一种制备1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵方法

本发明涉及微生物药物生物
技术领域：
，具体涉及1′，4′-反式-aba-二醇的发酵制备方法。
背景技术：
：1′，4′-反式-aba-二醇是真菌脱落酸(abscisicacid，aba)合成途径中的一种aba的前体类似物，其化学式是c15h22o4。其化学结构见附图1。1967年cornfor等曾报道过用化学合成1′，4′-反式-aba-二醇酯的方法，1972年walton等用cornfor报道的方法合成了1′，4′-反式-aba-二醇，并测试了其对菜豆离体胚轴的生长抑制效果，结果发现具有明显的生长抑制作用。1986年hirai等从1.1l灰葡萄孢霉菌(botrytiscinerea)培养基中分离到了6.0mgaba和1′，4′-反式-aba-二醇的混合物，发现1′，4′-反式-aba-二醇在b.cinerea体内可以转化为aba，因此认为它是aba的前体。1987年okamoto和vaughan等均在豌豆和鳄梨中发现了1′，4′-反式-aba-二醇，也能在体内转化为aba。1988年okamoto等通过2h标记实验发现赤松尾孢霉(cercosporapini-densiflorae)中1′，4′-反式-aba-二醇可以合成aba。而1989年christopher等从氧标记的苹果果实中分离到aba-醛和1′，4′-反式-aba-二醇，认为1′，4′-反式-aba-二醇可能是aba的代谢产物。1995年kettner等也发现灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)bc6可以通过1′，4′-反式-aba-二醇合成aba。2004年inomata也通过18o标记实验证实了1′，4′-反式-aba-二醇是灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)aba的合成前体。2006年王天山等也从灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)中分离出1′，4′-反式-aba-二醇的无色晶体，并通过x射线衍射分析确定了其单晶结构，本实验室将其作为农药的名称自命名为芷香二醇。由于aba在植物生长调节中的重要作用，因此科学家也推测1′，4′-反式-aba-二醇作为其前体类似物，可能也具有植物生长调节的功能。1972年，walton等使用化学合成的14c标记的1′，4′-顺式-aba-二醇和1′，4′-反式-aba-二醇测试对菜豆离体胚轴的生长抑制效果：发现这两种物质均对菜豆离体胚轴的生长具有抑制作用，但效果稍低于aba，推测这两种物质的生长抑制活性可能与其转化为aba有关。2005年asami等研究发现1′，4′-反式-aba二醇的4′-甲氧基衍生物在水芹种子萌发和ga诱导的α-淀粉酶诱导试验中表现出与aba相当水平的抑制活性，同时由于其结构特点使其不容易像aba一样分解成红花菜豆酸类的物质而失活，因此具有成为植物生长调节剂的潜力。2005年，王天山等研究了灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)中1′，4′-反式-aba二醇对稻谷种子的抑制活性，检测了其胚芽长抑制率、根长抑制率和根数抑制率，发现当浓度为0.5-5.0mg/l时，1′，4′-反式-aba二醇具有明显的抑制种子萌发效果，，随着1′，4′-反式-aba二醇浓度的增加，其抑制率也随之增强。虽然1′，4′-反式-aba二醇具有成为植物生长调节剂的潜力，但其合成方法十分有限，可将aba通过重氮甲烷处理将其转化为脱落酸甲酯，再通过nabh4依次还原合成，这种化学方法要通过aba作为前体，且操作复杂。而文献报道的从灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)菌体或者植物中提取的1′，4′-反式-aba二醇含量很低，例如1995年kettner等报道灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)bc6在合成aba的同时伴随有1′，4′-反式-aba二醇的合成，1′，4′-反式-aba二醇最高含量不超过100μg/gdw菌体，同时灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)bc6浸染的植物叶片中1′,4′-反式-aba二醇含量大约4μg/gdw。以这样的产量来说要通过化学合成或生物中提取的方法实现1′,4′-反式-aba二醇的低成本规模化生产有很大困难，因此也限制了1′,4′-反式-aba二醇的农业应用与机理研究。本实验室长期从事灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)代谢产物、发酵工艺技术研究。前期得到一株灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)tbc-10，已于2006年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.1889。我们对该灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)tbc-10进行遗传改良，获得了高产1′,4′-反式-aba二醇的菌株，并研究了该菌株发酵生产工艺；通过该发酵生产工艺，可以获得较高产量的1′,4′-反式-aba二醇，实现1′,4′-反式-aba二醇的低成本规模化生产；并获得了1′，4′-反式-aba-二醇作为植物生长调节剂和植物抗逆诱导剂的应用方法。从而完成了本发明。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的之一，是提供一种用于生产1′，4′-反式-aba-二醇(1′，4′-trans-diol-aba)的新菌株；本发明的目的之二，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产1′，4′-反式-aba-二醇；本发明的目的之三，是提供用于生产1′，4′-反式-aba-二醇的培养基。本发明的目的之四，是提供1′，4′-反式-aba-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。更具体地说，是提供一种制备1′,4′-反式-aba二醇的发酵方法，可大大提高合成1′,4′-反式-aba二醇的效率，降低成本。包含以下步骤：将能够产生1′，4′-反式-aba-二醇的丝状真菌，例如：孢霉菌属(botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)，尾孢霉属(cercospora)的赤松尾孢霉菌(c.pini-densiflorae)，或其它产生1′，4′-反式-aba-二醇的真菌及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基a)中培养，作为种子液；将种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基b)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液c)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集1′，4′-反式-aba-二醇，并进行提取和纯化。本发明的具体实施方案是，采用已知的能够产生1′，4′-反式-aba-二醇的丝状真菌，如：孢霉菌属(botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)，尾孢霉属(cercospora)的赤松尾孢霉菌(c.pini-densiflorae)，或其它产生1′，4′-反式-aba-二醇的真菌及其遗传改良菌株，如灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)的遗传改良菌株等，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基a、b。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在23-26℃发酵培养12-72小时后，选用合适的补料液，例如下文所述的补料液c，进行流加补料发酵培养。第二级液体培养流加补料(例如补料液c)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率，如0.01-10.0l/h，(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液c)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约10-48小时。所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液c)流加入第二级发酵罐中。间歇时间为每1-24小时补料1-8次，优选为间隔5-8小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01-2.0％，优选0.05-0.5％。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。发酵条件：温度23-26℃，ph：4-8。发酵时间：5-10天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。采用本发明工艺，在第二级发酵时，通过流加补料液发酵，可以为菌体持续提供合成1′，4′-反式-aba-二醇需要的碳源、氮源，维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，提高发酵体系中细胞浓度和产物合成效率，从而提高1′，4′-反式-aba-二醇的产量。在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新的遗传改良菌株等技术方案来进一步提高1′，4′-反式-aba-二醇的产量。在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)的遗传改良菌株灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)zx2用于发酵制备1′，4′-反式-aba-二醇；其已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.17678。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明发酵所采用的培养基a、b及补料液c的具体组成质量百分比如下：培养基a：葡萄糖0.1-5.0％，牛肉膏0.1-1.0％，蔗糖0.1-5.0％，乳糖0.1-2.0％，kh2po40.01-0.5％，mgso40.01-0.2％，蛋白胨0.1-5.0％。培养基b：补料液c：成分一般范围优选范围葡萄糖0.1-6.0％0.2-2.0％蛋白胨0.1-5.0％0.5-2.0％mgso40.001-1.0％0.005-0.1％nacl0.001-1.0％0.005-0.5％本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为：将活化后的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)zx2菌种/孢子液接种于灭菌培养基a中，装于三角瓶内23-26℃摇瓶培养20-50小时后，以1-25％的接种量接种于已加有灭菌培养基b的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养12-72小时后，开始补料液c的流加补料。补料液c流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。采用连续流加方式时，以0.01-10.0l/h的速度连续(匀速或非匀速)流加补料液c，直至停止发酵(下罐)前约10-48小时。采用间歇式流加方式时，间歇时间可为每1-24小时补料1-8次，优选为大约间隔5-8小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01-2.0％，优选0.05-0.5％。发酵条件：温度23-26℃，ph：4-8。发酵时间：5-10天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤技术过滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。本发明的全工艺流程见附图2。采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产1′，4′-反式-aba-二醇；采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-aba-二醇含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为a水，b甲醇；流速：0.8ml/min〕，其产量可达0.6g/l。本发明还提供了1′，4′-反式-aba-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。具体为：(1)用1′，4′-反式-aba-二醇处理植物种子，可以提高种子发芽率和生长素质，提高苗期的抗旱、抗寒、抗病和抗盐碱等综合抗逆能力；有效应用浓度范围为0.1-10.0ppm；可以采用浸种、或拌种、或作为种子包衣剂成分等处理方式，根据不同作物种类所用浓度可以不同。如水稻种子用0.1-0.5ppm的1′，4′-反式-aba-二醇浸种或拌种处理后，发芽率提高3-10％，促进秧苗根系发达，并可提高产量。(2)在植物苗期，外源施用1′，4′-反式-aba-二醇可以起到大幅提高植物生长素质和抗逆性的作用。一般情况下，从植物3叶期起即可采用叶面喷施的方式施用1′，4′-反式-aba-二醇，喷施的浓度一般在0.1-20.0ppm。如，在番茄等蔬菜作物、烟草等经济作物上应用时，在苗期，喷施浓度为1.0-20.0ppm的1′，4′-反式-aba-二醇2-5次，或用浓度为0.1-5.0ppm的1′，4′-反式-aba-二醇灌根，能显著增强作物整个生育期对低温、干旱、水涝、病害等逆境的抗性，促进生根及根系对水肥的吸收利用，调节花期，提高产量和品质。本发明具有以下优点：1.本发明采用遗传改良菌株灰葡萄孢霉(b.cinerea)zx2，其底物转化率和产物合成速率较高，1′，4′-反式-aba-二醇的产量可达0.6g/l。2.采用本发明发酵培养基及液体培养基流加补料发酵工艺，可以维持菌株生长和合成产物需求的较好的碳氮比，实现较高的1′，4′-反式-aba-二醇的产量。3,提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。4.提供了1′，4′-反式-aba-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。附图说明图1是1′，4′-反式-aba-二醇化学结构图。图2是本发明1′，4′-反式-aba-二醇的发酵生产工艺流程图。具体实施方式下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述。实施例一用1000ml三角瓶10个，每瓶装250ml培养基a(葡萄糖1.0％，牛肉膏0.5％，蔗糖1.0％，乳糖0.5％，kh2po40.05％，mgso40.02％，蛋白胨1.5％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)zx2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中(培养基b：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸4.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.2％，酵母粉0.2％，kh2po40.05％，mgso40.01％，nacl0.05％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐，于23-26℃发酵培养72小时后，开始进行以0.05l/h的速度连续流加补料液c的流加补料(补料液c：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，mgso40.01％，nacl0.02％)，直至停止发酵(下罐)前约16小时。发酵ph4-8，发酵周期8天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-aba-二醇含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为a水，b甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-aba-二醇产量可达0.6g/l。实施例二用1000ml三角瓶10个，每瓶装250ml培养基a(葡萄糖0.5％，牛肉膏0.5％，蔗糖0.5％，乳糖0.4％，kh2po40.05％，mgso40.02％，蛋白胨0.5％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)zx2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中(培养基b：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸2.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.5％，酵母粉0.2％，kh2po40.05％，mgso40.01％，nacl0.02％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，采用间歇式流加方式流加补料液c的流加补料(补料液c：葡萄糖0.4％，蛋白胨0.5％，mgso40.01％，nacl0.01％)，采用间歇式流加方式，间歇时间为每5小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.25％，直至停止发酵(下罐)前约24小时停止补料。发酵ph4-8，发酵周期8天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-aba-二醇含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为a水，b甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-aba-二醇产量可达0.5g/l。实施例三用1000ml三角瓶10个，每瓶装250ml培养基a(葡萄糖1.0％，牛肉膏1.0％，蔗糖0.5％，乳糖1.0％，kh2po40.06％，mgso40.02％，蛋白胨0.6％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)zx2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中(培养基b：葡萄糖0.2％，蔗糖0.3％，乳糖0.2％，麦麸5.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉0.2％，酵母粉0.5％，kh2po40.02％，mgso40.01％，nacl0.05％，消泡剂0.02％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，开始进行以0.05l/h的速度连续流加补料液c的流加补料(补料液c：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，mgso40.01％，nacl0.01％)，直至停止发酵(下罐)前约10小时。发酵ph4-8，发酵周期6天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-aba-二醇含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为a水，b甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-aba-二醇产量可达0.4g/l。实施例四用1000ml三角瓶10个，每瓶装250ml培养基a(葡萄糖0.6％，牛肉膏0.5％，蔗糖0.5％，乳糖0.4％，kh2po40.05％，mgso40.02％，蛋白胨0.6％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(b.cinerea)tbc-10孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中(培养基b：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸1.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.1％，酵母粉0.2％，kh2po40.05％，mgso40.01％，nacl0.01％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，开始进行以0.08l/h的速度连续流加补料液c的流加补料(补料液c：葡萄糖0.6％，蛋白胨1.0％，mgso40.01％，nacl0.02％)，直至停止发酵(下罐)前约16小时。发酵ph4-8，发酵周期6天。发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-aba-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-aba-二醇结晶产物。采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-aba-二醇含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为a水，b甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-aba-二醇产量可达0.02g/l。实施例五用1′，4′-反式-aba-二醇浸种，提高发芽率，促进水稻幼苗的根系生长。具体做法：将水稻宜香优2115种子表面消毒后，用0.5ppm1′，4′-反式-aba-二醇水溶液常温浸种处理24h，温室(26℃，16h光照/8h暗培养)催芽，3天后计算发芽率，并选取发芽的种子置于种子培养袋中，清水培养：两周后取出，统计根长，根面积等指标，结果发现其对水稻幼苗的根系生长有一定促进作用，如下表。以清水、s-诱抗素(aba)为对照处理。实施例六烤烟苗移栽期喷施1′，4′-反式-aba-二醇，对烟草花叶病毒病、枯斑病的发生具有较好的诱抗效果，烟草花叶病毒病发病率减少10-30％，烟叶产量提高5-15％。以清水、s-诱抗素(aba，市售，纯度90％)为对照处理。当前第1页12