高血脂分子分型与遗传易感性生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于检验医学、临床医学、生物技术、生物化学及分子生物学领域，涉及高血脂分子分型与遗传易感性生物标志物及其应用。

背景技术：

高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、高血压、冠心病、脑血管病、胰腺炎等。高脂血症可分为原发性和继发性两类。原发性与先天性和遗传有关，是由于单基因缺陷或多基因缺陷，使参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常所致，或由于环境因素(饮食、营养、药物)和通过未知的机制而致。

高脂血症的临床表现主要是脂质在真皮内沉积所引起的黄色瘤和脂质在血管内皮沉积所引起的动脉硬化。尽管高脂血症可引起黄色瘤，但其发生率并不很高；而动脉粥样硬化的发生和发展又是一种缓慢渐进的过程。因此在通常情况下，多数患者并无明显症状和异常体征。不少人是由于其他原因进行血液生化检验时才发现有血浆脂蛋白水平升高。

关于高脂血症的诊断标准，目前国际和国内尚无统一的方法。既往认为血浆总胆固醇浓度>5.17mmol/l(200mg/dl)可定为高胆固醇血症，血浆三酰甘油浓度>2.3mmol/l(200mg/dl)为高三酰甘油血症。各地由于所测人群不同以及所采用的测试方法的差异等因素，所制定的高脂血症诊断标准不一。但为了防治动脉粥样硬化和冠心病，合适的血浆胆固醇水平应该根据患者未来发生心脑血管疾病的风险来决定，发生风险越高，合适的血浆胆固醇水平应该越低。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种高血脂诊断和分型的超敏生物标志物，该生物标志物用于高血脂筛查与临床鉴别具有高靶向性、稳定性、超灵敏的特点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：ahr作为生物标志物在制备用于高血脂诊断的试剂或试剂盒中的用途，所述生物标志物ahr的编码基因包括如seqidno.1所示的核苷酸序列。

所述ahr是一种hlhpas结合蛋白家族的转录因子，传统上被作为生物体环境毒性和代谢酶的介导因子，其核苷酸编码具有芳香烃受体活性的多肽。

近年来，一些研究逐渐显示该蛋白在心血管系统发育、功能形成和疾病发生等过程发挥重要作用，例如通过ahr基因敲除小鼠的研究，发现小鼠罹患多种典型症状，包括心肌肥大、血管重构和高血压等，而在apoe缺失的动脉粥样硬化小鼠模型中，ahr基因的激活诱导血管炎症的发生，并促进动脉硬化程度，以上结论均说明ahr受体在心血管疾病的发生发展中具有重要影响，然而其对人类高血脂的系统作用机制及临床应用还少见报道。

本发明首次发现了ahr可作为判断高血脂发生的生物标志物，可用于制备用于筛查高血脂或辅助高血脂病理鉴定、临床诊断、分子分型、生化检验、易感风险评估、产前筛查/诊断、遗传咨询的试剂、试剂盒及相关工具。

作为本发明的优选实施方式，所述标志物通过以下方法进行高血脂诊断：检测样品基因组中的ahrrs2066853的基因型。

具体地，提取样品中的dna，通过测序或探针的方法检测基因组中的ahrrs2066853的基因型。

本发明首次发现了ahrrs2066853的基因型与高血脂相关。

作为本发明的优选实施方式，所述样品为血样。

本发明还要求保护用于检测ahrrs2066853snp位点的试剂在制备高血脂诊断试剂盒中的用途。

本发明还要求保护一种高血脂诊断试剂，所述试剂用于检测ahrrs2066853snp位点。

作为本发明的优选实施方式，所述试剂为包括用于检测ahrrs2066853snp位点的引物或探针。

更优选地，所述用于检测ahr基因表达的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示；

seqidno.2：5’-gattgattttgaagacctca-3’，

seqidno.3：5’-ctgaaggtactgaaggtatgaagggag-3’。

通过上述引物可对基因组相关基因序列进行扩增，进一步通过测序的方法可得到具体的基因型。

更优选地，所述探针的核苷酸序列如seqidno.4所示；seqidno.4：5’-cy5-ccattttgaagacatcagacacatgcagaatgg-bhq2-3’。

本发明还要求保护一种试剂盒，所述试剂盒用于高血脂及其并发症动脉粥样硬化、高血压、冠心病、脑卒中等相关疾病的早期预警、危险分层、产前筛查/诊断、遗传咨询，所述试剂盒包括所述用于检测ahrrs2066853snp位点的试剂。

本发明相对于现有技术的有益技术效果如下：本发明发现ahr分子与高血脂的发生发展密切相关，通过检测ahrrs2066853的基因型可预测高血脂发生、判断高血脂发展程度和评估高血脂遗传易感性和患病风险，对于更加个体化、准确、灵敏地预测和鉴别高血脂的早期发病情况、恶性程度、产前筛查/诊断、遗传咨询具有重要的意义。

附图说明

图1为ahr用于高血脂的风险评估与遗传咨询分析结果(*p<0.05，**p<0.01)。

图2为ahr用于高血脂患者的临床诊断的分析结果(*p<0.05，**p<0.01)。

图3为ahr用于糖尿病合并高血脂的风险评估与遗传咨询(*p<0.05，**p<0.01)。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1ahr用于高血脂的风险评估与遗传咨询

1.受试群体

所有研究对象来源于广东医科大学附属医院，依据患者血脂水平分为高脂血症组(a组)395例和非高脂血症组(b组)452例。依据《中国成人血脂异常防治指南》血脂水平分层标准，高脂血症的临床诊断如下：总胆固醇(tc)≥6.19mmol/l(240mg/dl)，甘油三酯(tg)≥2.27mmol/l(200mg/dl)，低密度脂蛋白(ldl)≥4.14mmol/l(160mg/dl)。

2.基因组dna提取和纯度检测

采用tianamp全血dna提取试剂盒提取血液基因组dna，步骤如下(具体本领域技术人员可根据使用的试剂盒说明书以及实际情况调整)：

(1)取血液样品500品(于1.5ml的离心管中，加入800中，的红细胞裂解液cl，充分颠倒混匀至红细胞充分裂解，12000rpm离心3分钟，弃去上清，留下细胞核沉淀。

(2)向细胞核沉淀中加入200沉淀缓冲液gs，彻底震荡混匀。

(3)加入20荡蛋白酶k，混匀。

(4)加入200荡混的缓冲液gb，颠倒混匀充分，56℃温浴20分钟，其间颠倒混匀3～4次，直至溶液清亮。

(5)加入200溶液无水乙醇，颠倒混匀充分。

(6)将所得溶液转移至已放入收集管中吸附柱cb3中，12,000rpm离心30秒，弃去收集管中废液。

(7)向吸附柱cb3中加入500收集的缓冲液gd，12,000rpm离心30秒，弃去收集管中废液。

(8)向吸附柱cb3中加入600收集的漂洗液pw，12,000rpm离心30秒，弃去收集管中废液。

(9)重复步骤8。

(10)将吸附柱cb3放回到收集管中，12,000rpm离心2分钟，离去残留漂洗液，打开吸附柱cb3盖子，室温静置7分钟，彻底晾干吸附材料中残留漂洗液。

(11)取出吸附柱cb3放入新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间悬空加入100，向洗脱缓冲液tb，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟，收集dna溶液于离心管中。最后储存在-20℃冰箱中用于基因型检测。

(12)dna的纯度检测：用epoch分光光度计检测dna溶液在260nm和280nm波长处的吸光度(od)，如果od260/od280比值在1.6～1.9之间，则dna纯度合格。

3.基因组测序

3.1引物法

通过引物对提取的基因组dna进行扩增，引物序列如下：

正向引物：5’-gattgattttgaagacctca-3’(seqidno.2)，

反向引物：5’-ctgaaggtactgaaggtatgaagggag-3’(seqidno.3)。

扩增体系如下：

表1pcr扩增体系

扩增程序如下：

预变性，94℃，2min；变性，94℃，30sec，退火，55-65℃，30sec，延伸，72℃，30sec，32个循环；终延伸，72℃，10min。

扩增产物经过聚乙二醇电泳纯化和沉淀后，在abi3130xldna序列检测器上使用terminatorv3.1试剂盒(美国加利福尼亚州福斯特城的appliedbiosystems)直接测序。结果由genemapper4.0系统(appliedbiosystems)记录和分析，得出基因型。

3.2探针法：

pcr模板制作：

分别将各dna储备液用去离子水稀释成10ng/μl的dna工作液，储存于96孔作为pcr模板

pcr反应体系(5μl，384板)：1μldna工作液+2.5μluniversalpcrmastermix+0.25μl正向/反向引物(seqidno.2、seqidno.3)+0.125μl去离子水

基因分型：

探针(seqidno.4)+1.25μl去离子水

pcr反应条件：

预反应50℃(2min)，95℃(10min)；

pcr扩增95℃(15s)，60℃(1min)，45个循环。

4.使用q6软件(abi)读取结果分析方法

用spss20.0统计软件分析数据。以均数±标准差(x±s)表示符合正态分布计量资料，频数(n)表示计数资料。采用方差分析分析计量资料；卡方检验分析各组计数资料，均以p＜0.05差异有统计学意义。

5.结果

①ahr用于高血脂的风险评估与遗传咨询

a组中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为43.0％、40.8％、16.2％，等位基因g和a出现的频率分别为63.4％、36.6％；b组中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为34.3％、47.8％、17.9％，等位基因g和a出现的频率分别为58.2％、41.8％；两组间基因型和等位基因频率比较，存在显著性差异(p<0.05)。

对g等位基因的显性模型(gg/gavsaa)进行比较，结果显示：a组与b组无显著性差异(p>0.05)；而对a等位基因的隐性模型(ga/aavsgg)分析则显示，a组与b组存在显著性差异(x²＝1.448，p<0.05)(如图1)。

②ahr用于高血脂患者的临床诊断

进一步根据年龄、bmi、glu等生理指标对高脂血症风险分层分析。在年龄、bmi、glu等生理指标中a组与b组ahrrs2066853基因型进行比较，无显著差异(p>0.05)(如图2)。

综上可得，ahr作为患者高血脂风险的评估因素，且当ahrrs2066853g/a基因为g时(即gg/ga)，高血脂的风险较高。

实施例2ahr用于糖尿病合并高血脂的风险评估与遗传咨询

依据患者血糖水平分为糖尿病组(组1)231例和非糖尿病组(组2)267例；按患者血脂和血糖水平分为既有糖尿病又有高脂血症组(ⅰ组)63例和既无糖尿病也无高脂血症组(ⅱ组)102例。依据《who糖尿病诊断标准》，糖尿病的临床诊断如下：空腹(至少8小时没有进食热量)血糖≥7.0mmol/l(126mg/dl)；任意点血糖或75g葡萄糖负荷后2小时血糖≥11.1mmol/l(200mg/dl)。

根据实施例1的方法提取组1、组2、ⅰ组、ⅱ组患者血液中的dna并进行测序分析。

结果显示：

组1、组2中的ahrrs2066853g/a基因频率分布均符合hardy-weinberg遗传平衡定律(x²＝3.19，p＝0.203；x²＝0.69，p＝0.708)。

组1中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为47.6％、39.0％、13.4％，等位基因g和a出现的频率分别为66.9％、33.1％；组2中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为40.8％、47.9％、11.2％，等位基因g和a出现的频率分别为64.8％、35.2％；两组间基因型和等位基因频率比较，无显著性差异(p>0.05)。对g等位基因的显性模型(gg/gavsaa)进行比较，结果显示1组与组2无显著性差异(p>0.05)；而对a等位基因的隐性模型(ga/aavsgg)分析则显示，组1与组2无显著性差异(p>0.05)。

组合组(ⅰ组)、对照组(ⅱ组)中的ahrrs2066853g/a基因频率分布均符合hardy-weinberg遗传平衡定律(x²＝5.72，p＝0.057；x²＝0.09，p＝0.95)。

组合组中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为31.7％、34.9％、33.3％，等位基因g和a出现的频率分别为49.2％、50.8％；对照组中gg、ga、aa三种基因型出现的频率分别为41.2％、47.1％、11.8％，等位基因g和a出现的频率分别为64.7％、35.8％；两组间基因型和等位基因频率比较，存在显著性差异(p<0.05)。

对g等位基因的显性模型(gg/gavsaa)进行比较，结果显示组合组与对照组存在显著性差异(p<0.05)；而对a等位基因的隐性模型(ga/aavsgg)分析则显示，组合组与对照组无显著性差异(p>0.05)(如图3)。

综上可得，当ahrrs2066853g/a基因为g时(即gg/ga)，糖尿病合并高血脂风险较高。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>雷桅

<120>高血脂分子分型与遗传易感性生物标志物及其应用

<130>h2001115674#

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>4778

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

gaacggaagctgggagcagccgggactggtggcccgcgcccgagctccgcaggcgggaag60

caccctggatttgggaagtcccgggagcagcgcggcggcacctccctcacccaaggggcc120

gcggcgacggtcacggggcgcggcgccaccgtgagcgacccaggccaggattctaaatag180

acggcccaggctcctcctccgcccgggccgcctcacctgcgggcattgccgcgccgcctc240

cgccggtgtagacggcacctgcgccgccttgctcgcgggtctccgcccctcgcccaccct300

cactgcgccaggcccaggcagctcacctgtactggcgcgggctgcggaagcctgcgtgag360

ccgaggcgttgaggcgcggcgcccacgccactgtcccgagaggacgcaggtggagcgggc420

gcggcttcgcggaacccggcgccggccgccgcagtggtcccagcctacaccgggttccgg480

ggacccggccgccagtgcccggggagtagccgccgccgtcggctgggcaccatgaacagc540

agcagcgccaacatcacctacgccagtcgcaagcggcggaagccggtgcagaaaacagta600

aagccaatcccagctgaaggaatcaagtcaaatccttccaagcggcatagagaccgactt660

aatacagagttggaccgtttggctagcctgctgcctttcccacaagatgttattaataag720

ttggacaaactttcagttcttaggctcagcgtcagttacctgagagccaagagcttcttt780

gatgttgcattaaaatcctcccctactgaaagaaacggaggccaggataactgtagagca840

gcaaatttcagagaaggcctgaacttacaagaaggagaattcttattacaggctctgaat900

ggctttgtattagttgtcactacagatgctttggtcttttatgcttcttctactatacaa960

gattatctagggtttcagcagtctgatgtcatacatcagagtgtatatgaacttatccat1020

accgaagaccgagctgaatttcagcgtcagctacactgggcattaaatccttctcagtgt1080

acagagtctggacaaggaattgaagaagccactggtctcccccagacagtagtctgttat1140

aacccagaccagattcctccagaaaactctcctttaatggagaggtgcttcatatgtcgt1200

ctaaggtgtctgctggataattcatctggttttctggcaatgaatttccaagggaagtta1260

aagtatcttcatggacagaaaaagaaagggaaagatggatcaatacttccacctcagttg1320

gctttgtttgcgatagctactccacttcagccaccatccatacttgaaatccggaccaaa1380

aattttatctttagaaccaaacacaaactagacttcacacctattggttgtgatgccaaa1440

ggaagaattgttttaggatatactgaagcagagctgtgcacgagaggctcaggttatcag1500

tttattcatgcagctgatatgctttattgtgccgagtcccatatccgaatgattaagact1560

ggagaaagtggcatgatagttttccggcttcttacaaaaaacaaccgatggacttgggtc1620

cagtctaatgcacgcctgctttataaaaatggaagaccagattatatcattgtaactcag1680

agaccactaacagatgaggaaggaacagagcatttacgaaaacgaaatacgaagttgcct1740

tttatgtttaccactggagaagctgtgttgtatgaggcaaccaacccttttcctgccata1800

atggatcccttaccactaaggactaaaaatggcactagtggaaaagactctgctaccaca1860

tccactctaagcaaggactctctcaatcctagttccctcctggctgccatgatgcaacaa1920

gatgagtctatttatctctatcctgcttcaagtacttcaagtactgcaccttttgaaaac1980

aactttttcaacgaatctatgaatgaatgcagaaattggcaagataatactgcaccgatg2040

ggaaatgatactatcctgaaacatgagcaaattgaccagcctcaggatgtgaactcattt2100

gctggaggtcacccagggctctttcaagatagtaaaaacagtgacttgtacagcataatg2160

aaaaacctaggcattgattttgaagacatcagacacatgcagaatgaaaaatttttcaga2220

aatgatttttctggtgaggttgacttcagagacattgacttaacggatgaaatcctgacg2280

tatgtccaagattctttaagtaagtctcccttcataccttcagattatcaacagcaacag2340

tccttggctctgaactcaagctgtatggtacaggaacacctacatctagaacagcaacag2400

caacatcaccaaaagcaagtagtagtggagccacagcaacagctgtgtcagaagatgaag2460

cacatgcaagttaatggcatgtttgaaaattggaactctaaccaattcgtgcctttcaat2520

tgtccacagcaagacccacaacaatataatgtctttacagacttacatgggatcagtcaa2580

gagttcccctacaaatctgaaatggattctatgccttatacacagaactttatttcctgt2640

aatcagcctgtattaccacaacattccaaatgtacagagctggactaccctatggggagt2700

tttgaaccatccccataccccactacttctagtttagaagattttgtcacttgtttacaa2760

cttcctgaaaaccaaaagcatggattaaatccacagtcagccataataactcctcagaca2820

tgttatgctggggccgtgtcgatgtatcagtgccagccagaacctcagcacacccacgtg2880

ggtcagatgcagtacaatccagtactgccaggccaacaggcatttttaaacaagtttcag2940

aatggagttttaaatgaaacatatccagctgaattaaataacataaataacactcagact3000

accacacatcttcagccacttcatcatccgtcagaagccagaccttttcctgatttgaca3060

tccagtggattcctgtaattccaagcccaattttgaccctggtttttggattaaattagt3120

ttgtgaaggattatggaaaaataaaactgtcactgttggacgtcagcaagttcacatgga3180

ggcattgatgcatgctattcacaattattccaaaccaaattttaatttttgcttttagaa3240

aagggagtttaaaaatggtatcaaaattacatatactacagtcaagatagaaagggtgct3300

gccacggagtggtgaggtaccgtctacatttcacattattctgggcaccacaaaatatac3360

aaaactttatcagggaaactaagattcttttaaattagaaaatattctctatttgaatta3420

tttctgtcacagtaaaaataaaatactttgagttttgagctactggattcttattagttc3480

cccaaatacaaagttagagaactaaactagtttttcctatcatgttaacctctgctttta3540

tctcagatgttaaaataaatggtttggtgctttttataaaaagataatctcagtgctttc3600

ctccttcactgtttcatctaagtgcctcacatttttttctacctataacactctaggatg3660

tatattttatataaagtattctttttcttttttaaattaatatctttctgcacacaaata3720

ttatttgtgtttcctaaatccaaccattttcattaattcaggcatattttaactccactg3780

cttacctactttcttcaggtaaagggcaaataatgatcgaaaaaataattatttattaca3840

taatttagttgtttctagactataaatgttgcagagccaagatcgccccactgcactcca3900

gcctggcaatagaccgagactccgtctccaaaaaaaaaaaaatacaatttttatttcttt3960

tactttttttagtaagttaatgtatataaaaatggcttcggacaaaatatctctgagttc4020

tgtgtattttcagtcaaaactttaaacctgtagaatcaatttaagtgttggaaaaaattt4080

gtctgaaacatttcataatttgtttccagcatgaggtatctaaggatttagaccagaggt4140

ctagattaatactctatttttacatttaaaccttttattataagtcttacataaaccatt4200

tttgttactctcttccacatgttactggataaattgtttagtggaaaataggctttttaa4260

tcatgaatatgatgacaatcagttatacagttataaaattaaaagtttgaaaagcaatat4320

tgtatatttttatctatataaaataactaaaatgtatctaagaataataaaatcacgtta4380

aaccaaatacacgtttgtctgtattgttaagtgccaaacaaaggatacttagtgcactgc4440

tacattgtgggatttatttctagatgatgtgcacatctaaggatatggatgtgtctaatt4500

ttagtcttttcctgtaccaggtttttcttacaatacctgaagacttaccagtattctagt4560

gtattatgaagctttcaacattactatgcacaaactagtgtttttcgatgttactaaatt4620

ttaggtaaatgctttcatggcttttttcttcaaaatgttactgcttacatatatcatgca4680

tagatttttgcttaaagtatgatttataatatcctcattatcaaagttgtatacaataat4740

atataataaaataacaaatacgaaaaaaaaaaaaaaaa4778

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gattgattttgaagacctca20

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctgaaggtactgaaggtatgaagggag27

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cattttgaagacatcagacacatgcagaatgg32