一种蛋白质，其生物活性对提纯条件要求较为苛刻，影响其提纯率，进而产生使用风险。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种多肽及其制备方法，解决了现有抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体依赖于特异性免疫而导致的人力成本增加，以及卵黄抗体产品活性与提纯率难以兼顾的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

技术方案一：

一种多肽，具有如seqidno:1所示的氨基酸序列。

进一步地，该多肽氨基酸序列还包括seqidno:1中第5位至第23位任一氨基酸的突变序列。

进一步地，该多肽氨基酸序列还包括seqidno:1中第5位至第23位氨基酸的联合突变序列。

如seqidno:1所示，多肽具有28个氨基酸。多肽相较于蛋白质，缺乏空间构型，因而其所表现出的对幽门螺旋杆菌的拮抗性能主要是由其氨基酸序列赋予的。而多肽的提取过程或合成过程即是对其精确的筛选过程，因而多肽的获得具有可控性，能够保证其纯化率。

技术方案二：

一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

s1.制备卵黄透析液；

s2.采用胰蛋白酶处理步骤s1所得的卵黄透析液；

s3.采用高效液相色谱分离并纯化步骤s2所得的处理液；

其中，步骤s1所述卵黄透析液由未进行特异性免疫的产蛋家禽提供。

本技术方案采用未进行特异性免疫的产蛋家禽生产的卵黄，通过透析，获得卵黄内蛋白质成分；再通过胰蛋白酶破坏蛋白质构型，以获得多肽；最后，利用高效液相色谱精确分离、提取目标多肽。

本技术方案利用卵黄内固有抗体，不需对家禽进行特异性免疫处理，从而节省了相关的人力投入。

进一步地，步骤s1包括以下步骤：

s11.以体积比4~9:10混合卵黄液与浓度为0.1m~0.2m的naoh溶液；

s12.调节步骤s11混合液ph值为6~9，40℃下水浴1.5h~2.4h；

s13.转速10000rpm~12000rpm下，离心处理步骤s12所得混合液，取上清，4℃下透析6h~12h。

通过上述操作，使卵黄中的蛋白质成分充分析出，以保证目标多肽的提取量。

步骤s2中所述胰蛋白酶采用固定化处理，以提高酶解效果，并便于保存，其处理过程包括以下步骤：

s21.以质量体积比1~1.5:100混合壳聚糖与0.8%~1.2%醋酸溶液至匀；

s22.以体积比20~28:500将浓度为4m~5m的naoh溶液加入步骤s21所得混合液中，混合均匀后，过滤取沉淀；

s23.冲洗步骤s22沉淀物至中性，投入1.6%~2.2%的戊二醛溶液中进行载体活化后，取出冲洗至中性；

s24.以步骤s21的壳聚糖为基础，以质量体积比1~2:80配置其所制得的活化载体与浓度为5mg/ml~12mg/ml胰蛋白酶液混合，低温交联吸附4h~12h后，冲洗、抽滤。

通过上述操作，获得的固定化胰蛋白酶，可置于-20℃冰箱保存、备用。

进一步地，以质量体积比2:15~30配置步骤s2中所述胰蛋白酶和步骤s1中所述卵黄透析液。充分利用胰蛋白酶酶解卵黄透析液中蛋白质，保证目标多肽的形成。

进一步地，步骤s2中所述的处理温度为40℃，处理时间为200min~260min。处理温度和时间决定了目标多肽的提取量。

进一步地，收集步骤s3中所述高效液相色谱保留时间为2.76min时出现的单峰。由图1可见，通过液相色谱可收集到8个峰面对应的物质。将上述物质配制成工作浓度为0.1~1.0mg/ml的试液，对按照标准方法培养的幽门螺旋杆菌进行抗菌实验验证。

技术方案三：

一种多肽的制备方法，通过化学合成seqidno:1所示氨基酸序列。

化学合成的方法有利于节约生产成本，并可控制纯度达95%以上。

技术方案四：

一种多肽在治疗或预防幽门螺杆菌感染性疾病的用途。

上述多肽以有效治疗量与可接受的药用辅料制备口服制剂。

上述多肽也可以奶粉、海藻糖、淀粉等为辅料，制备预防性保健制剂。

附图说明

图1为本发明申请实施例1所获得的高效液相色谱图。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明申请实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例1

本发明申请实施例提供了一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

1.以体积比7:10混合卵黄液与浓度为0.2m的naoh溶液，用磷酸调节上述混合液ph值为8，40℃下水浴2h后，以转速12000rpm离心处理10min，取上清于4℃下透析8h。

2.以质量体积比1:100混合壳聚糖与1%醋酸溶液至匀，以体积比24:500，将浓度为5m的naoh溶液缓慢加入壳聚糖与醋酸的混合液中，混合均匀后，采用纱布过滤收集生成的白色絮状沉淀。

3.用pbs将白色絮状沉淀冲洗直至中性，再次过滤后，加入与1%醋酸溶液等体积的、浓度为2%的戊二醛溶液，室温下、120rpm摇床中进行载体活化，处理时间5h后，用pbs反复冲洗摇床活化后的载体。

4.以壳聚糖的量为基础，以质量体积比1.2:80配置活化载体与浓度为8mg/ml胰蛋白酶液（每克酶的酶活性大于10万单位），置于4℃、60rpm摇床中交联吸附8h后，超纯水冲洗、抽滤，得固定化胰蛋白酶，置于-20℃冰箱备用。

5.以质量体积比2:15配置步骤4制得的固定化胰蛋白酶和步骤1制得的卵黄透析液，40℃下，酶解220min~260min后离心，收集析出物，冷冻干燥的酶解多肽混合产物；

其中，冷藏后的固定化胰蛋白酶须以质量体积比1:5与ph值为8.0的磷酸缓冲液重悬后使用。

6.采用分析兼半制备型高效液相色谱hplc，welchaq—c18色谱柱、dikmaeasyguard保护柱；流动相：乙腈-0.2％(体积分数)冰醋酸(体积比60：40)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；蒸发光检测器载气流速：2.2ml/min；漂移管温度：90℃。所得液相色谱图如图1所示。

7.分别收取图1中保留时间~1.61min、~1.84min、~2.39~2.48min、~2.76min、~4.2min、~6.0min和~8.74min的出峰产物，将其分别配置成工作浓度0.1mg/ml~1.0mg/ml制剂，对按照标准方法培养的幽门螺旋杆菌进行抗菌实验验证。

8.根据抗菌实验验证结果，选取保留时间~2.76min的出峰产物，测序得如seqidno:1所示的氨基酸序列。

9.对保留时间~2.76min的出峰产物进行冷冻干燥，0℃~4℃或-20℃下保存。

实施例2

1.通过化学合成，直接获得如seqidno:1所示的氨基酸序列，纯度要求在95%以上。

2.将其分别配置成工作浓度0.1mg/ml~1.0mg/ml制剂，对按照标准方法培养的幽门螺旋杆菌进行抗菌实验验证。

实施例3

1.以体积比4:10混合卵黄液与浓度为0.1m的naoh溶液，用磷酸调节上述混合液ph值为6，40℃下水浴1.5h后，以转速10000rpm离心处理12min，取上清于4℃下透析6h。

2.以质量体积比1.5:100混合壳聚糖与1%醋酸溶液至匀，以体积比20:500，将浓度为4m的naoh溶液缓慢加入壳聚糖与醋酸的混合液中，混合均匀后，采用纱布过滤收集生成的白色絮状沉淀。

3.用pbs将白色絮状沉淀冲洗直至中性，再次过滤后，加入与1%醋酸溶液等体积的、浓度为2%的戊二醛溶液，室温下、120rpm摇床中进行载体活化，处理时间5h后，用pbs反复冲洗摇床活化后的载体。

4.以壳聚糖的量为基础，以质量体积比1.2:80配置活化载体与浓度为8mg/ml胰蛋白酶液（每克酶的酶活性大于10万单位），置于4℃、60rpm摇床中交联吸附8h后，超纯水冲洗、抽滤，得固定化胰蛋白酶，置于-20℃冰箱备用。

5.以质量体积比2:15配置步骤4制得的固定化胰蛋白酶和步骤1制得的卵黄透析液，40℃下，酶解220min~260min后离心，收集析出物，冷冻干燥的酶解多肽混合产物；

其中，冷藏后的固定化胰蛋白酶须以质量体积比1:5与ph值为8.0的磷酸缓冲液重悬后使用。

6.采用分析兼半制备型高效液相色谱hplc，welchaq—c18色谱柱、dikmaeasyguard保护柱；流动相：乙腈-0.2％(体积分数)冰醋酸(体积比60：40)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；蒸发光检测器载气流速：2.2ml/min；漂移管温度：90℃。所得液相色谱图如图1所示。

7.分别收取图1中保留时间~1.61min、~1.84min、~2.39~2.48min、~2.76min、~4.2min、~6.0min和~8.74min的出峰产物，将其分别配置成工作浓度0.1mg/ml~1.0mg/ml制剂，对按照标准方法培养的幽门螺旋杆菌进行抗菌实验验证。

8.根据抗菌实验验证结果，选取保留时间~2.76min的出峰产物，测序得如seqidno:1所示的氨基酸序列。

9.对保留时间~2.76min的出峰产物进行冷冻干燥，0℃~4℃或-20℃下保存。

序列表

<110>四川昕泰科技有限公司

<120>一种多肽及其制备方法和用途

<130>2019.8.13

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<213>未知(unknown)

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2025