一种靶向CPSG4的人源化嵌合抗原受体及表达该嵌抗原受体的免疫效应细胞及其应用的制作方法

一种靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体及表达该嵌抗原受体的免疫效应细胞及其应用
技术领域
1.本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体、表达靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体的免疫效应细胞，及其应用。


背景技术：

2.癌症目前是世界上死亡率最高的病种之一，而近年来针对癌症的疗法的研究也已经从传统的手术、放疗、化疗向靶向治疗、免疫治疗等精准治疗方向转变。而精准治疗的关键就是有效而安全的靶点的选择。
3.硫酸软骨素蛋白聚糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4，cspg4)，又称高分子量黑色素瘤相关抗原(high molecular weight-melanoma-associated antigen,hmw-maa)或者黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，mcsp)是硫酸软骨素蛋白聚糖家族中的一员，首先被发现在黑色素瘤中高表达。后期研究中发现cspg4也在其他的恶性实体瘤诸如脑胶质母细胞瘤、三阴乳腺癌、头颈鳞状细胞癌和间皮瘤中高表达，同时cspg4在实体瘤内部的毛细血管表面表达同样很高。相比之下，cspg4在正常组织和关键器官中表达极低。此外，cspg4可以调节细胞与基质的相互作用，激活下游的erk、fak等信号通路，在肿瘤细胞的增殖、迁移、血管形成和转移中起重要作用。
4.嵌合抗原受体-t细胞疗法通过基因改造的t细胞靶向肿瘤细胞表面抗原，从而杀伤肿瘤细胞。相比较传统的手术放化疗，嵌合抗原受体-t细胞疗法靶向性更高；相比于抗体疗法，其具有更强的肿瘤杀伤作用，对恶性肿瘤的疗效更好。这一疗法在血液肿瘤中的成功也为其进入实体瘤治疗领域奠定了基础。鉴于cspg4在恶性实体瘤表面高表达，而在正常组织中表达很低，并且它在肿瘤的发生和转移过程中起重要作用，这使它成为很好的嵌合抗原受体-t细胞疗法的靶点。本公开中制备了靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体，并在结构上进行了优化。


技术实现要素：

5.本公开的目的在于提供一种靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)，表达该car的免疫效应细胞，以及他们在癌症诊断、治疗和预防方面的应用。
6.具体来讲，本公开提供了如下技术方案：
7.在一方面，本公开提供一种靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体(car)，所述car包含：抗cspg4结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域。
8.在一方面，本公开的car，其中，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:5-7或其任何变体的重链cdr，和/或选自氨基酸序列seq id no:10-12或其任何变体的轻链cdr，其特征在于：所
述抗cspg4结合结构域是人源化的。
9.根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域是人源化的是指所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的。
10.根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的是指，所述重链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:16-19或其任何变体的重链fr；和/或，所述轻链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:20-23或其任何变体的轻链fr。
11.根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的是指，所述重链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:16或其任何变体的重链fr1，选自氨基酸序列seq id no:17或其任何变体的重链fr2，选自氨基酸序列seq id no:18或其任何变体的重链fr3，选自氨基酸序列seq id no:19或其任何变体的重链fr4；和/或，选自氨基酸序列seq id no:20或其任何变体的轻链fr1，选自氨基酸序列seq id no:21或其任何变体的轻链fr2，选自氨基酸序列seq id no:22或其任何变体的轻链fr3，选自氨基酸序列seq id no:23或其任何变体的轻链fr4。
12.根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:5或其任何变体的重链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:6或其任何变体的重链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:7或其任何变体的重链cdr3；和/或，选自氨基酸序列seq id no:10或其任何变体的轻链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:11或其任何变体的轻链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:12或其任何变体的轻链cdr3。
13.根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:4或其任何变体的重链可变区序列；和/或，选自氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的轻链可变区序列。
14.根据前述任一方面的car，其中，其中，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4单链抗体(scfv)，优选地，所述抗cspg4单链抗体的氨基酸序列选自seq id no：2、14或其任何变体的氨基酸序列。
15.根据前述任一方面的car，其中，其中，所述抗cspg4单链抗体的重链和轻链通过接头可操作性地连接，优选地，所述接头包含选自氨基酸序列seq id no:15或其任何变体的氨基酸序列。
16.根据前述任一方面的car，其中，所述跨膜结构域选自tcr的α、β、ζ链，cd3ε，cd3ζ，cd4，cd5,cd8α，cd9，cd16，cd22，cd27，cd28，cd33，cd37，cd45，cd64，cd80，cd86，cd134，4-1bb，cd152，cd154，pd-1跨膜结构域中的一种或多种；优选地，所述跨膜结构域选自cd8α，cd4，cd45，pd-1，cd154，cd28跨膜结构域中的一种或多种；优选地，所述跨膜结构域选自cd8α，cd28跨膜结构域中的一种或多种；更优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列选自seq id no：27或其任何变体的氨基酸序列。
17.根据前述任一方面的car，其中，所述铰链区选自cd8的胞外铰链区、igg1 fc ch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28胞外铰链区、igg4 fc ch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区中的一种或多种；优选地，所述铰链区为cd8α铰链区；更优选地，所述铰链区的氨基酸序列选自seq id no：25或其任何变体的氨基酸序列。
18.根据前述任一方面的car，其中，所述信号转导结构域选自tcrξ，fcrγ，fcrβ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cd5，cd22，cd79a，cd79b，cd278(icos)，cd66d，cd3ζ胞内信号区中的一种或多种；优选地，所述信号转导结构域选自cd3ζ胞内信号区；更优选地，所述信号转导结构域的氨基酸序列选自seq id no：33或其任何变体的氨基酸序列；
19.根据前述任一方面的car，其中，所述信号转导结构域还包含一个或多个共刺激结构域；优选地，所述共刺激结构域选自card11，cd2，cd7，cd27，cd28，cd30，cd40，cd54，cd83，ox40，4-1bb，cd134，cd150，cd152，cd223，cd270，pd-l2，pd-l1，cd278，dap10，lat，nkd2c，slp76，trim，fcεriγ，myd88，4-1bb胞内信号区中的一种或多种；优选地，所述共刺激结构域选自4-1bb，cd134，cd28和ox40胞内信号区；优选地，所述共刺激结构域选自4-1bb，cd28胞内信号域中的一种或多种；更优选地，所述共刺激结构域的氨基酸序列选自seq id no：29、31或其任何变体的氨基酸序列。
20.在一方面，本公开提供一种分离的核酸分子，其包含编码前述任一方面的car的多核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列选自seq id no：1、13或其任何变体的核苷酸序列。
21.在一方面，本公开提供一种核酸构建体，其包含前述任一方面的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为病毒载体；更优选地，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的一种或几种。
22.在一方面，本公开提供一种病毒，其包含前述任一方面的核酸分子，或包含前述任一方面的核酸构建体；优选地，所述病毒为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的一种或几种。
23.在一方面，本公开提供前述任一方面的car、前述任一方面的核酸分子、前述任一方面的核酸构建体、前述任一方面的病毒，在制备靶向表达cspg4的肿瘤细胞的基因修饰的免疫细胞中的用途。
24.在一方面，本公开提供一种分离的宿主细胞，其表达前述任一方面的car，或包含前述任一方面的分离的核酸分子，或包含前述任一方面的核酸构建体，或包含前述任一方面的病毒；优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为t细胞、nk细胞、γδt细胞、nkt细胞、巨噬细胞或细胞系、pg13细胞系中的一种或多种；更优选地，所述宿主细胞为t细胞；最优选地，所述宿主细胞为原代培养的t细胞。
25.根据前述任一方面的宿主细胞，所述宿主细胞还表达其他效应分子，所述其他效应分子包括但不限于细胞因子、另一种car、趋化因子受体、降低pd-1表达的sirna或者阻断pd-l1的蛋白、tcr、安全开关中的一种或多种；
26.根据前述任一方面的宿主细胞，其中，所述的细胞因子选自tnf-α、tnf-β、vegf、tpo、ngf-β、pdgf、tgf-α、tgf-β、igf-i、igf
-ⅱ
、epo、m-csf、il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il-25、lif、flt-3、干扰素、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素中的一种或多种；
27.根据前述任一方面的宿主细胞，其中，所述趋化因子受体选自ccr2、ccr5、cxcr2、cxcr4中的一种或多种；
28.根据前述任一方面的宿主细胞，其中，所述安全开关选自hsvtk、vzvtk、icaspase-9、icaspase-1、icaspase-8、截短的egfr、rqr8的一种或多种。
29.在一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的car、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述的核酸构建体、权利要求13所述的病毒、权利要求15-16任一项所述的宿主细胞中的一种或多种，以及药学上可接受的载体。
30.前述任一方面的car、前述任一方面的核酸分子、前述任一方面的核酸构建体、前述任一方面的病毒、前述任一方面的宿主细胞，或者前述任一方面的药物组合物，在用于制备药物中的应用；优选地，所述药物用于诊断、治疗或预防癌症相关疾病；
31.优选地，所述药物用于诊断、治疗或预防表达cspg4的肿瘤；更优选地，所述药物用于诊断、治疗或预防选自脑癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、间皮瘤中的一种或多种；更优选地，所述脑癌选自脑胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、神经胶质瘤中的一种或多种，所述乳腺癌为三阴乳腺癌，所述头颈癌为头颈鳞状细胞癌。
32.本公开的有益效果包括：
33.本公开的靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体，以及表达该人源化嵌合抗原受体的免疫效应细胞，能够减少免疫排斥的产生，并保证改造后的cspg4嵌合抗原受体-t细胞疗法获得更好的疗效。
附图说明
34.图1、cspg4在不同肿瘤细胞系的表达
35.图2、cspg4在人脑胶质瘤样本中的表达
36.图3、靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体的基本结构
37.图4、靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体在t细胞上的表达
38.图5a、靶向cspg4的嵌合抗原受体-t细胞与肿瘤细胞的共培养对于肿瘤细胞的杀伤作用，流式细胞术检测
39.图5b、靶向cspg4的嵌合抗原受体-t细胞与肿瘤细胞的共培养对于肿瘤细胞的杀伤作用，流式细胞术检测量化结果
40.图6、靶向cspg4的嵌合抗原受体-t细胞杀伤肿瘤时的细胞因子水平
41.图7、靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体-t细胞在体内对脑胶质瘤的杀伤
42.图8、靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体-t细胞提高脑胶质瘤模型小鼠的存活率
具体实施方式
43.i.定义
44.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
45.也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
46.如本文使用的和除非另作说明，术语“大约”指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值
±
10％的变化，更优选
±
5％，甚至更优选
±
1％，和还要更优选
±
0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
47.如本文所用，术语“活化”指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的t细胞”等指的是经历细胞分裂的t细胞。
48.如本文所用，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本公开中的抗体可以以多种形式存在，包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2等，以及单链抗体和人源化抗体(harlow等，1999，using antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，ny；harlow等，1989，antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor,new york；houston等，1988，proc.natl.acad.sci.，usa 85：5879-5883；bird等，1988，science 242：423-426)。
49.如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双抗体、fd和fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，methods in molecular biology，vol 207：recombinant antibodies for cancer therapy methods and protocols(2003)；chapter 1；p3-25，kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108m-1的ka)抗原的抗体。“功能片段”或“抗cspg4抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段
″
含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等等。“fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(vh-vl二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdrs相互作用，以确定vh-vl二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个cdrs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的cdrs的fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。如本文中所用，术语“框架”或“fr”残基是指除本文定义为cdr残基的高变区残基外的那些可变结构域残基。
50.如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(smith et al.(2004)j.clin.pathol.57，912-917；和nelson et al.，j clin pathol(2000)，53，111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化b细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如ebv的病毒感染b细胞。重组技术还可以用来
在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
51.抗体“重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
52.抗体“轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
53.如本文所用，术语“scfv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区经由短的柔性多肽接头连接，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scfv可以以任一顺序(例如相对于多肽的n-末端和c末端)具有所述的vl和vh可变区，scfv可以包括vl-接头-vh或可以包括vh-接头-vl。
54.如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组dna技术产生或利用本领域可用和公知的合成dna或氨基酸序列技术获得。
55.如本文所用的术语“抗原”或“ag”被定义为激发免疫应答的分子，该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组dna。技术人员将理解任何dna——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本公开包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
56.如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
57.如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于脑癌(例如星形细胞瘤、脑膜瘤、少突神经胶质瘤、神经胶质瘤等)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、黑色素瘤、间皮瘤等。
58.如本文所用，术语“共刺激配体”包括特异性结合t细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，apc、树突细胞、b细胞等)上的分子，由此除了通过例如将tcr/cd3复合物与用肽负载的mhc分子结合提供的初级信号之外，还提供介导t细胞应答的信号，所述t细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可诱导的共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、结合toll配体受体的激动剂或抗体和与cspg4特异性结合的配体。共刺激配体
也包括，特别是与存在于t细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于与cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、cspg4和cd83特异性结合的抗体。
59.如本文所用，术语“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的t细胞上的关联结合伴侣，由此介导t细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖，共刺激分子包括但不限于mhc-i类分子、btla和toll配体受体。
60.如本文所用，术语“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如tcr/cd3连接作用，导致t细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
[0061]“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cdna或mrna中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rrna、trna和mrna)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mrna序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cdna的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cdna的蛋白质或其他产物。
[0062]
如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
[0063]
如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
[0064]“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0065]
如本文所用，术语“核酸构建体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。核酸构建体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。核酸构建体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0066]“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个dna分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数
×
100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。以例子说明，dna序列attgcc和tatggc享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
[0067]
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由b细胞表达的抗体有时被称为bcr(b细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为iga、igg、igm、igd和ige。iga为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。igg是最常见的循环抗体。igm是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。igd是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。ige是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜
碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
[0068]“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
[0069]
除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
[0070]
如本文所用，术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的dna序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
[0071]
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
[0072]
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
[0073]
术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
[0074]
如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和pcrtm等等克隆核酸序列，和合成手段。
[0075]
如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可包括蛋白质或肽的序列的最大数目的氨基酸没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0076]
如本文所用，术语“安全开关”是指一种工程化蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止不良效应。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的工程化细胞的安全问题，所述细胞已经将编码安全开关蛋白质的
基因永久性地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的且可能包括通过小分子介导的翻译后活化和组织特异性和/或按时转录调控来进行控制。所述安全开关能够介导细胞凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、dna复制、生长阻滞、转录和转录后基因调控，和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，所述安全开关蛋白质被外源分子(例如前药)活化，其活化时，触发治疗细胞发生细胞凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白质的实例包括但不限于hsvtk、vzvtk、icaspase-9、icaspase-1、icaspase-8、截短的egfr、rqr8等。在这种策略中，在不良事件情况下投与的前药被自杀基因产物活化且杀死经转导的细胞。
[0077]
如本文所用，术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别，或引导合成机器的dna序列。
[0078]
如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
[0079]“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
[0080]“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
[0081]“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
[0082]
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1
×
107m-1
或1x108m-1
或更大的亲和常数ka(或者1x10-7
m或1
×
10-8
m或更低的解离常数(kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(spr)(rich and myszka(2000)curr.opin.biotechnol 11：54；englebienne(1998)analyst.123：1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，paul，ed.，fundamental immunology，2nd ed.，raven press，new york，pages 332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性spr和itc方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，biacore 2000，biacore ab，upsala，sweden and ge healthcare life sciences；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27：335)。
[0083]
如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然发生状态中与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞。
[0084]
如本文所用的，术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
[0085]
如本文所用的，术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
[0086]“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
[0087]
如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代对象细胞和它的子代。
[0088]
如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
[0089]
ii.具体实施方式
[0090]
在一方面，本公开提供的能够靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体，以及表达靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体的免疫效应细胞；在具体的方面，表达靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体的免疫效应细胞为表达靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体的t细胞。
[0091]
在一方面，本公开的靶向cspg4的人源化嵌合抗原受体(car)包括抗cspg4结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:5-7或其任何变体的重链cdr，和/或选自氨基酸序列seq id no:10-12或其任何变体的轻链cdr，所述抗cspg4结合结构域是人源化的。
[0092]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域是人源化的是指所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的。
[0093]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的是指，所述重链可变区框架包含一下氨基酸残基的一种或多种：第3位氨基酸为q，第5位氨基酸为v，第6位氨基酸为q，第9位氨基酸为s，第16位氨基酸为a，第17位氨基酸为s，第20位氨基酸为v，第38位氨基酸为r，第40位氨基酸为a，第43位氨基酸为q，第46位氨基酸为e，第48位氨基酸为m，第63位氨基酸为g，第65位氨基酸为t，第69位氨基酸为v，第73位氨基酸为d，第84位氨基酸为s，第85位氨基酸为s，第87位氨基酸为k，第88位氨基酸为a，第93位氨基酸为v，第108位氨基酸为l；和/或，所述轻链可变区框架包含以下氨基酸残基的一种或多种：第3位氨基酸为v，第9位氨基酸为l，第10位氨基酸为s，第12位氨基酸为p，第18位氨基酸为p，第19位氨基酸为a，第21位氨基酸为i，第37位氨基酸为l，第40位氨基酸为p，第41位氨基酸为g，第42位氨基酸为q，第45位氨基酸为q，第58位氨基酸为v，第59位氨基酸为d，第63
位氨基酸为s，第74位氨基酸为k，第76位氨基酸为s，第77位氨基酸为r，第79位氨基酸为e，第80位氨基酸为a，第83位氨基酸为v，第85位氨基酸为v，第100位氨基酸为q，第108位氨基酸为t。
[0094]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的是指，所述重链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:16-19或其任何变体的重链fr；和/或，所述轻链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:20-23或其任何变体的轻链fr。
[0095]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域的可变区框架是人源化的是指，所述重链可变区框架包含选自氨基酸序列seq id no:16或其任何变体的重链fr1，选自氨基酸序列seq id no:17或其任何变体的重链fr2，选自氨基酸序列seq id no:18或其任何变体的重链fr3，选自氨基酸序列seq id no:19或其任何变体的重链fr4；和/或，选自氨基酸序列seq id no:20或其任何变体的轻链fr1，选自氨基酸序列seq id no:21或其任何变体的轻链fr2，选自氨基酸序列seq id no:22或其任何变体的轻链fr3，选自氨基酸序列seq id no:23或其任何变体的轻链fr4。
[0096]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:5或其任何变体的重链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:6或其任何变体的重链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:7或其任何变体的重链cdr3；和/或，选自氨基酸序列seq id no:10或其任何变体的轻链cdr1，选自氨基酸序列seq id no:11或其任何变体的轻链cdr2，选自氨基酸序列seq id no:12或其任何变体的轻链cdr3。
[0097]
根据前述任一方面的car，其中，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包含选自氨基酸序列seq id no:4或其任何变体的重链可变区序列；和/或，选自氨基酸序列seq id no:9或其任何变体的轻链可变区序列。
[0098]
根据前述任一方面的car，所述抗cspg4结合结构域包含抗cspg4单链抗体(scfv)，所述单链抗体中连接轻链和重链的接头是人源化的，优选地，所述接头包含选自氨基酸序列seq id no:15或其任何变体的氨基酸序列。
[0099]
根据前述任一方面的car，所述抗cspg4单链抗体来源于针对cspg4蛋白片段产生的单克隆抗体。
[0100]
根据前述任一方面的car，所述抗cspg4单链抗体的氨基酸序列包含选自seq id no：2、14或其任何变体的氨基酸序列。
[0101]
在一方面，人源化的抗cspg4结合结构域，其与前述任一方面的抗cspg4单链抗体部分具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
[0102]
根据前述任一方面的car，所述跨膜结构域选自tcr的α、β、ζ链，cd3ε，cd3ζ，cd4，cd5,cd8α，cd9，cd16，cd22，cd27，cd28，cd33，cd37，cd45，cd64，cd80，cd86，cd134，4-1bb，cd152，cd154，pd-1跨膜结构域中的一种或多种；优选地，所述跨膜结构域选自cd8α，cd4，cd45，pd-1，cd154，cd28跨膜结构域中的一种或多种；更优选地，所述跨膜结构域选自cd8α，cd28跨膜结构域中的一种或多种；更优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列选自seq id no：27或其任何变体的氨基酸序列。
[0103]
根据前述任一方面的car，所述铰链区选自cd8的胞外铰链区、igg1 fc ch2ch3铰
链区、igd铰链区、cd28胞外铰链区、igg4 fc ch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区中的一种或多种；优选地，所述铰链区为cd8α铰链区；更优选地，所述铰链区的氨基酸序列选自seq id no：25或其任何变体的氨基酸序列。
[0104]
根据前述任一方面的car，所述信号转导结构域选自tcrξ，fcrγ，fcrβ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cd5，cd22，cd79a，cd79b，cd278(icos)，cd66d，cd3ζ胞内信号区中的一种或多种；优选地，所述信号转导结构域选自cd3ζ胞内信号区；更优选地，所述信号转导结构域的氨基酸序列选自seq id no：33或其任何变体的氨基酸序列。
[0105]
根据前述任一方面的car，所述信号转导结构域还包含一个或多个共刺激结构域；优选地，所述共刺激结构域选自card11，cd2，cd7，cd27，cd28，cd30，cd40，cd54，cd83，ox40，4-1bb，cd134，cd150，cd152，cd223，cd270，pd-l2，pd-l1，cd278，dap10，lat，nkd2c，slp76，trim，fcεriγ，myd88，41bbl胞内信号区中的一种或多种；更优选地，所述共刺激结构域选自4-1bb，cd134，cd28和ox40胞内信号区；更优选地，所述共刺激信号域选自4-1bb，cd28胞内信号域中的一种或多种；更优选地，所述共刺激结构域的氨基酸序列选自seq id no：29、31或其任何变体的氨基酸序列。
[0106]
在另一方面，本公开还提供一种靶向cspg4的单链抗体(scfv)；具体地，所述scfv来源于针对cspg4蛋白片段产生的单克隆抗体；更具体地，所述scfv的氨基酸序列包含选自seq id no:2、14或其任何变体的氨基酸序列。
[0107]
在一方面，所述靶向cspg4的scfv的编码基因包含选自seq id no:1、13或其任何变体的核苷酸序列。
[0108]
在一方面，本公开提供编码如前述任一方面的car或scfv的核酸分子；优选地，所述编码scfv的核酸分子的核苷酸序列选自seq id no：1、13或与其具有至少大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸分子。
[0109]
在一方面，本公开提供一种核酸构建体，其包含前述任一方面的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为病毒载体；更优选地，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体中的一种或几种。
[0110]
在一方面，本公开提供一种病毒，其包含前述任一方面的核酸分子，或包含前述任一方面的核酸构建体；优选地，所述病毒为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的一种或几种。
[0111]
在一方面，本公开提供一种分离的宿主细胞，其表达前述任一方面的car，或包含前述任一方面的核酸构建体，或包含前述任一方面的病毒；优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为t细胞、nk细胞、γδt细胞、nkt细胞、巨噬细胞或细胞系、pg13细胞系中的一种或多种；更优选地，所述宿主细胞为t细胞；最优选地，所述宿主细胞为原代培养的t细胞。
[0112]
在一方面，所述宿主细胞还表达其他效应分子，所述其他效应分子包括但不限于细胞因子、另一种car、趋化因子受体、降低pd-1表达的sirna或者阻断pd-l1的蛋白、tcr、安全开关中的一种或多种；优选地，所述的细胞因子选自tnf-α、tnf-β、vegf、tpo、ngf-β、pdgf、tgf-α、tgf-β、igf-i、igf
-ⅱ
、epo、m-csf、il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、
il-25、lif、flt-3、干扰素、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素中的一种或多种；优选地，所述趋化因子受体选自ccr2、ccr5、cxcr2、cxcr4中的一种或多种；优选地，所述安全开关选自hsvtk、vzvtk、icaspase-9、icaspase-1、icaspase-8、截短的egfr、rqr8的一种或多种。
[0113]
在一方面，本公开提供一种表达靶向cspg4的嵌合抗原受体的免疫效应细胞；具体的，本公开提供一种表达靶向cspg4的嵌合抗原受体的t细胞(car-t)；更具体地，所述t细胞是活化的t细胞；更具体地，所述t细胞的活化通过cd3和/或cd28抗体的刺激完成。
[0114]
在一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含前述任一方面的car、核酸分子、核酸构建体、病毒、细胞中的一种或多种，以及药学上可接受的载体。
[0115]
应当理解，根据所述实施方案的治疗剂将与合适的药学上可接受的载体、赋形剂、以及其它被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂一同施用。大量适当的制剂可见于所有药物化学工作者已知的药典中：remington's pharmaceutical science(第15版，mack publishing company,easton,pa.(1975))，特别是其中blaug、seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)载体(例如lipofectintm)、dna缀合物、无水吸浆、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶以及含有聚乙二醇的半固态混合物。任何前述混合物均可适用于根据本公开的治疗或疗法，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂在生理学上是相容的并耐受给药途径。
[0116]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适的药学上可接受的载体描述于最新版的remington's pharmaceutical sciences中，这是本领域的标准参考书目，其以引用方式并入本文。此类载体或稀释剂的优选示例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和1～10％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，例如固定化油。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域熟知的。除去任何常规的介质或试剂与抗体不相容之外，设想其在组合物中的用途。
[0117]
进一步地，本公开提供的一种药物组合物可用来治疗癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病等与炎性因子相关的疾病。
[0118]
在一方面，前述任一方面的car、核酸分子、核酸构建体、病毒、细胞、药物组合物，在制备用于癌症的诊断、治疗或预防药物中的应用。
[0119]
在一个实施方案中，可将所述药物用作治疗剂。此类试剂将通常用于诊断、治疗、缓解和/或预防受试者的与异常cspg4表达、活性和/或信号转导相关的疾病或病理。可使用标准方法通过鉴定受试者，例如患有(或处于风险或发展)与异常cspg4表达、活性和/或信号转导相关的疾病或障碍，例如癌症或其它赘生性障碍的人患者来实施治疗方案。将特异性结合靶标抗原(例如cspg4)的抗体或抗体片段作为本公开的嵌合抗原受体(car)，优选对其靶标抗原(例如cspg4)有高特异性和高亲和性的抗体制备本公开的car，优选地，进一步利用制备的car对免疫细胞(例如t细胞)进行基因修饰。通过施用本公开的car和/或基因修饰的免疫细胞可消除、抑制或妨碍靶标(例如cspg4)的表达、活性和/或信号转导功能。通过施用本公开的car和/或基因修饰的免疫细胞可消除或抑制或妨碍靶标(例如cspg4)与其所天然结合的内源性的配体结合，例如，通过施用本公开的car和/或基因修饰的免疫细胞之后可以调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和、或以其它方式妨碍cspg4表达、活性和/或信号转
导。在一些实施方案中，为治疗与异常cspg4表达相关的疾病或障碍，可将抗cspg4抗体重链和轻链cdr的抗体或抗体片段制备成本公开的car和/或基因修饰的免疫细胞施用给受试者。在一个实施方案中，与异常cspg4表达相关的疾病或障碍可为癌症。
[0120]
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
[0121]
实施例
[0122]
实施例1：cspg4在肿瘤细胞系中的表达检测
[0123]
为了确定cspg4抗原在肿瘤中的表达情况，首先选择了黑色素瘤(wm-266-4细胞系)、胶质瘤(ln-229、u87-mg细胞系)和乳腺癌(mda-mb-231细胞系)的肿瘤细胞系来检测。同时，为了进一步验证cspg4在原代脑胶质瘤中的表达，利用免疫组化的方法用cspg4的抗体检测了包含多个病人脑胶质瘤组织以及正常组织的切片。
[0124]
方法：收集肿瘤细胞后利用1xpbs洗三次，然后用cspg4抗体在冰上染色30分钟，1xpbs洗后加入apc偶联的二抗，室温孵育20分钟，1xpbs洗后用流式细胞术检测b7-h3在肿瘤细胞上的表达。
[0125]
免疫组化染色：石蜡切片经二甲苯脱蜡与酒精复水后，利用柠檬酸钠进行抗原修复。之后在血清中封闭1小时。cspg4抗体染色在4℃过夜，然后由辣根过氧化酶偶联的二抗孵育30分钟。洗涤后用dab显色，然后用苏木精染色。染色完成后在显微镜下观察拍照。
[0126]
结果：从图1可以看出，在检测的肿瘤细胞表明均有cpsg4的高表达。
[0127]
从图2可以看出，在所有的病人的脑胶质瘤样本中均检测到了不同程度的cspg4的表达，而在正常脑组织中未见cspg4的表达。这表明cspg4是针对脑胶质瘤疗法的较好的靶点。
[0128]
实施例2：细胞培养
[0129]
本公开中所用的细胞系包括293t细胞，其培养在含有10％fbs，1％glutamax,1％双抗的imdm培养基里。wm-266-4,ln-229,u87-mg和mda-mb-231细胞培养基为10％fbs的rpmi640或者dmem中。gfp阳性的细胞由编码gfp的逆转录病毒转染制备，小鼠用的肿瘤细胞系由编码luciferase或者gfp-firefly luciferase(gfp-ffluc)的慢病毒或逆转录病毒转染而成。
[0130]
实施例3：嵌合抗原受体的构建
[0131]
现有的针对cspg4的嵌合抗原受体衍生自鼠源单克隆抗体763.74(wo2015080981)，然而考虑到鼠源抗体或者嵌合抗原受体会在人体内引起“人抗鼠”的抗体，从而极大的减弱抗体或者嵌合抗原受体-t细胞的疗效。鉴于以上考虑，本公开针对由763.74抗体衍生的嵌合抗原受体进行了人源化，同时也针对原有嵌合抗原受体的结构进行了优化(原鼠源嵌合抗原受体(mcspg4)为重链-轻链结构，人源化后的嵌合抗原受体为重链-轻链(hcspg4-hl)和轻链-重链(hcspg4-lh)两种结构，参见图3)并与鼠源嵌合抗原受体进行了功能上的比较。
[0132]
本公开的抗cspg4的人源化嵌合抗原受体由单链抗体区，cd8alpha铰链区，cd8alpha跨膜区，cd28或者4-1bb共刺激因子区和cd3zeta信号转导区组成。嵌合抗原受体的单链抗体区是由763.74的抗体序列进行人源化后衍生而来。嵌合抗原受体由基因合成的
方法产生，然后克隆到逆转录病毒载体中。克隆完成后通过测序确认其序列的正确性。
[0133]
表1、序列表：
[0134]
seq id no.1：人源化cspg4-hl(hcspg4-hl)单链抗体区核酸序列
[0135]
atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgctctagacaggttcagctggtgcagtctggcagcgagctgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacacattcaccgactacagcatgcactgggtccgaaaggcccctggacagggacttgaatggatgggctggatcaacaccgccacaggcgagcctacctacgccgatggcttcacaggcagattcgtgatcagcctggacaccagcgccagaaccgtgtacctgcagatcagctctctgaaggccgaggataccgccgtgtacttctgcttcagctactacgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggatccgacatcgtgctgacacagagccctctgagcctgcctgttacacctggcgagcctgccagcatcagctgtagagccagccagaccatctacaagaacctgcactggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgattaagtacggcagcgacagcatctccggcgtgccagatagattcagcggctctggctctggcaccgactacaccctgaagatcagcagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgtctgcaaggctacagcaccccttggacattcggccagggcaccaagctggaaatcaag
[0136]
seq id no.2：人源化cspg4-hl(hcspg4-hl)单链抗体区蛋白序列
[0137]
mefglswlflvailkgvqcsrqvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftdysmhwvrkapgqglewmgwintatgeptyadgftgrfvisldtsartvylqisslkaedtavyfcfsyydywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggsdivltqsplslpvtpgepasiscrasqtiyknlhwylqkpgqspqllikygsdsisgvpdrfsgsgsgtdytlkisrveaedvgvyyclqgystpwtfgqgtkleik
[0138]
seq id no.3：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链核酸序列
[0139]
caggttcagctggtgcagtctggcagcgagctgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacacattcaccgactacagcatgcactgggtccgaaaggcccctggacagggacttgaatggatgggctggatcaacaccgccacaggcgagcctacctacgccgatggcttcacaggcagattcgtgatcagcctggacaccagcgccagaaccgtgtacctgcagatcagctctctgaaggccgaggataccgccgtgtacttctgcttcagctactacgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttct
[0140]
seq id no.4：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链蛋白序列
[0141]
qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftdysmhwvrkapgqglewmgwintatgeptyadgftgrfvisldtsartvylqisslkaedtavyfcfsyydywgqgtlvtvss
[0142]
seq id no.5：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链cdr1蛋白序列
[0143]
gytftdys
[0144]
seq id no.6：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链cdr2蛋白序列
[0145]
intatgep
[0146]
seq id no.7：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链cdr3蛋白序列
[0147]
fsyydy
[0148]
seq id no.8：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链核酸序列
[0149]
gacatcgtgctgacacagagccctctgagcctgcctgttacacctggcgagcctgccagcatcagctgtagagccagccagaccatctacaagaacctgcactggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgattaagtacggcagcgacagcatctccggcgtgccagatagattcagcggctctggctctggcaccgactacaccctgaagatcagcagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgtctgcaaggctacagcaccccttggacattcggccag
ggcaccaagctggaaatcaag
[0150]
seq id no.9：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链蛋白序列
[0151]
divltqsplslpvtpgepasiscrasqtiyknlhwylqkpgqspqllikygsdsisgvpdrfsgsgsgtdytlkisrveaedvgvyyclqgystpwtfgqgtkleik
[0152]
seq id no.10：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链cdr1蛋白序列
[0153]
rasqtiyknlh
[0154]
seq id no.11：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链cdr2蛋白序列
[0155]
ygsdsis
[0156]
seq id no.12：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链cdr3蛋白序列
[0157]
lqgystpwt
[0158]
seq id no.13：人源化cspg4-lh(hcspg4-lh)单链抗体区核酸序列
[0159]
atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctattttaaaaggtgtccagtgctctagagacatcgtgctgacacagagccctctgagcctgcctgttacacctggcgagcctgccagcatcagctgtagagccagccagaccatctacaagaacctgcactggtatctgcagaagcccggccagtctcctcagctgctgattaagtacggcagcgacagcatctccggcgtgccagatagattcagcggctctggctctggcaccgactacaccctgaagatcagcagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgtctgcaaggctacagcaccccttggacattcggccagggcaccaagctggaaatcaagggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggttcagctggtgcagtctggcagcgagctgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggctagcggctacacattcaccgactacagcatgcactgggtccgaaaggcccctggacagggacttgaatggatgggctggatcaacaccgccacaggcgagcctacctacgccgatggcttcacaggcagattcgtgatcagcctggacaccagcgccagaaccgtgtacctgcagatcagctctctgaaggccgaggataccgccgtgtacttctgcttcagctactacgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttct
[0160]
seq id no.14：人源化cspg4-lh(hcspg4-lh)单链抗体区蛋白序列
[0161]
mefglswlflvailkgvqcsrdivltqsplslpvtpgepasiscrasqtiyknlhwylqkpgqspqllikygsdsisgvpdrfsgsgsgtdytlkisrveaedvgvyyclqgystpwtfgqgtkleikggggsggggsggggsggggsqvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftdysmhwvrkapgqglewmgwintatgeptyadgftgrfvisldtsartvylqisslkaedtavyfcfsyydywgqgtlvtvss
[0162]
seq id no.15：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体接头蛋白序列
[0163]
ggggsggggsggggsggggs
[0164]
seq id no.16：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链fr1蛋白序列
[0165]
qvqlvqsgselkkpgasvkvsckas
[0166]
seq id no.17：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链fr2蛋白序列
[0167]
mhwvrkapgqglewmgw
[0168]
seq id no.18：人源化cspg4l(hcspg4)单链抗体重链fr3蛋白序列
[0169]
tyadgftgrfvisldtsartvylqisslkaedtavyfc
[0170]
seq id no.19：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体重链fr4蛋白序列
[0171]
wgqgtlvtvss
[0172]
seq id no.20：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链fr1蛋白序列
[0173]
divltqsplslpvtpgepasisc
[0174]
seq id no.21：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链fr2蛋白序列
[0175]
wylqkpgqspqllik
[0176]
seq id no.22：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链fr3蛋白序列
[0177]
gvpdrfsgsgsgtdytlkisrveaedvgvyyc
[0178]
seq id no.23：人源化cspg4(hcspg4)单链抗体轻链fr4蛋白序列
[0179]
fgqgtkleik
[0180]
seq id no.24：cd8α铰链区核酸序列
[0181]
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat
[0182]
seq id no.25：cd8α铰链区蛋白序列
[0183]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
[0184]
seq id no.26：cd8α跨膜区核酸序列
[0185]
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
[0186]
seq id no.27：cd8α跨膜区蛋白序列
[0187]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc
[0188]
seq id no.28：cd28共刺激因子核酸序列
[0189]
aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
[0190]
seq id no.29：cd28共刺激因子蛋白序列
[0191]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs
[0192]
seq id no.30：4-1bb共刺激因子核酸序列
[0193]
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagagg
[0194]
aagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
[0195]
seq id no.31：4-1bb共刺激因子蛋白序列
[0196]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0197]
seq id no.32：cd3ζ信号转导区核酸序列
[0198]
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
[0199]
seq id no.33：cd3ζ信号转导区蛋白序列
[0200]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0201]
实施例4：嵌合抗原受体的逆转录病毒的制备
[0202]
鼠白血病逆转录病毒(mmlv)的制备采用三质粒系统瞬时转染293t细胞。转染48和72小时后，收取293t细胞上清用于感染t细胞。
[0203]
实施例5：表达靶向cpsg4的人源化嵌合抗原受体-t细胞的制备
[0204]
1、t细胞的转染与扩增
[0205]
健康人捐献的血用来分离外周血单核细胞。利用淋巴细胞密度梯度分离法分离单核细胞。分离的单核细胞由cd3和cd28的抗体激活后，用收集的逆转录病毒转染t细胞。然后将嵌合抗原受体转染的t细胞进行扩增，用于检测嵌合抗原受体表达和肿瘤杀伤。
[0206]
2、cspg4嵌合抗原受体表达检测
[0207]
收取部分扩增中的嵌合抗原受体-t细胞，利用生物素标记的protein l来检测cspg4嵌合抗原受体的表达，二抗为藻红素标记的亲和素。利用流式细胞术来检测嵌合抗原受体在t细胞上的表达。
[0208]
结果：从图4可以看出，鼠源(mcspg4)或者人源化的(hcspg4-hl或者hcspg4-lh)cspg4嵌合抗原受体(cd28或者4-1bb共刺激域)均能在人的t细胞上表达。鼠源的嵌合抗原受体表达略高于人源化受体，主要是由于嵌合抗原受体人源化后引起的染色试剂结合减弱。
[0209]
实施例6：cpsg4的人源化嵌合抗原受体-t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(细胞共培养)
[0210]
为了比较本公开改造的嵌合抗原受体能否与原有的鼠源受体一样能够介导t细胞对于高表达cspg4的肿瘤细胞的杀伤，设计了共培养实验测试三种嵌合抗原受体-t细胞(mcpsg4、hcpsg4-hl、hcpsg4-lh)对各种肿瘤细胞的杀伤情况。在肿瘤细胞贴壁后，加入表达对照(针对cd19的嵌合抗原受体)，鼠源和两种人源化的cspg4嵌合抗原受体的t细胞，然后流式细胞术检测它们对黑色素瘤、胶质瘤和乳腺癌细胞的杀伤情况。
[0211]
方法：在24孔板中接种每孔1-2x105的gfp标记的肿瘤细胞，24小时后按照不同比例加入相应数量的t细胞。7天后收取孔中的细胞，利用流式细胞术检测残留的细胞。其中t细胞利用cd3来检测，肿瘤细胞利用gfp来检测。
[0212]
结果：如图5a、图5b所示，鼠源cspg4嵌合抗原受体-t细胞对三种肿瘤细胞表现出一定的杀伤。而与之相比，本公开的人源化的cspg4嵌合抗原受体的t细胞在与三种肿瘤细胞共培养中都能更有效的杀灭肿瘤细胞，特别是结构优化的人源化cspg4嵌合抗原受体(hcspg4-lh)能够完全杀灭肿瘤细胞。
[0213]
实施例7：cpsg4的人源化嵌合抗原受体-t细胞在肿瘤细胞杀伤过程中对细胞因子释放的影响
[0214]
方法：酶联免疫吸附试验(elisa)
[0215]
在肿瘤细胞与嵌合抗原受体-t细胞共培养的实验中加入t细胞后24小时，收取上清。利用elisa的试剂盒检测上清中的细胞因子。
[0216]
结果：与细胞毒实验结果一致，从图6可见，与鼠源受体释放的较低的th1类细胞因子(ifn-gamma,il-2)相比，本公开改造和优化的人源化的cspg4嵌合抗原受体的t细胞却在杀伤过程中释放更高水平的细胞因子，表明人源化改造和结构优化的cspg4嵌合抗原受体相比原有的鼠源受体对cspg4高表达的肿瘤具有更好的杀伤效果。
[0217]
实施例8：异体移植小鼠实验
[0218]
为了确定本公开改造和优化的cspg4人源化的嵌合抗原受体的t细胞在体内对肿瘤的杀伤作用，选择了小鼠的脑胶质瘤模型。在裸鼠脑内注射入luciferase标记的肿瘤细
胞，在肿瘤形成后再在脑室内注射对照(靶向cd19的嵌合抗原受体)和靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体的t细胞，然后成像检测t细胞对肿瘤的清除情况和治疗小鼠的存活情况。
[0219]
方法：cspg4人源化的嵌合抗原受体-t细胞靶向脑胶质瘤的体内实验在6-8周的裸鼠中完成。在裸鼠的脑中用立体定位的方式先植入gfp-ffluc标记的肿瘤细胞系，2-3周后先在体内成像系统中确认肿瘤移植成功后，脑室内注射对照或者靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体-t细胞。之后每周成像一次，观察t细胞对肿瘤的杀伤情况。
[0220]
体内存活实验中利用立体定位在小鼠脑原位注射gfp-ffluc标记的ln-229细胞，44天后脑室内注射溶剂pbs、对照cd19.28.car-t以及靶向cspg4的鼠源(mcspg4)和人源化(hcspg4-hl、hcspg4-lh)的car-t细胞。之后每周测量小鼠的体重，记录小鼠的死亡时间。
[0221]
结果：如图7所示，与对照组的肿瘤持续生长相比，本公开改造优化的cspg4嵌合抗原受体的t细胞能够在大多数小鼠中清除肿瘤，并在一定时间内控制肿瘤不能复发。此结果表明靶向cspg4的人源化的嵌合抗原受体的t细胞能够在体内杀伤肿瘤并控制肿瘤复发。
[0222]
同时检测了经历对照与靶向cspg4嵌合抗原受体的t细胞治疗的ln-229的脑胶质瘤小鼠的存活率。如图8所示，与对照pbs和cd19.28 car-t相比，鼠源cspg4 car-t(mcspg4)能够一定程度上延长小鼠的生存时间，而本公开的人源化的cspg4 car-t(hcspg4-hl和hcspg4-lh)都比鼠源car-t取得了更好的治疗效果，尤其是结构优化的hcspg4-lh car-t更显著延长了小鼠的生存时间，证明本发明的人源化的cspg4 car-t能够表现出比原有鼠源car-t对肿瘤更好的治疗效果。