本发明属于生物技术
技术领域：
：，具体涉及一种酿酒酵母重组菌cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌cuol02及应用。
背景技术：
：：葫芦二烯醇(cucurbitadienol)是从葫芦科多种植物中分离得到的葫芦烷型四环三萜化合物，药理活性研宄表明葫芦二烯醇具有显著的抗炎、抗肿瘤作用，而且葫芦二烯醇是葫芦素类和罗汉果甜苷等化合物的三萜碳骨架，为其生物合成的关键前体化合物。葫芦素已被报道具有良好的抗癌活性，其中葫芦素b、d和葫芦素e、i细胞毒性显著。通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的jak-stat信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。此外，各种葫芦素还具有抗糖尿病、抗肥胖显著的降血糖和降血糖作用，例如来自苦瓜中的葫芦烷糖苷和苦瓜苷。雪胆属植物块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，特别是从该属植物中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物)开发成“雪胆素片”，具有清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。国内外学者还发现雪胆甲素具有明显的细胞毒性作用，通过抑制jak2/stat3下游的生存素(survivin)，破坏肌动蛋白细胞骨架，引导细胞发生parp介导的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使其成为一类新型的抗癌药物。雪胆属植物中葫芦素含量均非常低，由于人类无序采挖等原因，雪胆类药材野生资源正在日益减少，同时，雪胆素提取原材料的种植周期长，并且对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何能够高效地获得这些有用的次生代谢物，缓解野生资源压力，一直都是科研究人员思考和研究的问题。目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/l(parayilkumaranajikumaretal.,2010,science,330:70-74)；银杏内酯类(ginkgolides)前体左旋海松二烯(levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/l的产量(effendileonardetal.,2010,pnas,107(31):13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(artemisinin)的前体青蒿酸(artemisinicacid)最高达到100mg/l(dae-kyunroetal.,2006,nature,440:940-943)；目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究，同时shang等人利用罗汉果(siraitiagrosvenorii)中的葫芦二烯醇合酶(sgcbs)来生产葫芦二烯醇，将携带sgcbs人工质粒导入到构建好的三萜前体底盘酵母菌株wd-2091，摇瓶系统生产葫芦二烯醇的得率为82.89mg/l。雪胆素与绝大多数葫芦素化合物相似，是一种高度氧化的四环三萜化合物，生物合成途径主要通过甲羟戊酸代谢途径合成。即以乙酰辅酶a为原料合成异戊二烯焦磷酸(ipp)和二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)的一条代谢途径。随后，角鲨烯在鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase，se)进一步的催化作用下形成2,3-氧化鲨烯。最后2,3-氧化鲨烯在葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienolsynthase,cbs)一种氧化鲨烯环化酶(osc)作用下，形成葫芦素的三萜碳骨架葫芦二烯醇(cuol)，之后再经细胞色素cyp450酶和乙酰基转移酶(bahd-at)等经过一系列的结构修饰后，衍生出更多的葫芦素终产物。目前，葫芦素生物合成途径仍然不清楚，存在很多氧化修饰催化酶基因没被挖掘鉴定出来，其中主要包括氧化还原酶，比如cyp450酶、短链脱氢酶等。要搞清这些活性葫芦素化合物的生物合成途径，必须鉴定这些途径中相关的关键酶基因。然而，发掘和鉴定葫芦素后期作用酶基因需要有足够的催化前体葫芦二烯醇，这严重影响了葫芦素途径后期作用酶的挖掘鉴定。因此，迫切需要构建生产葫芦二烯醇(cuol)的酿酒酵母底盘细胞成为研究葫芦素生物合成途径的关键环节，为解析完整葫芦素生物合成途径和工厂化生产葫芦素单体奠定了重要基础。技术实现要素：本发明的发明目的是提供一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌cuol01、酿酒酵母重组菌cuol02及应用，为雪胆甲素及葫芦素的生物合成提供了足够的中间体。为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌cuol01的构建方法，包括以下步骤：s1、将来源于酿酒酵母by4742的甲羟戊酸途径的相关基因erg20、erg9、thmg1和来源于植物中华雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synhcosc6以及细胞色素p450还原酶基因synhccpr1，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；s2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母by4742中的δdna位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因leu2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌cuol01。作为优选，所述酿酒酵母工程菌cuol01提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子hxt7p、tef2p、tpi1p、gpm1p、pgk1p、tdh3p和终止子adh1t、tdh2t、eno2t、cyc1t、fba1t、pgt1t控制thmg1、hccpr1、erg1、erg20、erg9和hcosc6基因的表达，即生产葫芦二烯醇途径的下游模块。作为优选，所述酿酒酵母工程菌cuol01提供的基因表达盒的构建方法中的筛选标记基因为leu2。本发明还提供了一种由上述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌cuol01。本发明还提供了一种含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌cuol02的构建方法，包括以下步骤：将来源于酿酒酵母by4742的甲羟戊酸途径上游模块的相关基因erg12、erg13、erg8、erg19、erg10、idi、thmg1分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌cuol01中的yprcδ15dna位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因his3，形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量，同时含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母重组菌cuol02。作为优选，所述酿酒酵母工程菌cuol02提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子eno2p、tef2p、gpm1p、tpi1p、pgk3p、tef1p、tdh3p和终止子cps1t、idp1t、his5t、prm5t、prm9t、adh1t、spg5t控制erg12、erg13、erg19、erg8、idi、thmg1和erg10基因的表达，即强化甲羟戊酸途径的上游模块。作为优选，所述酿酒酵母工程菌cuol02提供的基因表达盒的构建方法中筛选标记基因为his3。作为优选，各个基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸pcr的方法连接，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δdna和yprcδ15dna位点。作为优选，所述δdna位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1～10个随机位置；所述yprcδ15dna位点为酿酒酵母第16条染色体的第16条染色体的yprcdelta15位点位置。本发明还提供了一种由上述的构建方法构建得到的酿酒酵母重组菌cuol02。本发明还提供了如上述的酿酒酵母重组菌cuol02在制备葫芦二烯醇的应用。具体应用时，上述发酵采用的培养基为液体培养基，其中各组分及其终浓度如下：终浓度为1％(质量百分含量)yeastextract(酵母膏)、终浓度为2％(质量百分含量)peptone(蛋白胨)、终浓度为2％(质量百分含量)dextrose(葡萄糖),用水补足体积：固体培养基需再加2％琼脂粉。上述发酵的条件为：30℃、250rpm/min、摇瓶振荡培养4天。本发明还提供了植物来源编码葫芦二烯醇合酶基因synhcosc6、细胞色素p450还原酶基因synhccpr1密码子优化核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2。本发明还提供了来源酵母编码erg20、erg9、erg1、erg12、erg13、erg8、erg19、erg10、idi、thmg1的核苷酸序列分别为seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12。本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下：hcosc6为来源于雪胆(hemsleyachinensis)的葫芦二烯醇合酶编码基因，其编码的蛋白为葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienolsynthase)；hccpr1为来源于雪胆(hemsleyachinensis)的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素p450还原酶1编码基因,其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素p450还原酶(ndph-cytochromep450reductase)；thmg1为来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1编码基因，具体为酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶1(3-hydroxy1-3-methylglutaryl-coareductase)；erg1为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase)；erg20为酵母法呢基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法呢基焦磷酸合酶(farnesylpyrophosphatesynthase)；erg9为酵母鲨烯合酶基因名，其编码的酶为鲨烯合酶(squalenesynthase)；erg12为酵母甲羟戊酸激酶基因名，其编码的酶为甲羟戊酸激酶(mevalonatekinase)；erg13为酵母hmg辅酶a合酶基因名，其编码的酶为hmg辅酶a合酶(hydroxymethylglutarylcoasynthetase)；erg19为酵母磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因名，其编码的酶为磷酸甲羟戊酸脱羧酶(pophosphomevalonatedeearboxylase)；erg8为酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因名，其编码的酶为磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonatekinase)；idi为酵母异戊二烯焦磷酸异构酶基因名，其编码的酶为异戊二烯焦磷酸异构酶(isopentenylpyrophosphateisomerase)；erg10为酵母乙酰乙酰辅酶a转移酶基因名，其编码的酶为乙酰乙酰辅酶a转移酶基(acetyl-coaacyltransferase)。本发明所述的编码葫芦二烯醇合酶基因synhcosc6以及细胞色素p450还原酶基因synhccpr1，是由生工生物技术有限公司(中国上海)按酵母体内表达密码子优化后，合成核苷酸序列后进行pcr扩增获得；酵母来源编码erg20、erg9、thmg1、erg12、erg13、erg8、erg19、erg10、idi、thmg1等9个基因是通过设计引物扩增酵母基因组获得。本发明还提供了来源于质粒pesc-leu2和pesc-his3的筛选标记基因leu2和his3核苷酸序列分别为seqidno.103和seqidno.104。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明通过同源重组的手段，将生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块6个基因：thmg1、hccpr1、erg1、erg20、erg9和hcosc6基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌cuol01，发现其可产生葫芦二烯醇；再导入甲羟戊酸途径的上游模块7个基因：erg12、erg13、erg19、erg8、idi、thmg1和erg10基因的表达，得到最终重组菌cuol02，其葫芦二烯醇产量明显提高；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。附图说明图1为生产葫芦二烯醇(cucurbitadienol,cuol)推导的合成路径和构建示意图；其中，cuol01为构建在酿酒酵母by4742中的δdna位点上，cuol02为构建在酿酒酵母cuol01-1中的yprcδ15dna位点上。图2为生产葫芦二烯醇的基因表达盒构建示意图(用于生产完整葫芦二烯醇的基因上、下游模块组合)。图3为本发明中cuol01中基因表达盒融合pcr扩增的7个融合片段(各个基因表达盒通过两步重叠延伸pcr连接)。图4为cuol02中基因表达盒融合pcr扩增的7个融合片段(各个基因表达盒通过两步重叠延伸pcr连接)。图5为tlc检测生产葫芦二烯醇酿酒酵母底盘细胞的提取液；其中，ergosterol酵母中内源麦角固醇；squalene为酵母中内源角鲨烯；cucurbitadienol为目的产物；1为ergosterol标准品；2为葫芦二烯醇cucurbitadienol标准品；3-6为酵母底盘细胞cuol01不同菌株的提取物，7-8为酵母底盘细胞cuol02不同菌株的提取物。图6为gc-ms进一步鉴定cucurbitadienol目标产物；其中，cucurbitadienol：标准品；wt：野生型by4742的提取物；cuol01-1：生产葫芦二烯醇的酿酒酵母工程菌cuol01中命名cuol01-1菌株的提取检测；cuol02-2：生产葫芦二烯醇的酿酒酵母工程菌cuol02中命名cuol02-2菌株的提取检测。图7为gc-ms进一步测定底盘细胞生产目标产物cucurbitadienol的产量其中，图7中c:cuol01中命名cuol01-1菌株生产葫芦二烯醇产量最高，为133.21mg/l；cuol02中命名cuol02-2菌株生产葫芦二烯醇产量最高，为296.37mg/l；gil77-pyes2:hcosc6为对照组，前期人工质粒系统生产葫芦二烯醇，产量为18.51mg/l；图7中d:cuol01中命名cuol01-1菌株生产葫芦二烯醇在发酵96小时时产量最高；cuol02中命名cuol02-2菌株生产葫芦二烯醇在发酵96小时时产量最高。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1基因元件克隆和基因表达盒的构建分为以下三步:(1)酵母基因组dna提取挑取酿酒酵母by4742(saccharomycescerevisiaeby4742)菌斑于ypd液体培养基(配方:1％yeastextract(酵母膏)，2％peptone(蛋白胨)，2％dextrose(葡萄糖))中，30℃，200rpm，培养24h，10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ulb-me)，30℃温浴1h后离心:菌体用500ultents缓冲液(10mmtris-hci,ph7.5；1mmedta,ph8.0:100mmnaac:2％triton-100；1％sds)重悬，0℃水浴1h；酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的etoh,1/10倍体积的3mnaac，20℃冰箱放置2h:1300g，4℃，离心10min，倒掉上清，沉淀用70％etoh，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20℃保存备用，得到酵母基因组dna。(2)hcosc6和hccpr1序列密码子优化来源于雪胆(hemsleyachinensis)的hcosc6和hccpr1序列进行密码子优化，由生工生物技术有限公司(中国上海)完成，基因命名为synhcosc6、synhccpr1。(3)基因序列扩增和构建基因表达盒本发明中使用或构建的所有菌株在表1中列出，用于构建质粒和菌株的引物在附件表1中列出,每种酵母菌株构建的一般程序描述如下：首先，将每个启动子，基因，终止子，营养选择标记和同源臂进行pcr扩增，分别用表2中引物扩增获得功能模块，采用high-fidelitydnapolymerase(neb:m0491)进行基因扩增。pcr反应体系为：94℃、5min；94℃、30s，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。其次，pcr扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的easypurequickgelextractionkit试剂盒进行目的基因回收。回收后在nanoready超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，放-20℃冰箱中，保存备用。最后，得到基本片段，相邻的基本片段均具有40-75bp的同源序列，用于重组或融合pcr；其次，使用相邻的2–4个基本片段作为模板，进行融合pcr，得到每个融合片段构建形成基因表达盒(如图2和图3所示)。表1使用的酵母菌株table1yeaststrainsusedinthisstudy表2用于构建酵母底盘细胞株的扩增引物table2.primersusedfortheconstructionofyeaststrains实施例2酿酒酵母基因工程菌cuol01的构建生产葫芦二烯醇途径的下游模块基因表达盒(thmg1、hccpr1、erg1、erg20、erg9构建完成后，通过标准醋酸锂转化方法(liac/ssdna)将融合片段纯化，定量并共转化入酵母菌株，因为每个相邻的片段共享40-75bp的同源序列，它们将通过酵母同源重组连接在一起并整合到染色体δdna位点上。具体步骤如下：(1)出发菌酿酒酵母by4742于ypd中过夜培养，取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4c、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤,同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac：10mmdtt；0.6msorbitol；10mmtris-hci(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min.离心,弃上清,菌体中加入1mlimsorbitol(0.22um水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1msorbitol重悬二次),到最终体积约为90u1，即为by4742感受态细胞。(2)在超净工作台中进行如下转化体系配比，peg3350(50％(w/v过滤除菌)240ul，liac1.0m(过滤除菌)36ul，ssdna(2.0mg/ml)50ul，融合片段2ul，除菌水33ul，共360ul。用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min；42℃热激40min，取150ul转化菌液涂布于sc-leu固体筛选培养基：2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸leu；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用表2引物进行pcr鉴定，得到全部6条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株cuol01。实施例3酿酒酵母基因工程菌cuol02的构建酿酒酵母基因工程菌cuol01构建成功后，选取生产葫芦二烯醇最高第一代工程菌cuol1-1作为转入菌，将甲羟戊酸途径上游模块的(erg12、erg13、erg8、erg19、erg10、idi、thmg1)基因表达盒构建完成后，采用实施例2中相同的方法进行cuol1-1感受态细胞的制备及转化，转入染色体的yprcδ15dna位点上。用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min；42℃热激40min，取150ul转化菌液涂布于sc-leu-his3固体筛选培养基：2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸leu和his；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用表2引物进行pcr鉴定，得到全部7条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株cuol02。实施例4工程菌cuol01和cuol02生产葫芦二烯醇1、工程菌培养及产物提取在固体筛选培养平板中活化的by4742、由实施例2和实施例2构建的重组工程菌株cuol01-9和cuol02-3；于ypd液体筛选培养基中制备发酵种子液(30℃，250rpm，16小时)；离心收集菌体，转移至含250ml发酵液的1000ml三角瓶中,调od至0.5,各菌株相应的发酵培养基同筛选培养基，30℃，250rpm/min。振荡培养生长96h，得到发酵产物。进一步检测产物葫芦二烯醇的含量。提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用2ml裂解液(20％koh，50％etoh)，55℃孵育1h，每20min摇晃一次；用相同体积的正己烷萃取三次合并，得到提取产物。2、薄层色谱(tlc)鉴定葫芦二烯醇将浓缩的萃取物点到tcl板上(薄层色谱法)，用溶剂环己烷/乙酸乙酯(12:1，体积比)展开，并用5％的硫酸乙醇显色剂染色显点，检测提取产物。3、气相质谱(gc-ms)鉴定和测定葫芦二烯醇将上述提取产物作经下述处理：加入200uln-methyl-n-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide至浓缩的萃取物中，70℃衍生化1h后，通过gc-ms对代谢产物进行分析。衍生化后的干燥样品重悬于200μl萃取溶剂中，即用1ml正己烷重新溶解，然后转移至玻璃自动进样器小瓶中的玻璃插件中。吸取每个样品的1μl直接进样到与isq型质谱联用的定量gc超气相色谱仪(thermoscience)中检测。使用7890bgc(安捷伦)和配有zebronzb5-ht色谱柱(phenomenex)的电子轰击(ei)5977amsd(安捷伦)进行gc-ms分析。色谱条件：以不分流模式(脉冲压力30psi)注入1μl样品(进样口250℃)，该程序涉及2分钟的柱箱温度170℃，以20℃/min的速度升至300℃在300℃下11.5分钟。在8分钟的溶剂延迟后，以扫描模式(60-800质量单位)进行检测，设置为7.2。使用masshunter工作站(agilent)软件进行数据分析。葫芦二烯醇标准品中的葫芦二烯醇保留时间为25.21min。采用标准曲线定量分析测定葫芦二烯醇含量：y＝1137000000x+20510000(r＝0.9991)。4、结果(1)薄层色谱(tlc)检测结果如图5所示，选取第一代酵母工程菌cuol01中cuol01-3cuol01-4、cuol01-5、cuol01-6的提取物检测，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品rf值相近，表明提取产物中有葫芦二烯醇。选取第二代酵母工程菌中cuol02-1和cuol02-1的提取物检测，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品rf值相近，表明提取产物中有葫芦二烯醇。(2)酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby4742(wt)没有葫芦二烯醇。(3)cuol01:酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby4742中引入外源的葫芦二烯醇合酶、细胞色素p450氧化还原酶基因和甲羟戊酸途径的相关基因erg20、erg9、thmg1得到的重组菌；其提取产物经葫芦二烯醇gc-ms分析，结果如图6所示，其中,tic:cucurbitadienol为葫芦二烯醇标准品，(b)wt：空白对照，cuol01-1：cuol01-1的提取物，cuol02-2：cuol02-2的提取物；可以看出，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品保留时间为25.21min和25.22min，表明提取产物中有葫芦二烯醇。(4)含量检测结果如表3所示，其中第一代酵母工程菌中cuol01-1葫芦二烯醇含量最高(如图7所示)，达133.21mg/l，cuol01-7葫芦二烯醇含量最低，达74.02mg/l；在cuol01-1基础上通过对酿酒酵母中上游模块的相关基因erg12、erg13、erg8、erg19、erg10、idi、thmg1的表达调控后，即强化甲羟戊酸途径代谢通量后获得系列显著提高目标产物产量的工程菌cuol02，各工程菌发酵96h时产量如表3所示，其中cuol02-2葫芦二烯醇含量最高(如图7所示)，达296.37mg/l。表3摇瓶中不同菌株产生的葫芦二烯醇table3-6cucurbitadienolproductionbydifferentstrainsinshakeflasks该表3中所有给定的数据均代表三个重复序列的平均值，并具有相应的标准偏差。阴影是本实施例构建的底盘菌株中葫芦吧二烯醇产量最高的菌株。酿酒酵母构建过程中，将下游模块整合到酵母菌株by4742的δdna位点后，所得菌株cuol01-1在摇瓶中由葡萄糖产生133.21mg/l葫芦二烯醇，这表明我们的构建设计是可行的，因为与gil77酵母细胞中人工质粒表达hcosc6的相比，只需一步整合即可将葫芦二烯醇产量提高六倍以上。在下一步中，将上游模块整合到cuol01-1的yprc-delta15位点，产生菌株cuol02-2。在摇瓶中，其葫芦二烯醇产量进一步提高至296.37mg/l。然而，菌株cuol02-2的葫芦二烯醇产量比菌株cuol01-1高55％，如图7所示。这表明引入上游模块促进了向mva途径的代谢通量，将底物物质转化并积累葫芦二烯醇。在不同时间梯度发酵的试验中，检测酵母提取物显示发酵时间在96h时达可达到最大值。序列表<110>云南大学<120>酿酒酵母重组菌cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌cuol02及应用<160>104<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2313<212>dna<213>人工合成序列(unkown)<400>1atgtggaagttgaagattggtggtgaatctgttggcaagaacgatgaaagattgttgaag60actgttaacaatcatttgggtaggcaagtttgggaattctctaacgaatctgattccgat120tccgattcagattctcaccatttccaaatcgatgaagctagaaacaccttctaccataat180agattccatcaaaagcaatcttctgacttgttcattagaatccaatatggaaaggaaatt240tcttctggtggtaaaatcggtggtatcaaattgaaggaatctgaagaagtttctggtgaa300gccgtcaagaccactttagaacgtgcattgaatttttactctgccattcaaacatctgat360ggtaactgggcctctgatttgggtggtccaatgttcttattaccaggtttgattatctct420ttgtatgtcactggtgttttgaattccgttttatctaagcaacatagacaagagatctgt480agatatatctataaccatcaaaatgaagatggtggttggggtctgcatattgaaggtcca540tccactatgttttgttccgtcttgaactacgttgctttgagattgttgagaaaggaccca600tatgaagatagtatgcctaaggctagattatggattcttgaccacggtggtgctaccgct660atcacttcttggggtaaattgtggttatctgttttaggtgtttacgaatggtcaggtaat720aacccattaccaccagaattttggattttaccatacttcttgcccttccatcctggtaga780atgtggtgtcactgtagaatggtctacttgccaatgtcttatttgtacggtaaaagattt840gtcggtccaatcactccaactgtattgtctttgagaaaggaattatacacggtcccatac900catgaaattgattggaacaagtctagaaatacgtgtgctaaagaagatttgtactatcct960catcctaagatgcaagacattttatggggtagtatccatcatgtctatgaaccattcttt1020accagatggccaggtaaaagattaagagaaaaagctctggatgctgctatgcaacatatc1080cactatgaagatgaaaacactagatatatttgtttaggtccagttaacaaagttttgaat1140atgttgtgttgttgggttgaagacccacatagtgaagcttttaagttacatttggaaaga1200gttcatgactacttgtgggtggctgaagacggtatgaagatgcaaggttataatggttcc1260caattgtgggatactgccttctctgttcaagctataatttctaccaaattgactgataat1320ttcggtcctaccttgagaaaggcccacgattttattaagaactcccaaatccgtcaagat1380tgtccaggtgacccaaacatttggtatagacatattcataagggtgcttggccattctct1440actgctgatcatggttggttgatttctgattgtactgccgaaggcttgaaggctgcctta1500ttgttgagtaagttgtcttctgaaactgttggtgaacctttggaaagaaatagattgtat1560gacgctgttaatgttttgctttcattgcaaaatgaaaacggtggtatcgcttcttacgag1620ttgactagatcatatccatggttggaattaattaacccagctgaaaccttcggggatatt1680gtcattgactacccttacgtcgaatgtacttcagcttctattgaagctttggccttgttt1740aagaaattacacccaggtcatagaactaaagaaatagagaacgctgttgctaaagctgct1800aagtttttggaagatatgcaaagagaagatggttcctggtacggttgttggggtgtttgt1860ttcacctacgctggttggttcggtattaagggtttggttgctgctggtcgtaagtataat1920aactgtccaactattagaaaggcttgtaatttcttgttatcaaaggaattaccaggtggt1980ggttggggtgaatcttatctaagttgtcaaaacaaagtttacactaacttagaaggtaat2040agaccacatttggtaaatacagcttgggctttgatggctttgattgaagctggtcaatat2100gaaaaggatccaacacctttacatagagctgctagattgttgattaattctcaattagaa2160aacggtgacttcccacaagaagaaattatgggtgtttttaacaagaactgtatgataact2220tacgctgcttaccgtaatatttttccaatttgggctttaggtgaatactgtcatcatgtt2280ttgaatgaacaacatccagctgccttgttctaa2313<210>2<211>2124<212>dna<213>人工合成序列(unkown)<400>2atggaatctgaatcctcctctatgaagttgtctccattggaattcatgacctctatcatt60aagggtaaatctgacccatctaactcatctttcaactcttctggtgaagtttcttccatt120gtctttgaaaatagagaattaattgctattttgacatcctctattgctgttttgattggt180tgtttcgttttattggtttggagaagatctaattctcaaaaggccaagactgtcgaattg240ccaaaaccattgattgttaaggaaatcgaaccagaggttgaagacggtaaaaagaaggta300actatcttctttggtactcaaactggtaccgctgaaggtttcgctaaggctttagctgat360gaagctaaagccagatacgaaaaagctactttcaaggtcgttgacttagatgattacgct420ggtgaagatgatgaatatgaaaaattgaataaggaatccttcgctctatttttcttagct480acttatggtgacggtgaacctactgataacgctgctagattttataaatggtttactgaa540ggtaaagaaagaggtgaatggctacaaaacttgcattacggtgttttcggtttgggtaat600agacaatatgaacactttaataagattgctaaagttgttgacgaattatttgaagaacaa660ggtggtaaacgtttggttaaggtaggtttgggtgacgacgatcaatgtattgaagatgac720tttacagcttggagagaatctttatggccagaattagaccaattgttaagagatgaagat780gacgcaactactgtcgctacgccttataccgctactgttttggaatacagagttgtcttt840aacgatccagcagatgctgctgctgaagatgaatcttggaacgtggctaatggtcatgct900gttcatgacgctcaacatccatacagatccaacgtcgctgttagaaaagaattacactct960cctgctagtgaccgttcatgtactcatttggaattcgatatttctggttccgctttgacc1020tatgaaaccggtgaccacgttggtgtctattgtgaaaatttgaccgaaactgttgaagaa1080gctttaaatttgttcggtttatctcctgaaacttactttagtattcatactgataatgaa1140gatggtactccaattggtggtggttctttaccaccaccatttgcttcttgtactttgaga1200gttgctttgacacgttacgctgatttgttgaactccccaaagaagtccgctttgttagct1260ttagctgctcatgctagcaacccaattgaagctgatagattaagatatctagcttctcca1320gctggtaaagacgaatattctcaatctgttgttggtgttcaaaaatcattgttagaagtt1380atggctgaattcccatctgctaaaccacctctaggtgtattctttgctgctgttgctcca1440agattgcaaccaagatactattctatttcttcctcttctcgtatggccccatctagaatt1500cacgttacttgtgctttagtttacgacaagatgccaaccggtagaacacataagggtgtt1560tgttccacttggatgaaaaattccgtttctgttgaaaaatctcatgaatgttcttgggct1620ccaattttcgtgagacaatctaactttaagttgccagctgattctaaggttccaatcatt1680atgattggtccaggtactggtttagcaccattcagaggtttcttgcaagaaagattggct1740ttgaaggaatcaggtgttgaaatgggtccatccatgttgttcttcggttgtagaaacaga1800agaactgattttatctacgaa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