用于高水平表达外源基因的表达载体的制作方法

1.本公开涉及一种基因表达载体，特别是一种介导外源基因在细胞中高效表达的载体及其应用。


背景技术：

2.利用载体将外源基因递送至特定的组织或者细胞，通过表达的外源蛋白或者非编码的rna分子治疗或者预防遗传疾病、肿瘤、退行性病变等疾病，是一种前景广阔的治疗方式。
3.病毒载体是近年发展迅猛的一种基因递送载体，其中腺相关病毒(aav)的载体由于低免疫原性、非整合性和介导外源基因长期表达的特性逐渐成为最佳的基因治疗载体选择。
4.研究者已经开发出了cmv和cag等转录活性较高的启动子，已提高外源基因表达效率。但是哺乳动物细胞中的基因表达水平受到转录水平、转录后mrna稳定性、翻译水平和翻译后蛋白稳定性等多个水平的调控。因此，在需要递送外源基因至哺乳动物细胞中时，例如在基因治疗，可以从上述的多个角度进行优化，比如基因转录和翻译调控元件、外源基因的拷贝数、外源基因在宿主细胞基因组中的整合位点、rna的加工和mrna的稳定性、宿主细胞本身对蛋白的翻译修饰等。
5.因此，需要用于在细胞中，特别是在哺乳动物细胞中表达基因的经过改进的方法和经过优化的表达载体，以保障外源基因的长期高水平表达。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种本发明提出了包含多种促进和维持外源基因表达的序列元件，以保障外源基因的长期高水平表达。
7.因此，在一方面，本公开提供了一种增强基因表达的调控核酸分子，所述调控核酸分子按5'到3'顺序包含腺病毒的三联前导序列(tpl)和腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(emlp)，其中：
8.所述腺病毒的三联前导序列(tpl)具有选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示的tpl序列或与其具有至少85％同一性的序列；
9.所述腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(emlp)具有选自seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8所示的emlp序列或与其具有至少85％同一性的序列。
10.在一方面，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体按5'到3'顺序包含：
11.(a)启动子区；
12.(b)5'utr区；
13.(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
14.(d)多腺苷酸化区(polya)；
15.其中，所述5'utr区包含前述的调控核酸分子；
16.所述编码序列可操作地连接到所述启动子区。
17.在一方面，本公开提供了一种重组病毒，其包含：
18.a)衣壳蛋白；以及
19.b)前述的表达载体。
20.在一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含前述的表达载体和/或重组病毒和药学上可接受的赋形剂。
21.在一方面，本公开提供了一种用前述的表达载体转染或转导的分离的宿主细胞。
22.在一方面，本公开提供了一种用前述的重组病毒感染的分离的宿主细胞。
23.在一方面，本公开提供了一种用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法，所述方法包含使一个或多个哺乳动物细胞与一定量的前述的表达载体和/或重组病毒接触，其中以一定水平在所述一个或多个哺乳动物细胞中表达所述分泌多肽。
24.在一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防有疾病治疗或预防需要的哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的表达载体、重组病毒、药物组合物和/或宿主细胞。
25.本发明可以显著提高aflibercept的表达水平，相对于单纯的cmv启动子/增强子启动aflibercept表达框的载体，可以将胞内的aflibercept蛋白表达水平提高数十倍以上，将分泌型的aflibercept蛋白水平提高数倍。
附图说明
26.图1示出了本公开的ao表达载体的结构。
27.图2示出了aflibercept表达载体转染293t细胞(图2a)和arpe-19细胞(图2b)后细胞内的aflibercept蛋白水平。
28.图3示出了aflibercept表达载体转染293t细胞(图2a)和arpe-19细胞(图2b)后上清中的aflibercept蛋白水平。
29.图4示出了aav病毒感染arpe-19细胞后细胞内的aflibercept蛋白水平。
30.图5a示出了aav病毒感染arpe-19细胞后细胞内的平均aav基因组拷贝数；图5b示出了aav病毒感染arpe-19细胞后，细胞内每个aav病毒基因组拷贝对应的上清中分泌性aflibercept蛋白水平。
31.图6示出了aflibercept表达载体转染或aav病毒感染293t细胞和arpe-19细胞后细胞内及分泌性aflibercept的相关性分析。
32.图7示出了bn大鼠视网膜注射ao病毒后细胞内及分泌性aflibercept蛋白水平，其中，blk为未注射ao病毒的对照大鼠眼球取材样品；b2_20r、b2_21r和b2_22r为注射了ao-1病毒的大鼠眼球取材；b2_26r、b2_26l和b2_29l为注射了ao-2病毒的大鼠眼球取材；b2_30l、b2_31l和b2_32r为注射了ao-3病毒的大鼠眼球取材；b2_37r、b2_36l、b2_38r和b2_39l为注射了ao-4病毒的大鼠眼球取材。
具体实施方式
33.定义
34.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术
人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
35.如本文所使用的，“载体”是指高分子或高分子的缔合，所述高分子或高分子的缔合包括多核苷酸或与所述多核苷酸相关并且可以用于介导向细胞递送所述多核苷酸。说明性载体包含例如质粒、病毒载体(即病毒，如腺相关病毒)、脂质体和其它基因递送媒剂。
36.术语“aav”是腺相关病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有要求。术语“aav”包含aav 1型(aav-1)、aav 2型(aav-2)、aav 3型(aav-3)、aav 4型(aav-4)、aav 5型(aav-5)、aav 6型(aav-6)、aav 7型(aav-7)、aav 8型(aav-8)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、灵长类动物aav、非灵长类动物aav以及绵羊aav。“灵长类动物aav”是指感染灵长类动物的aav，“非灵长类动物aav”是指感染非灵长类哺乳动物的aav，“牛aav”是指感染牛哺乳动物的aav等。
[0037]“aav病毒”或“aav病毒颗粒”或“raav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白(通常由野生型aav的所有衣壳蛋白组成)和衣壳化多核苷酸构成的病毒颗粒。如果颗粒包括异源多核苷酸(即，除野生型aav基因组以外的多核苷酸，如要递送到哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为重组aav载体或raav。通常，异源多核苷酸侧接有aav反向末端重复序列(itr)。
[0038]
如本文所使用的，关于本发明的aav病毒载体的术语“复制缺陷”意指aav载体不能独立地复制和包装其基因组。例如，当受试者的细胞感染raav病毒粒子时，异源基因在受感染的细胞中表达，然而，由于受感染的细胞缺乏aav rep和cap基因和辅助功能基因这一事实，raav不能进一步复制。
[0039]
如本文所使用的，“aav变体”或“aav突变体”是指由变体aav衣壳蛋白构成的病毒颗粒，其中变体aav衣壳蛋白包括至少一个相对于对应的亲本aav衣壳蛋白的氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，并且其中变体衣壳蛋白赋予视网膜细胞与包括对应的亲本aav衣壳蛋白的aav病毒粒子的视网膜细胞的感染性相比增加的感染性，其中aav衣壳蛋白不包括天然存在的aav衣壳蛋白中存在的氨基酸序列。可以将本公开的多核苷酸表达载体包装在变体aav颗粒中，以促进将表达载体递送到靶组织中的特定细胞类型(例如，视网膜细胞)。
[0040]
如本文所使用的，术语“包装”指导致aav颗粒装配和壳体化的一系列胞内事件。
[0041]
如本文所使用的，术语aav“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和壳体化蛋白的多核苷酸序列。本文将aav rep和cap称为aav“包装基因”。
[0042]
如本文所使用的，术语aav的“辅助病毒”指允许哺乳动物细胞复制并包装aav(例如野生型aav)的病毒。在本领域中已知aav的多种此类辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。虽然c亚类的5型腺病毒最常用，但是腺病毒涵盖许多不同亚类。已知人、非人类哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒并且可从贮藏所例如atcc获得。疱疹家族的病毒包括(例如)单纯疱疹病毒(hsv)和埃-巴二氏病毒(epstein-barr viruses)(ebv)以及巨细胞病毒(cmv)和假狂犬病病毒(prv)；也可从贮藏所例如atcc获得。
[0043]
如本文所使用的，术语“辅助病毒功能”指辅助病毒基因组中编码的允许aav复制和包装(连同对本文所述复制和包装的其它要求)的功能。如本文所述，可以多种方式提供“辅助病毒功能”，包括通过提供辅助病毒或为生产细胞提供(例如)编码必需功能的反式多核苷酸序列。例如，将包含编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列的质粒或其它表达载体连同raav载体一起转染至生产细胞中。
[0044]
如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指对体外或体内基因产物进行编码的核苷酸序列。术语“转基因”是指通过载体递送到细胞中的编码序列或基因。编码序列或基因可以对肽或多肽分子进行编码。
[0045]
如本文所使用的，“治疗性基因”和“治疗性蛋白质”是指基因或蛋白质在表达时赋予其存在的细胞或组织或哺乳动物有益效果，所述基因或蛋白质在所述哺乳动物中表达。有益效果的实例可以是减轻或改善病状或疾病的体征或症状、预防或抑制病状或疾病或赋予所期望的特征。治疗性基因和蛋白质包含纠正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因和蛋白质。
[0046]
本发明的表达载体、重组病毒或药物组合物的“治疗有效量”或“有效量”是足以导致受试者的疾病或医学病状的一个或多个体征或症状减轻的量，其中受试者可以是人或非人哺乳动物。
[0047]
如本文所使用的，术语“基因产物”是指多核苷酸序列(如肽或蛋白质)的所期望的表达产物。
[0048]
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸聚合物。术语“肽”是指约50个或更少氨基酸的氨基酸聚合物。所述术语还涵盖如通过例如二硫键形成、糖基化、脂化或磷酸化已经修饰的氨基酸聚合物。在一些实例中，多肽可以具有大于50个氨基酸的长度。
[0049]
如本文所使用的，“分泌性蛋白”的“分泌蛋白”或“分泌多肽”是由活细胞分泌或从活细胞输出的任何蛋白质。与当前描述的表达载体一起使用的分泌蛋白的一个非限制性实例是sflt-1。
[0050]“包括”意指所列元素是例如组合物、方法、试剂盒等中必需的，但是可以包含其它元素以在权利要求的范围内形成例如组合物、方法、试剂盒等。例如，“包括”对可操作地连接到启动子的治疗性多肽进行编码的基因的表达载体是可以包含除基因和启动子之外的其它元素(例如，多腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、连接子结构域等)的表达载体。
[0051]“基本上由
……
组成”意指对实质上不影响例如组合物、方法、试剂盒等的一个或多个基本和新颖特征的特定材料或步骤所描述的例如组合物、方法、试剂盒等的范围的限制。例如，“基本上由”对可操作地连接到启动子和多腺苷酸化序列的治疗性多肽进行编码的基因“组成”的表达载体可以包含另外的序列，例如，连接子序列，只要它们实质上不影响基因的转录或转译。作为另一个实例，“基本上由”叙述的序列“组成”的变体或突变体多肽片段具有所述序列的氨基酸序列在序列的边界处基于源自于的全长未处理多肽加上或减去约10个氨基酸残基，例如，比所述结合氨基酸残基少10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基或比所述结合氨基酸残基多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基。
[0052]“由
……
组成”意指从组合物、方法或试剂盒中排除未在权利要求中指定的任何元件、步骤或成分。例如，“由”对可操作地连接到启动子的治疗性多肽进行编码的基因和多腺苷酸化序列“组成”的表达载体仅由启动子、对治疗性多肽进行编码的多核苷酸序列以及多
腺苷酸化序列组成。作为另一个实例，“由”叙述的序列“组成”的多肽仅含有所叙述的序列。
[0053]
如本文所使用的，“表达载体”涵盖包括对所关注的基因产物进行编码的载体，例如，质粒、微环、病毒载体、脂质体等，并且用于将多核苷酸递送到预期的靶细胞。
[0054]
如本文所使用的，“启动子”涵盖引导rna聚合酶结合并且由此促进rna合成的dna序列。启动子和对应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的(意指在广泛的细胞、组织和物种中具有强活性)或细胞类型特异性的、组织特异性的或物种特异性的。启动子可以是“组成型的”(意指持续活性)或“诱导型的”(意指启动子可以通过生物因子或非生物因子的存在或不存在而活化或失活)。还包含在本发明的核酸构建体或载体中的是增强子序列，所述增强子序列可以或可以不与启动子序列邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达，并且可以位于天然基因的5'区或3'区中。
[0055]
如本文所使用的，“增强子”涵盖刺激或抑制相邻基因转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子可以以任一朝向在距编码序列和转录区下游的位置几千碱基对(kb)的距离上起作用(即，可以与编码序列相关)。
[0056]
如本文所使用的，“多腺苷酸化信号序列”涵盖核酸内切酶切割rna转录物所需的识别区，其后是多腺苷酸化共有序列aataaa。多腺苷酸化信号序列提供“polya位点”，即rna转录物上的位点，腺嘌呤残基将通过转录后多腺苷酸化作用添加到所述位点上。
[0057]
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指遗传元件(例如，启动子、增强子、终止信号序列、多腺苷酸化序列等)的并置，其中所述元件处于准许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。只要保持这种功能关系，启动子与编码区之间就可能存在间插残基。
[0058]
如本文所使用的，术语“异源”是指源自与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。作为另一个实例，从其天然编码序列中除去并可操作地连接到与天然未发现连接的编码序列的启动子是异源启动子。因此，例如，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸的raav是包含通常不包含在天然存在的野生型aav中的核酸的raav，并且经过编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型aav编码的基因产物。
[0059]
如本文所使用的，关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源”是指核酸序列(例如，基因或遗传元件)或天然存在于宿主病毒或细胞中或与其相关的基因产物(例如，rna、蛋白质)。
[0060]
如本文所使用的，术语“天然的”是指核苷酸序列(例如，基因)或存在于野生型病毒或细胞中的基因产物(例如，rna、蛋白质)。
[0061]
如本文所使用的，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列的突变体，例如天然多核苷酸或多肽序列，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列同一性。换句话说，多肽变体包括相对于参考多肽序列(例如，天然多肽序列)的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，并且多核苷酸变体包括相对于参考多核苷酸序列(例如，天然多核苷酸序列)的至少一个核苷酸或核苷差异(例如，核苷酸或核苷取代、插入或缺失)。
[0062]
如本文所使用的，术语“序列同一性”或“百分比同一性”是指当使用核苷酸序列比对程序比对时，两个或更多个多核苷酸之间的同一性程度；或当使用氨基酸序列比对程序
比对时，两个或更多个多肽序列之间的同一性程度。类似地，当在两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的上下文中使用时，术语“相同”或百分比“同一性”是指当出于最大对应性比较和比对时两个相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸的序列，例如，如使用序列比较算法(例如，史密斯-沃特曼算法(smith-waterman algorithm)等)或通过目视检查测量的。例如，可以使用needleman和wunsch(1970,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,48:444-453)算法、使用blossum 62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已并入gcg软件包中的gap程序中。作为另一个实例，可以使用gcg软件包中的gap程序、使用nwsgapdna.cmp矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的参数)是blossum62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性还可以使用e.meyers和w.miller(1989,《生物科学中的计算机应用(cabios)》,4:11-17)的算法、使用pam120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定，所述算法已并入align程序(版本2.0)中。本文描述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行检索，从而例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用altschul等人(1990,《分子生物学杂志》,215:403-10)的nblast和xblast程序(版本2.0)来执行这种检索。可以用nblast程序(得分＝100，字长＝12)进行blast核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用xblast程序(得分＝50，字长＝3)执行blast蛋白质检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如altschul等人(1997,《核酸研究(nucleic acids res)》,25:3389-3402)中所述的有空位的blast。当利用blast和有空位的blast程序时，可以使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。
[0063]
如本文所使用的，术语“生物活性(biological activity)”和“生物活性(biologically active)”是指归因于细胞中的特定生物元素的活性。例如，“免疫球蛋白”、“抗体”或其片段或变体的“生物活性”是指结合抗原决定簇并且由此促进免疫功能的能力。作为另一个实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体实现其例如结合、酶活性等的天然功能的能力。作为第三个实例，基因调节元件(例如，启动子、增强子、kozak序列等)的生物活性是指调节元件或其功能片段或变体分别调节其可操作地连接的基因的表达(即，促进、增强或活化其转译)的能力。
[0064]
如本文所使用的，术语“施用”或“引入”是指将重组蛋白表达的载体递送到细胞、受试者的细胞和/或器官或受试者。这种施用或引入可以发生在体内、体外或离体。可以通过转染将用于表达基因产物的载体引入到细胞中，这通常意味着通过物理手段(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质转染)将异源dna插入到细胞中；或通过感染或转导，其通常是指通过感染剂(即病毒或病毒载体)将核酸分子引入到细胞中。
[0065]
通常，根据用于向细胞施用、引入或插入异源dna(即载体)的方法，将细胞称为“转导的”、“感染的”、“转染的”或“转化的”。当通过病毒或病毒载体将dna引入到细胞中时，用外源或异源dna转导所述细胞。当通过非病毒方法将dna引入到细胞中时，用外源或异源dna转染所述细胞。非病毒方法包含化学方法(例如，脂质转染)和非化学方法。术语“转导的”和“感染的”在本文中可互换使用来指代已经从病毒或病毒载体接受异源dna或异源多核苷酸
的细胞。
[0066]
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指已经用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件(如温度、ph等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞和其子代。
[0067]
术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指减轻疾病或病症的一个或多个体征或症状。
[0068]
术语“疾病”、“病症”和“医学病状”是同义词并且在本文中可互换使用。
[0069]“眼部疾病”是指影响或涉及眼睛或眼睛的一个或多个部分或区的疾病、病痛或病状。因此，眼部疾病包含视网膜疾病或影响眼睛后部组织的光敏层的疾病。眼睛包含眼球以及构成眼球、眼周肌(如斜肌和直肌)和眼球内或眼球附近的视神经部分的组织和流体。
[0070]
组织“外植体”是已经从动物转移到营养培养基的组织块。
[0071]
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，包含但不限于：人和非人灵长类动物，包含猿类和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
[0072]
下文描述了本发明的各种组合物和方法。尽管本文例示了特定组合物和方法，但是应当理解的是，众多替代性组合物和方法中的任何组合物和方法都适用并且适合于实践本发明。还应当理解，可以使用本领域的标准程序来对本发明的表达构建体和方法进行评估。
[0073]
除非另外指明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的范围内。这种技术在文献中有充分说明，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratorymanual)》,第二版(sambrook等人,1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编辑,1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编辑,1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社公司(academic press,inc.))；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编辑)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编辑,1987)；《当代分子生物学方案(current protocols inmolecular biology)》(f.m.ausubel等人编辑,1987)；《pcr：聚合酶链式反应(pcr:thepolymerase chain reaction)》(mullis等人编辑,1994)；以及《当代免疫学方案(currentprotocols in immunology)》(j.e.coligan等人编辑,1991)，所述文献中的每一个文献通过引用明确地并入本文。
[0074]
以下参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系以及方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易识别到，可以在不具有特定细节中的一个或多个的情况下或者可以用其它方法来实践本发明。本发明不受所说明的动作或事件的排序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其它动作或事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法并不需要所有所说明的动作或事件。
[0075]
本文中所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式。此外，在具体实施方式和/或权利要求中所使用的术语“包含(including)”、“包含(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的程度上，此类术语旨在是包含性的(以类似于术语“包括(comprising)”的方式)。
[0076]
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，即受测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1或大于1的标准偏差内。可替代地，“约”或“大约”可以意指给定值的高达20％、优选地高达10％、更优选地高达5％并且更优选地仍高达1％的范围。可替代地，特别是对于生物学系统或方法，所述术语可以意指处于某一值的数量级内，优选地在值的5倍内并且更优选地在2倍内。当在本技术和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
[0077]
本文所提及的所有出版物通过引用并入本文中，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开取代所并入公开的任何公开内容。
[0078]
应进一步注意，权利要求可以撰写为排除任何任选的元素。因此，本声明旨在充当使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限制的前提基础。
[0079]
仅提供在本技术的提交日期之前的本文所讨论的出版物中的公开内容。本文中的任何内容均不应被理解为承认本发明不能由于现有发明而有权先于这种出版物。另外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确定。
[0080]
除非另外指明，否则本文所使用的所有术语具有与其对于本领域技术人员而言应有的含义相同的含义，并且本发明的实践将采用微生物学的常规技术和重组dna技术，所述技术在本领域技术人员的知识范围内。
[0081]
ii.具体实施方式
[0082]
在一方面，本公开提供了一种增强基因表达的调控核酸分子，所述调控核酸分子按5'到3'顺序包含腺病毒的三联前导序列(tpl)和腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(emlp)，其中：
[0083]
所述腺病毒的三联前导序列(tpl)具有选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示的tpl序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0084]
所述腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(emlp)具有选自seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8所示的emlp序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0085]
在本公开的一些实施方案中，所述调控核酸分子具有选自seq id no:19-34所示序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0086]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述调控核酸分子具有seq id no:22、25、26或33所示序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0087]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述调控核酸分子具有seq id no:26所示序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0088]
在一方面，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体按5'到3'顺序包含：
[0089]
(a)启动子区；
[0090]
(b)5'utr区；
[0091]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
[0092]
(d)多腺苷酸化区(polya)；
[0093]
其中，所述5'utr区包含前述的调控核酸分子；
[0094]
所述编码序列可操作地连接到所述启动子区。
[0095]
在本公开的一些实施方案中，所述(a)启动子区选自巨细胞病毒(cmv)启动子、肌动蛋白启动子、延伸因子1α(ef1α)启动子和甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子；所述(a)启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0096]
在本公开的一些实施方案中，所述多肽基因产物为治疗性蛋白质。
[0097]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述治疗性蛋白选自抗血管生成多肽或α-1抗胰蛋白酶。
[0098]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述抗血管生成多肽包含可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)或sflt-1的vegf结合片段。
[0099]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述抗血管生成多肽为阿柏西普(aflibercept)；优选地，阿柏西普(aflibercept)的氨基酸如seq id no:10所示；更优选地，阿柏西普(aflibercept)的编码核酸如seq id no:11所示。
[0100]
在本公开的一些实施方案中，所述多腺苷酸化区选自人生长激素(hgh或hgh)、牛生长激素(bgh或bgh)或β-珠蛋白(β珠蛋白)polya序列。
[0101]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0102]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含(i)第一增强子区，所述(i)第一增强子区位于所述(a)启动子区上游。
[0103]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(i)第一增强子区包含选自cmv增强子或ef1α增强子的序列。
[0104]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(i)第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0105]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含(ii)内含子区，所述(ii)内含子区位于所述(b)5'utr区的下游且位于所述(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列的上游。
[0106]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(ii)内含子区包含选自sv40内含子、延伸因子1α(ef1α)内含子、肌动蛋白内含子或cmvc内含子的序列。
[0107]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(ii)内含子区包含seq id no:14所示的sv40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0108]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含(iii)第二增强子区，所述(iii)第二增强子区位于所述(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列的下游且位于所述(d)多腺苷酸化区的上游。
[0109]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(iii)第二增强子区包含表达增强子序列(ees)。
[0110]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(iii)第二增强子区包含干扰素的支架附着区(sar)。
[0111]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述支架附着区序列(sar)为人β-干扰素的人支架附着区(ifnb sar)。
[0112]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述人β-干扰素人支架附着区(ifnb sar)包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0113]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含位于所述(i)第一增强子上游的(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)和位于所述(d)多腺苷酸化区下游的(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)。
[0114]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)或所述(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)包含选自腺病毒(av)或腺相关病毒(aav)的反向末端重复序列(itr)；
[0115]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:16所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列。
[0116]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:17所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列。
[0117]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体还包含(vi)选择标记基因。
[0118]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(vi)选择标记基因位于所述(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)的下游。
[0119]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述(vi)选择标记基因选自氨苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、双丙氨磷抗性基因和二氢叶酸还原酶基因。
[0120]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述氨苄青霉素抗性基因包含seq id no:18所示的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0121]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体按5'到3'包含：
[0122]
(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0123]
(a)启动子区，所述启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0124]
(b)5'utr区，所述5'utr区包含由seq id no:2所示的tpl序列和seq id no:8所示的emlp序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；
[0125]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
[0126]
(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列；以及
[0127]
(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列，并且
[0128]
任选地其中所述表达载体不包含rna输出信号。
[0129]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体按5'到3'包含：
[0130]
(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0131]
(a)启动子区，所述启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0132]
(ii)内含子区，所述内含子区包含seq id no:14所示的sv40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0133]
(b)5'utr区，所述5'utr区包含由seq id no:2所示的tpl序列和seq id no:8所示的emlp序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；
[0134]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接到所述启动子区；
[0135]
(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0136]
(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0137]
在本公开的一些实施方案中，所述表达载体按5'到3'包含：
[0138]
(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)，所述5'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:16所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列；
[0139]
(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0140]
(a)启动子区，所述启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0141]
(ii)内含子区，所述内含子区包含seq id no:14所示的sv40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0142]
(b)5'utr区，所述5'utr区包含由seq id no:2所示的tpl序列和seq id no:8所示的emlp序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；
[0143]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
[0144]
(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0145]
(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0146]
在本公开的一些实施方案中，其按5'到3'包含：
[0147]
(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)，所述5'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:16所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列；
[0148]
(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0149]
(a)启动子区，所述启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0150]
(ii)内含子区，所述内含子区包含seq id no:14所示的sv40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0151]
(b)5'utr区，所述5'utr区包含由seq id no:2所示的tpl序列和seq id no:8所示的emlp序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；
[0152]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
[0153]
(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0154]
(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0155]
(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)，所述(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:17所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列。
[0156]
在本公开的一些实施方案中，其按5'到3'包含：
[0157]
(iv)5'末端的反向末端重复序列(itr)，所述5'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:16所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列；
[0158]
(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含seq id no:13所示的cmv增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0159]
(a)启动子区，所述启动子区包含seq id no:9所示的巨细胞病毒(cmv)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0160]
(ii)内含子区，所述内含子区包含seq id no:14所示的sv40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0161]
(b)5'utr区，所述5'utr区包含由seq id no:2所示的tpl序列和seq id no:8所示的emlp序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；
[0162]
(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列，所述多肽基因产物为阿柏西普(aflibercept)；优选地，阿柏西普(aflibercept)的氨基酸如seq id no:10所示；更优选地，阿柏西普(aflibercept)的编码核酸如seq id no:11所示；
[0163]
(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含seq id no:15所示的sar序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0164]
(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含seq id no:12所示的牛生长激素(bgh或bgh)polya序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0165]
(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)，所述(v)3'末端的反向末端重复序列(itr)包含seq id no:17所示的aav itr或与其具有至少85％同一性的序列。
[0166]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述表达载体包含seq id no:35、36、37或38所示的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0167]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述表达载体包含seq id no:36所示的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0168]
在一方面，本公开提供了一种重组病毒，其包含：
[0169]
a)衣壳蛋白；以及
[0170]
b)前述的表达载体。
[0171]
在本公开的一些实施方案中，所述重组病毒为重组腺相关病毒；优选地，所述腺相关病毒选自aav 1型(aav-1)、aav 2型(aav-2)、aav 3型(aav-3)、aav 4型(aav-4)、aav 5型(aav-5)、aav 6型(aav-6)、aav 7型(aav-7)、aav 8型(aav-8)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、
灵长类动物aav、非灵长类动物aav以及绵羊aav。
[0172]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述腺相关病毒选自aav 5型(aav-5)或aav 6型(aav-6)。
[0173]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述衣壳蛋白是aav变体7m8衣壳蛋白或者源自于所述aav变体7m8衣壳蛋白。
[0174]
在一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含前述的表达载体和/或重组病毒和药学上可接受的赋形剂。
[0175]
在一方面，本公开提供了一种用前述的表达载体转染或转导的分离的宿主细胞。
[0176]
在一方面，本公开提供了一种用前述的重组病毒感染的分离的宿主细胞。
[0177]
在一方面，本公开提供了一种用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法，所述方法包含使一个或多个哺乳动物细胞与一定量的前述的表达载体和/或重组病毒接触，其中以一定水平在所述一个或多个哺乳动物细胞中表达所述分泌多肽。
[0178]
在一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防有疾病治疗或预防需要的哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的表达载体、重组病毒、药物组合物和/或宿主细胞。
[0179]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述疾病为眼部疾病，并且所药物组合物被施用给所述哺乳动物的眼睛。
[0180]
在本公开的一些优选的实施方案中，通过眼内注射或玻璃体内注射向所述哺乳动物的眼睛施用所述药物组合物。
[0181]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述眼部疾病选自年龄相关的黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、视网膜新血管化、脉络膜新血管化和糖尿病视网膜病。
[0182]
在一方面，本公开提供了前述的表达载体、重组病毒、药物组合物和/或宿主细胞在制备治疗或预防有疾病治疗或预防需要的哺乳动物的疾病中的用途。
[0183]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述疾病为眼部疾病，并且所述药物组合物被施用给所述哺乳动物的眼睛。
[0184]
在本公开的一些优选的实施方案中，通过眼内注射或玻璃体内注射向所述哺乳动物的眼睛施用所述药物组合物。
[0185]
在本公开的一些优选的实施方案中，所述眼部疾病选自年龄相关的黄斑变性(amd)、湿性amd、干性amd、视网膜新血管化、脉络膜新血管化和糖尿病视网膜病。
[0186]
在本公开的一些方面，提供了用于在一个或多个真核细胞中表达转基因的组合物。在一些方面，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是视网膜细胞，如视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞、感光细胞、视锥细胞、视杆细胞、m
ü
ller神经胶质细胞或视网膜色素上皮细胞。
[0187]
在本公开的一些实施例中，所述组合物是表达载体。“表达载体”是指包括两个或更多个功能性多核苷酸序列的通常彼此可操作地连接的多核苷酸序列，例如，调节元件、转译起始序列、编码序列、终止序列等。通常，多核苷酸序列由dna构成。同样地，“用于在哺乳动物细胞中表达转基因的表达载体”是指促进在细胞中表达转基因的两个或更多个功能性多核苷酸序列(例如，启动子、增强子、5'utr、转换起始序列、编码序列、终止序列等)的组合。
[0188]
在一些实施例中，本公开的表达载体在哺乳动物细胞中提供了转基因的表达增强。在某些实施例中，本公开的表达载体内的两个或更多个功能性多核苷酸序列的布置在哺乳动物细胞中提供了转基因的表达增强。“增强的”是指携带本公开的表达载体的细胞相对于携带可操作地连接到可比较的调节元件的转基因的细胞中转基因的表达增加、加强或更强。换句话说，由本公开的表达载体进行的转基因表达相对于由不包括本公开的一个或多个经过优化的元件的表达载体(即参照对照载体，如本文所述的cmv参照对照载体)的表达增加、增强或更强。在某些实施例中，表达增强特异于或限于一种或多种所期望的细胞类型。在一个实施例中，转基因对蛋白质进行编码，所述蛋白质由细胞分泌到细胞周围的水性环境中。
[0189]
例如，在包括本文公开的包括启动子的表达载体的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到不同启动子的转基因的细胞中转基因的表达增强、加强或更强。作为另一个实例，在包括本文公开的包括增强子序列的表达载体的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到不同增强子序列的转基因的细胞中转基因的表达增强、或增加、加强或更强。作为另一个实例，在包括本文公开的对5'utr进行编码的表达载体的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到不同5'utr编码序列的转基因的细胞中转基因的表达增强、或增加、加强或更强。作为另一个实例，在包括本文公开的包括内含子的表达载体的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到不同内含子序列的转基因的细胞中转基因的表达增强、或增加、加强或更强。在又另一个实例中，在包括本文公开的包括内含子的表达载体的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到参照对照载体(如本文公开的cmv参照对照载体)的转基因的细胞中转基因的表达增强、或增加、加强或更强。
[0190]
在优选的实施例中，多核苷酸表达载体促进在一种或多种体外和体内特定细胞或组织类型中转基因的表达(或与参照载体相比更高水平的表达)。细胞类型的实例包含但不限于hela细胞、hek-293细胞、arpe-19细胞(人视网膜色素上皮细胞系)、视网膜神经节细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞、感光细胞、视锥细胞、视杆细胞、m
ü
ller神经胶质细胞和视网膜色素上皮细胞。在另一个实施例中，在视网膜组织外植体的细胞中观察到表达增强。
[0191]
在一些实施例中，由所述表达载体在哺乳动物细胞中进行的分泌多肽的表达是由参照载体在体外或体内哺乳动物细胞中进行的分泌多肽的表达的至少约2倍、3倍、5倍、9倍、10倍、20倍或50倍。更一般地，所述分泌多肽的表达是由参照载体在哺乳动物细胞中进行的多肽的表达的2到10倍、5到10倍、9到10倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍。换句话说，表达载体以一定水平在哺乳动物细胞培养物中表达分泌蛋白，其表达水平是由参照载体在哺乳动物细胞培养物中获得的表达水平的至少或大于2倍、5倍、10倍、50倍或约5倍到约10倍。
[0192]
在不希望受理论束缚的情况下，认为在细胞内或细胞外的细胞外环境(例如，培养上清液或组织基质)中的转基因的表达增强起因于细胞中基因产物的较快积聚或细胞中更稳定的基因产物。因此，可以以多种方式观察通过本公开的表达载体增强的转基因表达。例如，如果转基因可操作地连接到可比较的调节元件(如本文所述的cmv参照对照载体中的那些元件)，则可以通过检测转基因的表达来观察表达增强，之后将检测比表达早(例如，比表达早7天、早2周、早3周、早4周、早8周、早12周或更长时间)的表达载体与细胞的接触。还可以观察到随着每个细胞的基因产物的量的增加而增强的表达。例如，每个哺乳动物细胞的
基因产物的量可能增加2倍或更多，例如增加3倍或更多、增加4倍或更多、增加5倍或更多、或增加10倍或更多。还可以观察到随着哺乳动物细胞数量的增加而增强的表达，所述哺乳动物细胞表达由表达载体携带的转基因的可检测水平。例如，表达转基因的可检测水平的哺乳动物细胞的数量可能增加2倍或更多，例如增加3倍或更多、增加4倍或更多、增加5倍或更多、或增加10倍或更多。作为另一个实例，与常规表达载体相比，本发明的多核苷酸可以促进更大百分比细胞中转基因的可检测水平；例如，当常规载体可以促进例如在某个区中小于5％的细胞中转基因表达的可检测水平时，本发明的多核苷酸促进在所述区中5％或更多细胞中表达的可检测水平；例如，接触的10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多，在某些情况下50％或更多、55％或更多；60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多(例如，80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多)的细胞将表达基因产物的可检测水平。还可以观察到随着细胞活力和/或功能的改变而增强的表达。
[0193]
本公开的表达载体通常包括启动子区。在某些实施例中，启动子区促进哺乳动物细胞中编码序列的表达。在某些情况下，启动子是普遍存在的启动子，即其是在广泛的细胞、组织和物种中具有活性的启动子。合适的实例包含肌动蛋白、巨细胞病毒(cmv)、延伸因子1α(ef1α)、以及甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子。
[0194]
在一些实施例中，多核苷酸包括一个或多个增强子。增强子是增强转录的核酸元件。在一些实施例中，表达载体包括处于编码序列上游的第一增强子和处于编码序列下游的第二增强子。合适的示例性增强剂包含但不限于ef1α、cmv、完整的ees或其部分，如410-564ees或511-810ees。ees(表达增强子序列)对应于人β-干扰素的人支架附着区或sar(agarwal,m等人(1998)“支架附着区介导的原发性t细胞中逆转录病毒载体表达的增强”《病毒学杂志(j.virol.)》72(5):3720-3728)。核支架结合区(scaffold associated region,sar)是富含at的一段dna序列，又被称为核基质结合区(matrix attachment region,mar)。有研究发现在外源基因的表达框中增加人干扰素基因的sar区域序列，有利于防止外源基因的甲基化沉默，维持外源基因的长期稳定表达。
[0195]
腺病毒的三联前导序列(tripartite leader sequence,tpl)是腺病毒主要晚期转录mrna 5'端的utr序列，研究显示tpl序列可以促进mrna的翻译，5'端含有tpl序列的mrna翻译水平显著高于5'端不存在tpl序列的mrna。
[0196]
腺病毒的主要晚期启动子(major late promoter,mlp)是腺病毒基因组开始复制后，调控大部分晚期基因转录的一个共同启动子，一旦腺病毒基因组开始复制后mlp的活性将明显增强。在启动子附近增加腺病毒晚期基因启动子的增强子序列(adenoviral major late protein enhancer,emlp)，有可能显著提高外源基因的表达水平。
[0197]
在一些实施例中，表达载体包括对5'非转译区进行编码的序列，即对编码序列的非转译区5'进行编码的多核苷酸序列，也称为5'utr。在一些实施例中，所述5'utr不含多核苷酸atg。合适的示例性5'utr序列包含但不限于选自以下的序列：i)来自腺病毒的三联前导序列(tpl)(logan,j等人(1984年6月)“腺病毒三联前导序列增强感染后期mrna的转译(adenovirus tripartite leader sequence enhances translation of mrnas lateafter infection)”,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》81:3655-3659)；ii)来自腺病毒主要晚期启动子(emlp)的增强子元件序列(durocher,y等人(2002)“通过瞬时转染悬浮生长人293-ebna1细胞产生的高水平和高通量重组蛋白质(high-level andhigh-throughput recombinant protein production by transient transfection ofsuspension-growing human 293-ebna1cells)”,《核酸研究(nucl.acids.res.》30(2):e9)；(iii)utr1；以及(iv)utr2。在优选实施例中，所述5'utr按5'到3'顺序包括tpl和emlp序列。
[0198]
在一些实施例中，表达载体进一步包括内含子，所述内含子包括剪接供体/受体区。在一些实施例中，所述内含子位于启动子区的下游，并位于基因的转译起始序列的上游。内含子是dna多核苷酸，其通过内含子剪接转录成rna并在mrna加工过程中被去除。含有内含子的表达载体的表达通常比不具有内含子的那些表达载体的表达高。内含子可以刺激的表达介于2倍与500倍之间(buchman和berg,1988,《分子细胞生物学(mol cellbio)》,8(10):4395)。有效剪接的内含子含有前剪接供体、分支点和富py区(senapathy等人,1990；《酶学方法(meth.enzymol.)》183,252-78；wu和krainer,1999；《分子细胞生物学》,19(5):3225-36)。与处于3'末端处的内含子相比，5'内含子通常更有效(huang和gorman,1990；《分子细胞生物学》,10:1805)。尽管已知内含子通常会增加基因表达水平，但给定cdna的特异性增加(如果有的话)是经验性的，并且必须进行测试；例如，psi载体中的嵌合内含子使cat表达增加21倍，但荧光素酶表达仅增加3倍。示例性内含子序列包含但不限于来自肌动蛋白、延伸因子1α(ef1α)、来自腺病毒主要晚期启动子(emlp)的增强子元件和cmvc的序列。
[0199]
待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如，对基因产物进行编码的基因或cdna，例如多肽。编码序列可以与所述编码序列可操作地连接的启动子序列和/或5'utr序列异源，即所述编码序列不与所述启动子或5'utr天然可操作地缔合。可替代地，编码序列可以与所述编码序列可操作地连接的启动子序列和/或5'utr序列内源，即所述编码序列天然与所述启动子或5'utr缔合。基因产物可以内在地作用于哺乳动物细胞，或者其可以外在地起作用，例如，其可能是分泌性的。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是对所期望的基因产物或其功能片段或变体进行编码的任何基因，所期望的基因产物或其功能片段或变体可以用作治疗疾病或病症的治疗剂。因此，表达载体中的编码序列可以对例如视蛋白或抑制vegf的蛋白质进行编码，或者多核苷酸可以对有效减轻疾病的一个或多个体征或症状的蛋白质或酶进行编码。
[0200]
在各个优选的实施例中，转基因对从细胞分泌的肽或蛋白质进行编码。在一些实施例中，分泌性蛋白质是治疗性蛋白质或有效治疗受试者疾病的蛋白质。在一些实施例中，治疗性蛋白质是抗血管生成多肽或抑制新血管生长(血管生成)的多肽。在一些形式中，分泌性蛋白质是抗vegf蛋白质或抑制血管内皮生长因子(vegf)的蛋白质。抗vegf蛋白的实例包括兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)和阿柏西普。抗vegf多肽的另一个实例是可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)。在其它情况下，分泌性蛋白质包括vegf结合蛋白或其功能片段(如美国专利第5,712,380号、第5,861,484号以及第7,071,159号中公开的任何一种)或如例如美国专利第7,635,474号中公开的vegf结合融合蛋白或由其组成。在一些形式中，分泌性蛋白质包括单链抗体(如例如单链抗vegf抗体)或由其组成。根据一个实施例，转基因对sflt-1进行编码，并且在更具体的实施例中，转基因对人sflt-1进行编码。可替代地，转基因可以包括对sflt-1的功能性vegf结合片段进行编码的序列(wiesmann等人,1997；《细胞(cell)》,91:695-704)。根据另一个实施例，转基因对a1at或α-1抗胰蛋白酶
进行编码(chiuchiolo等人,2013,24(4):161-173；stoller和aboussouan(2012)《美国呼吸与重症护理医学杂志(am j respir.crit.care med.185(3):246-59)，所述a1at或α-1抗胰蛋白酶可以用于治疗与a1at缺乏相关的疾病的方法中。
[0201]
sflt-1是vegf受体flt-1的可溶性截短形式，并且也被称为可溶性血管内皮生长因子受体-1(svegfr-1)。重组sflt-1结合并抑制vegf(kendall和thomas,1993；《美国国家科学院院刊》90(22):10705-10709)。在自然界中，重组sflt-1通过替代性mrna剪接而生成并且缺乏膜近端免疫球蛋白样结构域、跨膜区(transmembrane spanning region)和细胞内酪氨酸激酶结构域。如本文所描述的，“可溶性”flt-1或sflt-1是指flt-1，所述flt-1不限于细胞膜。未结合的sflt-1可以在细胞外空间或溶液中自由扩散。
[0202]
在本发明的一个实施例中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”，以通过用更频繁表示的密码子替换不频繁表示的密码子来增强表达。编码序列是对用于转译的氨基酸进行编码的mrna序列的一部分。在转译过程中，61个三核苷酸密码子中的每个三核苷酸密码子被转译成20个氨基酸中的一个氨基酸，从而导致遗传密码中的简并或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种会利用在不同频率下对相同氨基酸进行编码的trna(各自携带反密码子)。当基因序列含有由对应trna不频繁表示的密码子时，核糖体转译机制可能会减慢，从而阻碍有效转译。可以通过特定物种的“密码子优化”来改进表达，其中改变编码序列以对相同的蛋白质序列进行编码，而利用高度表示和/或由高度表示的人蛋白质利用的密码子(cid-arregui等人,2003；《病毒学杂志》77:4928)。一方面，对编码序列进行优化以在灵长类动物中进行转译。在本发明的一个方面，对转基因的编码序列进行修饰以用灵长类动物中频繁表达的密码子替换哺乳动物或灵长类动物中不频繁表达的密码子。例如，在一些实施例中，由转基因编码的编码序列编码对多肽进行编码，所述多肽与由上文或在此所公开的序列编码的多肽具有至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或在此所公开的序列中的对应密码子更高的trna频率。
[0203]
在一些实施例中，本发明的表达载体进一步包括rna输出信号。rna输出信号为增强来自细胞核的rna的输出的顺式作用转录后调节元件。示例性rna输出序列包含但不限于来自乙型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)和土拨鼠肝炎病毒转录后元件(wpre)的序列(higashimoto,t等人,“土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件减少来自逆转录病毒载体的通读转录(the woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory elementreduces readthrough transcription from retroviral vectors)”,《基因疗法(genether.)》,2007年9月,14(17):1298-1304)。
[0204]
在一些实施例中，本发明的表达载体进一步包括多腺苷酸化区。如本领域所理解的，rna聚合酶ii转录物通过切割和添加多腺苷酸化区而终止，所述多腺苷酸化区也可以称为poly(a)信号、poly(a)区或poly(a)尾部。polya区含有多个连续的腺苷一磷酸，其通常具有基序aauaaa的重复。已经鉴定出了几种有效的多腺苷酸化位点，包含来自sv40、牛生长激素、人生长激素和兔β珠蛋白的那些多腺苷酸化位点(xu等人,2001；《基因(gene)》272(1-2):149-156；xu等人,2002；《控制释放期刊(j control rel.)》81(1-2):155-163)。用于在哺乳动物细胞中表达转基因的最有效的polya信号可以取决于细胞类型和所关注的物种以及所使用的特定载体。在本发明的一些实施例中，表达载体包括选自由以下组成的组的
polya区：牛生长激素(bgh)、人生长激素(hgh)和β-珠蛋白(β珠蛋白)。
[0205]
如普通技术人员所理解的，可以对上文所提到的多核苷酸元件中的两种或更多种多核苷酸元件进行组合以产生本公开的表达载体。因此，例如，表达载体按5'到3'顺序可以包括处于可操作连接的cmv增强子、cmv或ef1α启动子、任选地cmvc或ef1α内含子、utr1、utr2或tpl和emlp 5'utr、sflt1的编码序列或分泌性多肽、完整的ees、410-564ees或511-810ees增强子、任选地hpre或wpre rna输出序列以及bgh、hgh或β珠蛋白多腺苷酸化信号序列。
[0206]
另一个表达载体按5'到3'顺序可以包括处于可操作连接的cmv增强子、cmv启动子、包括tpl序列和emlp序列的5'utr、对治疗剂(例如，治疗性多肽)进行编码的编码序列、全长ees增强子以及hgh polya信号序列。在特定实施例中，编码序列对抗血管生成多肽进行编码。在特定实施例中，对编码序列进行密码子优化。在这些实施例中的某些实施例中，表达载体包括一个或多个选自seq id no:35-38的序列。
[0207]
如本领域普通技术人员将认识到的，表达载体可以任选地含有其它元件，包含但不限于促进克隆的限制性位点和用于特定基因表达载体的调节元件。调节序列的实例包含aav载体的itr、质粒载体的细菌序列、噬菌体整合酶载体的attp位点或attb位点以及转座子的转座元件。
[0208]
如本文所公开的，在本发明的一些方面，表达载体用于将基因递送到动物细胞，例如以确定基因对细胞活力和/或功能的影响、治疗细胞病症等。因此，在本发明的一些方面，提供用于在哺乳动物细胞中表达转基因的组合物为基因递送载体，其中基因递送载体包括本公开的表达载体。
[0209]
本公开的基因递送载体涵盖用于将多核苷酸序列递送到哺乳动物细胞的任何方便的基因递送载体。例如，载体可以包括单链核酸或双链核酸，例如单链dna或双链dna。例如，基因递送载体可以是dna，例如裸dna，例如质粒或微环等。载体可以包括单链rna或双链rna，包含rna的经过修饰的形式。在另一个实例中，基因递送载体可以是rna，例如mrna或经过修饰的mrna。
[0210]
作为另一个实例，基因递送载体可以是源自于病毒的病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒(aav)、慢病毒、疱疹病毒、α病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼(moloney)鼠类白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(momsv)、哈维(harvey)鼠类肉瘤病毒(hamusv)、鼠类乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗里德(friend)鼠类白血病病毒、鼠类干细胞病毒(mscv)和劳斯氏(rous)肉瘤病毒(rsv)或慢病毒。虽然下文更详细地描述涵盖腺相关病毒的用途的实施例，但是预期普通技术人员将认识到，本领域类似的知识和技能也可以应用于非aav基因递送载体。参见例如，例如美国专利第7,585,676号和美国专利第8,900,858号中对逆转录病毒载体的讨论以及例如美国专利第7,858,367号中对腺病毒载体的讨论，所述美国专利的全部公开内容通过引用并入本文。
[0211]
在一些实施例中，基因递送载体为重组腺相关病毒(raav)。在这种实施例中，表达载体在5'和3'末端侧接有功能性aav反向末端重复(itr)序列。“功能性aavitr序列”是指如预期的用于拯救、复制和包装aav病毒粒子的itr序列。因此，用于本发明的基因递送载体的aav itr不需要具有野生型核苷酸序列并且可以通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，或
者aav itr可以源自于若干aav血清型中的任何aav血清型，例如，aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10。优选的aav载体具有全部或部分缺失的野生型rep基因和cap基因，但是保留有功能性侧接itr序列。在特定实施例中，aav病毒载体为aav2变体7m8。
[0212]
在一些实施例中，表达载体被衣壳化在aav衣壳内，所述aav衣壳可以源自于任何腺相关病毒血清型，包含但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10等，所述腺相关病毒血清型中的任何腺相关病毒血清型都可以充当基因传递载体。例如，aav衣壳可以是野生型衣壳或天然衣壳。特别关注的野生型aav衣壳包含aav2、aav5和aav9。然而，与itr一样，衣壳不需要具有野生型核苷酸序列，而是只要衣壳能够对哺乳动物细胞进行转导，就可以通过vp1、vp2或vp3序列中核苷酸的插入、缺失或取代相对于野生型序列而改变。换句话说，aav衣壳可以是变体aav衣壳，所述变体aav衣壳包括相对于源自的亲本衣壳蛋白或aav衣壳蛋白的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。特别关注的变体aav包含美国专利9,193,956中所公开的那些变体aav，所述美国专利的全部公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，变体aav包括美国专利9,193,956中所公开的7m8变体衣壳蛋白(其在本文中可以称为aav2.7m8或7m8.aav2)。。
[0213]
优选地，raav为复制缺陷型的，因为aav载体不能独立地对其基因组进行进一步复制和包装。例如，当用raav病毒粒子对视锥细胞进行转导时，基因在经过转导的视锥细胞中进行表达，然而，由于经过转导的视锥细胞缺乏aav rep基因和cap基因以及辅助功能基因的事实，因此raav不能进行复制。
[0214]
可以使用标准方法来产生使本公开的表达载体衣壳化的基因递送载体(例如，raav病毒粒子)。例如，在raav病毒粒子的情况下，根据本发明的aav表达载体可以引入到生产细胞中，然后引入aav辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中进行表达的aav编码区并且所述aav编码区可对aav载体中不存在的aav辅助功能进行补充。然后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供能够支持有效的raav病毒产生的辅助功能。然后，对生产细胞进行培养以产生raav。使用标准方法来执行这些步骤。通过本领域已知的标准技术使用aav包装细胞和包装技术来制备使本发明的重组aav载体衣壳化的复制缺陷型aav病毒粒子。例如在以下中可以发现这些方法的实例：美国专利第5,436,146号；美国专利第5,753,500号、美国专利第6,040,183号、美国专利第6,093,570号和美国专利第6,548,286号，所述美国专利以全文引用的方式明确地并入本文中。wang等人(us 2002/0168342)描述了用于包装的另外的组合物和方法，其也以全文引用的方式并入本文中。
[0215]
可以制备适合于对哺乳动物细胞进行有效转导的任何浓度的病毒颗粒，以在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，可以以每毫升108个或更多个载体基因组(vg/ml)的浓度来调配病毒颗粒，例如每毫升5
×
108个载体基因组；每毫升109个载体基因组；每毫升5
×
109个载体基因组、每毫升10
10
个载体基因组、每毫升5
×
10
10
个载体基因组；每毫升10
11
个载体基因组；每毫升5
×
10
11
个载体基因组；每毫升10
12
个载体基因组；每毫升5
×
10
12
个载体基因组；每毫升10
13
个载体基因组；每毫升1.5
×
10
13
个载体基因组；每毫升3
×
10
13
个载体基因组；每毫升5
×
10
13
个载体基因组；每毫升7.5
×
10
13
个载体基因组；每毫升9
×
10
13
个载体基因组；每毫升1
×
10
14
个载体基因组、每毫升5
×
10
14
个或更多个载体基因组，但是通常每毫
升不超过1
×
10
15
个载体基因组。类似地，可以向哺乳动物施用适合于提供适当的细胞转导以赋予期望的效果或治疗疾病的任何总数量的病毒颗粒。在各个优选实施例中，至少为108个；5
×
108个；109个；5
×
109个、10
10
个、5
×
10
10
个；10
11
个；5
×
10
11
个；10
12
个；5
×
10
12
个；10
13
个；1.5
×
10
13
个；3
×
10
13
个；5
×
10
13
个；7.5
×
10
13
个；9
×
10
13
个、1
×
10
14
个或5
×
10
14
个或更多个病毒颗粒，但是每只眼睛注射的病毒颗粒通常不超过1
×
10
15
个。可以向哺乳动物或灵长类动物的眼睛施用任何合适数量的载体。在一个实施例中，所述方法包括单次施用；在其它实施例中，当主治临床医师认为合适时，可以随时间进行多次施用。
[0216]
可以将主题病毒载体调配成包括任何合适的单位剂量的载体的药物组合物，可以向受试者施用所述药物组合物以在受试者中产生变化或治疗受试者的疾病。在一些实施例中，单位剂量包括但不限于病毒载体的1
×
108个或更多个载体基因组，例如至少约1
×
109个、1
×
10
10
个、1
×
10
11
个、1
×
10
12
个、1
×
10
13
个、1
×
10
14
个或至少约3
×
10
14
个或更多个载体基因组，在某些情况下，至少约1
×
10
14
个载体基因组，但是通常不超过4
×
10
15
个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括最多约5
×
10
15
个载体基因组，例如1
×
10
14
个或5
×
10
14
个或更少的载体基因组，例如1
×
10
13
个、1
×
10
12
个、1
×
10
11
个、1
×
10
10
个或1
×
109个或更少的载体基因组，在某些情况下，1
×
108个或更少的载体基因组，并且通常不少于1
×
108个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括1
×
10
10
个到1
×
10
11
个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括1
×
10
10
个到3
×
10
12
个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括1
×
109个到3
×
10
13
个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括1
×
108个到3
×
10
14
个载体基因组。在一些情况下，单位剂量包括约1
×
10
10
个到约5
×
10
14
个载体基因组。
[0217]
在一些情况下，可以使用感染复数(moi)来测量药物组合物的单位剂量。moi是指载体或病毒基因组与核酸可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些情况下，moi可以为1
×
106个。在一些情况下，moi可以为1
×
10
5-1
×
107个。在一些情况下，moi可以为1
×
10
4-1
×
108个。在一些情况下，本公开的重组病毒至少为约1
×
101个、1
×
102个、1
×
103、1
×
104个、1
×
105个、1
×
106个、1
×
107个、1
×
108个、1
×
109个、1
×
10
10
个、1
×
10
11
个、1
×
10
12
个、1
×
10
13
个、1
×
10
14
个、1
×
10
15
个、1
×
10
16
个、1
×
10
17
和1
×
10
18
个moi。在一些情况下，本公开的重组病毒为1
×
108个到3
×
10
14
个moi。在一些情况下，本公开的重组病毒最多为约1
×
101个、1
×
102个、1
×
103、1
×
104个、1
×
105个、1
×
106个、1
×
107个、1
×
108个、1
×
109个、1
×
10
10
个、1
×
10
11
个、1
×
10
12
个、1
×
10
13
个、1
×
10
14
个、1
×
10
15
个、1
×
10
16
个、1
×
10
17
和1
×
10
18
个moi。
[0218]
在一些方面，药物组合物的量包括约1
×
108个到约1
×
10
15
个重组病毒、约1
×
109个到约1
×
10
14
个重组病毒、约1
×
10
10
个到约1
×
10
13
个重组病毒或约1
×
10
11
个到约3
×
10
12
个重组病毒。
[0219]
在制备raav组合物时，可以采用用于产生raav病毒粒子的任何宿主细胞，包含但不限于例如哺乳动物细胞(例如，293个细胞)、昆虫细胞(例如，sf9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞或生产细胞，在所述包装细胞中，aav rep基因和cap基因稳定地维持在宿主细胞中，aav载体基因组稳定地维持并包装在所述生产细胞中。示例性包装和生产细胞源自于sf-9、293、a549或hela细胞。使用本领域已知的标准技术来纯化和调配aav载体。
[0220]
本发明包含药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的表达载体或基因递送载体以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。例如，一个实施例是包括重组病毒的药物
组合物，所述重组病毒包括本公开的多核苷酸和药学上可接受的赋形剂。在具体实施例中，重组病毒为重组腺相关病毒(aav)。表达载体或基因递送载体可以与可用于制备调配物的药学上可接受的载剂、稀释剂和试剂进行组合，所述调配物通常是安全、无毒且期望的并且包含供灵长类动物使用的可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体(在气溶胶组合物的情况下)。这种载剂或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏(ringer's)溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充性活性化合物也可以并入这些调配物中。用于调配物的溶液或悬浮液可以包含：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如防止聚集的吐温(tween)20；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节ph。在特定实施例中，药物组合物是无菌的。
[0221]
对于在体内接触视锥细胞的情况，可以将表达载体或包括表达载体的基因递送载体视为适宜向眼睛递送。
[0222]
适合于在本发明中使用的药物组合物进一步包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。因此，药物组合物可以呈无菌可注射溶液的形式。对于静脉内施用，适合的载剂包含生理盐水、抑菌水或磷酸酯缓冲盐水(pbs)。在一些情况下，组合物是无菌的并且应该具有达到易于注射的程度的流动性。在某些实施例中，组合物在制造和储存的条件下是稳定的，并且抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载剂可以是例如溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其适合的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选的是，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包含延缓吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现内部组合物的延长吸收。
[0223]
根据需要，可以通过将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种成分或其组合一起掺入适当溶剂中，随后通过过滤灭菌处理来制备无菌溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒剂中来制备分散液，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外所希望成分的粉末。
[0224]
在一个实施例中，所述组合物与将表达载体免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控制释放调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种调配物的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。所述材料还可以商购获得。也可以将脂质体悬浮液(包含用病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)用作药学上可接受的载剂。可以根据本领域技术人员已知的方法来制备这些调配物，例如如在美国专利第4,522,811号中所描述的方法。
[0225]
特别有利的是以剂量单位形式调配口服、眼部或肠胃外组合物以便于施用和剂量统一。如本文所使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位均含有经过计算产生与所需药物载剂缔合的所希望的治疗效果的预定量的基因递送载体或表达载体。本发明的剂量单位形式的规格由基因递送载体、表达载体的独特特性以及要实现的特定治疗效果来决定。
[0226]
可以将药物组合物与施用说明书一起包含在容器、包装、或分配器(例如，注射器，例如预充式注射器)中。
[0227]“药学上可接受的赋形剂”是指对细胞或待施用于的受试者基本上无毒的材料、物质、稀释剂或载剂。也就是说，在基本上不会引起不希望的生物学效应或者不会以有害的方式与含有药学上可接受的赋形剂的组合物的其它组分中的任何组分相互作用的情况下，可以将药学上可接受的赋形剂掺入药物组合物中并且向细胞或患者施用。
[0228]
可以将表达载体或基因递送载体(例如，重组病毒(病毒粒子))掺入药物组合物中，以向哺乳动物患者施用，具体地灵长类动物以及更具体地是人类。可以以无毒、惰性、药学上可接受的水性载剂调配表达载体或基因递送载体(例如，病毒粒子)，所述水性载剂的ph优选地处于3到8的范围内、更优选地处于6到8的范围内、或甚至更优选地处于7到8的范围内。这种无菌组合物将包括含有对治疗性分子进行编码的核酸的载体或病毒粒子，所述治疗性分子溶解于重构时具有可接受的ph值的水性缓冲液中。
[0229]
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括与药学上可接受的载剂和/或赋形剂混合的治疗有效量的载体或病毒粒子，所述药学上可接受的载剂和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和任选地一种或多种其它药剂，如氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂、蛋白质和无机盐(如氯化钠)。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏(hank's)溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，此调配物可在4℃下稳定至少六个月。
[0230]
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其它缓冲液，如由good等人,(1966)《生物化学(biochemistry)》5(2):467-477所描述的那些缓冲液。所述缓冲液的ph值可以处于6.5到7.75，优选地7到7.5，并且最优选地7.2到7.4的范围内。药物组合物可以包括腺病毒或腺相关的腺病毒载体递送系统，所述系统含有本公开的表达载体。
[0231]
将本发明的表达载体在体内递送到选择的靶细胞并且在转导事件后在细胞中和在细胞外环境中获得治疗有效量的基因产物的能力对治疗许多不同的疾病可能是有益的，所述疾病包含那些依赖于新血管生长的疾病，其中治疗的目标可以是使靶细胞具备分泌治疗有效量的抗血管生成蛋白的能力。虽然不希望受任何理论的束缚，但是即使当基因递送载体仅能成功转导一部分靶细胞时，能够增强表达并且最终增强治疗性蛋白分泌的表达载体也可以有助于为患者提供临床上显著的益处。由经过转导的细胞进行的治疗性蛋白的高水平分泌可以帮助平衡用任何给定剂量或基因治疗轮次实现的感染性或转导效率。
[0232]
因此，在本文统称为“组合物”的表达载体和基因递送载体可用于在动物细胞中对转基因进行表达。例如，组合物可以用于研究，例如确定基因对细胞活力和/或功能的影响。作为另一个实例，可以在医药中使用组合物以例如治疗病症。本公开的方法和组合物可以用于治疗能够通过细胞的基因疗法至少部分解决的任何病状。细胞包含但不限于血液、眼睛、肝脏、肾脏、心脏、肌肉、胃、肠、胰腺和皮肤。
[0233]
因此，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症(例如，眼部疾病或病症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括对治疗性基因产物进行编码的本发明的表达载体的病毒载体或病毒粒子。在优选实施例中，治疗性基因产物为分泌多肽或在细胞中合成后从细胞中分泌或输出的蛋白质，并且表达载体按5'到3'顺序包括：(i)第一增强子区，其包括cmv序列(seq id no:13)；(a)启动子区，其包括cmv序列(seqid no:9)；(b)5’utr区，其按5'到3'顺序包括tpl序列和emlp序列(分别为seq id no:2和seq id no:7)；(c)对肽或多肽进行编码的编码序列；(iii)第二增强子区，其包括人ifnb sar(seq id no:15)；以及(d)hgh多腺苷酸化位点(seq id no:12)。
[0234]
在相关实施例中，一些方法提供了在体外或体内细胞中对基因进行表达，所述方法包括使细胞与本公开的组合物接触。在一些实施例中，接触发生在体外。在一些实施例中，接触发生在体内，即，将组合物施用给受试者。可以通过静脉内注射或口服输注来胃肠外施用组合物。在某些实施例中，通过注射将所述组合物施用于眼睛，例如施用于视网膜、下视网膜或玻璃体。在某些实施例中，通过视网膜注射、下视网膜注射或玻璃体内注射来施用所述组合物。在某些实施例中，将所述组合物局部或直接施用于所关注的组织或器官，例如通过注射到肝脏中。
[0235]
受试者可以是哺乳动物，包含例如有特定疾病或病症治疗需要的人类受试者。
[0236]
对于哺乳动物细胞在体外与表达载体或包括表达载体的基因递送载体接触的情况，细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛、灵长类动物、人类。细胞可以来自已建立的细胞系或者可以是原代细胞，其
[0237]
中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用来指代源自于受试者的细胞和细胞培养物并且允许在体外生长培养物的有限数量的传代，即分裂。例如，原代培养物是可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但传代次数不足以经历危机阶段的培养物。通常，在体外维持本发明的原代细胞系少于10次传代。
[0238]
如果细胞为原代细胞，则可以通过任何方便的方法从哺乳动物中采集细胞，例如整个外植体、活组织检查等。可以用合适的溶液来分散或悬浮所采集的细胞。这种溶液通常将是平衡的盐溶液，例如生理盐水、pbs、汉克氏平衡盐溶液等，所述平衡的盐溶液方便地补充有以低浓度(通常为5-25mm)与可接受的缓冲液结合的胎牛血清或其它天然存在的因子。方便的缓冲液包含hepes、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。可以立即使用细胞或者可以将其储存、冷冻长时间段、解冻并且能够重复使用。在这种情况下，通常将细胞冷冻在10％的dmso、50％的血清、40％的缓冲培养基或如本领域常用的一些其它这种溶液中，以在这种冷冻温度下保存细胞并且以如本领域通常已知的用于解冻冷冻培养细胞的方式来解冻。
[0239]
为了促进对转基因的表达，将表达载体或包括表达载体的基因递送载体与细胞接触约30分钟到24小时或更久，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、
5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、24小时等。可以一次或多次(例如，一次、两次、三次或多于三次)地向受试者细胞提供表达载体或包括表达载体的基因递送载体，并且允许细胞在每次接触事件后(例如，16-24小时)与一种或多种药剂一起培育一定时间，在这之后用新鲜的培养基替换所述培养基并且对细胞进行进一步培养。接触细胞可以发生在任何培养基中以及在促进细胞存活的任何培养条件下。例如，细胞可以悬浮在任何适当的方便的营养培养基中，如伊思考夫氏(iscove's)改良的dmem或rpmi 1640，所述营养培养基补充有胎牛血清或热灭活的山羊血清(约5-10％)、l-谷氨酰胺、硫醇，特别是2-巯基乙醇和抗生素，例如青霉素和链霉素。培养物可以含有细胞响应的生长因子。如本文所限定的，生长因子是能够通过对跨膜受体的特异性作用而促进细胞在培养物或在完整组织中存活、生长和/或分化的分子。生长因子包含多肽因子和非多肽因子。
[0240]
通常，提供了有效量的表达载体或包括表达载体的基因递送载体以在细胞中产生转基因表达。如本文其它地方所讨论的，可以根据经验容易地确定有效量，例如通过检测转基因产物的存在或水平、通过检测对细胞活力或功能的影响等。通常，相对于由参照或对照表达载体进行的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。出于比较目的的参照表达载体的一个实例是本文所描述的cmv参照表达载体。在具体实施例中，转基因对分泌蛋白进行编码，并且表达载体以一定水平在哺乳动物细胞中表达分泌蛋白，其表达水平是由cmv参照对照表达载体在哺乳动物细胞中进行的分泌蛋白的表达水平的至少2倍、5倍、10倍、5倍到10倍、5倍到15倍或10倍到15倍。根据一些实施例，当所述转基因是编码非分泌性蛋白的转基因时，本发明的表达载体以一定水平在哺乳动物细胞中表达非分泌性蛋白，其表达水平与由cmv参照对照表达载体在哺乳动物细胞中进行的非分泌性蛋白的表达水平大致相同、处于其的10-20％内、低约1.5倍或低约2倍。可以通过免疫测定或抗原捕获测定来测量每个表达载体的分泌蛋白的表达水平，并且可以将所述表达水平表示为细胞外环境中每体积上清液(例如，细胞培养基或上清液)的蛋白质的量或浓度。
[0241]
用于测量生物或细胞样品中蛋白质的存在和数量(以及因此表达水平)的免疫测定法是本领域已知的(例如，hage,d.s.(1999)“免疫测定(immunoassays)”,《分析化学(analytical chemistry)》71(12):294-304；《免疫测定手册(the immunoassayhandbook)》,第4版：david wild(编辑)的配体结合、elisa和相关技术的理论与应用,爱思唯尔科学出版社(elsevier science)(2013))。通常，免疫测定基于靶蛋白与特异性结合蛋白质的抗体或抗体片段之间的反应。可以在液相或固相系统中进行免疫测定，但是为了便于检测，固相可以是优选的。适合的免疫测定包含但不限于夹心和竞争测定、蛋白质印迹、elisa(酶连接免疫吸附测定)、放射免疫测定(ria)、荧光免疫测定(fia)等。生物样品可以是细胞培养基或上清液(在细胞未裂解的情况下取自培养物的样品)、细胞裂解物、全细胞、血液、血清、血浆或其它体液或组织。在一些实施例中，如当转基因是可选标记物时，通过将经过修饰的细胞与剩余群体分离，可以使细胞群富集包括表达载体的那些细胞群。可以通过适合于所用可选标记物的任何方便的分离技术进行分离。例如，如果转基因为荧光标记物，则可以通过荧光活化细胞分选来使细胞分离，而如果转基因为细胞表面标记物，则可以通过亲和分离技术将细胞与异质群体分离，例如磁分离、亲和层析、用附着到固体基质上的亲和试剂进行“淘选”或其它方便的技术。提供精确分离的技术包含荧
光活化细胞分选仪，所述荧光活化细胞分选仪可以具有不同程度的复杂性，如多色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。可以通过采用与死细胞缔合的染料(例如，碘化丙锭)针对死细胞来选择细胞。可以采用对细胞活力不过度有害的任何技术。以此方式实现包括多核苷酸的细胞高度富集的细胞组合物。“高度富集”是指经过遗传修饰的细胞将为细胞组合物的70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多，例如细胞组合物的约95％或更多或98％或更多。
[0242]
对于细胞在体内与表达载体或包括表达载体的基因递送载体接触的情况，受试者可以是任何哺乳动物，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛、人类或非人灵长类动物。
[0243]
本发明的方法和组合物可用于治疗能够通过细胞的基因疗法至少部分解决的任何病状。细胞包含但不限于血液、眼睛、肝脏、肾脏、心脏、肌肉、胃、肠、胰腺和皮肤。一个实施例是一种用于治疗有治疗需要的受试者的医学病状的方法，所述方法包括向受试者施用含有如本文所公开的表达载体的基因递送载体，其中所述表达载体对有效减轻医学病状的一个或多个体征或症状的多肽进行编码。在一些实施例中，所述医学病状为眼部疾病，所述基因递送载体为腺相关病毒，并且所述多肽为由所述载体转导的细胞分泌的多肽。在一个实施例中，分泌性蛋白会抑制vegf信号传导。例如，分泌性蛋白可以是vegf结合蛋白。在一些实施例中，眼部疾病是脉络膜新血管形成或黄斑变性。黄斑变性的具体形式可以包含急性黄斑变性、非渗出性年龄相关黄斑变性和渗出性年龄相关黄斑变性。可以通过任何合适的方式进行施用，包含例如眼部递送、玻璃体内注射、眼内注射、视网膜注射、下视网膜注射、肠胃外施用、静脉内注射或输注以及肝脏中注射。
[0244]
老年性黄斑变性(amd)是一种常见的眼病，是导致老年人视力丧失的重要原因。根据眼底表现的不同，进展期的amd可以分为干性amd和湿性amd两类。vegf诱导的病理性脉络新生血管形成是湿性amd发病和进展的核心机制，可以导致渗出、出血和纤维瘢痕形成。抗vegf治疗是治疗湿性amd最为有效的方式，但是注射抗vegf抗体的疗效只能维持很短的时间，因此需要反复多次眼部的注射给药。用基因治疗载体如腺伴随病毒(aav)将能够表达阻断vegf生物活性的蛋白编码序列递送至眼底，则可以实现阻断vegf生物活性的蛋白持续表达，从而实现单次给药持续抑制病理性脉络新生血管形成。
[0245]
在一些实施例中，向有治疗需要的受试者的眼睛施用基因递送载体。在一些实施例中，通过眼内注射、通过玻璃体内注射或通过任何其它方便的施用模式或途径向受试者施用基因递送载体。在一些实施例中，受试者是患有黄斑变性或眼部新血管形成或可能有发生其的风险的人类受试者。
[0246]
在一些实施例中，方法产生治疗益处，例如预防病症发展、停止病症进展、逆转病症进展等。在一些实施例中，方法包括检测治疗益处是否实现的步骤。普通技术人员将理解，对治疗功效的这种测量将适用于被修饰的特定疾病，并且将认识到用于测量治疗功效的适当的检测方法。
[0247]
期望使用转基因获得的转基因表达是稳健的。因此，在一些情况下，通过测量治疗功效等，可以在施用后两个月或更短时间(例如，施用后4周、3周或2周或更短时间(例如，在施用组合物后1周))观察到转基因表达(例如，如通过测量基因产物的水平所检测到的)。期望转基因表达也会随着时间的推移而持续存在。因此，在一些情况下，通过测量治疗功效
等，可以在施用组合物后2个月或更长时间(例如，4个月、6个月、8个月或10个月或更长时间，在一些情况下，1年或更长时间，例如，2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年)观察到转基因表达(例如，如通过测量基因产物的水平所检测到的)。
[0248]
在某些实施例中，所述方法包括检测细胞中转基因表达的步骤，其中表达相对于由不包括本公开的一个或多个经过改进的元件的表达载体(即参照对照)进行的表达有所增强。通常，如通过例如早期检测、更高水平的基因产物、对细胞更强的功能性影响等证实的，相对于由参照(即，对照表达载体)进行的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍(例如，100倍)。一方面，转基因对分泌多肽(如sflt1)进行编码。
[0249]
通常，如果主题组合物为病毒(例如，包括本公开的多核苷酸表达载体的raav)，则用于在受试者中实现变化或产生治疗效果的有效量将为约1
×
108个载体基因组或更多个，在一些情况下，1
×
109个、1
×
10
10
个、1
×
10
11
个、1
×
10
12
或1
×
10
13
个载体基因组或更多个，在某些情况下，1
×
10
14
个载体基因组或更多个，并且通常不多于1
×
10
16
个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为至多约1
×
10
16
个载体基因组，例如1
×
10
15
个载体基因组或更少，例如1
×
10
13
个、1
×
10
12
个、1
×
10
11
个、1
×
10
10
或1
×
109个载体基因组或更少，在某些情况下，1
×
108个载体基因组，并且通常不少于1
×
108个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1
×
10
10
个到1
×
10
11
个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1
×
10
10
个到3
×
10
12
个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1
×
109个到3
×
10
13
个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1
×
108个到3
×
10
14
个载体基因组。
[0250]
在一些情况下，可以使用感染复数(moi)来测量待施用的药物组合物的量。在一些情况下，moi可以指载体颗粒或病毒基因组与多核苷酸表达载体可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些情况下，moi可以为1
×
106个。在一些情况下，moi可以为1
×
105个到1
×
107个。在一些情况下，moi可以为1
×
104个到1
×
108个。在一些情况下，本公开的重组病毒为约1
×
101个、1
×
102个、1
×
103个、1
×
104个、1
×
105个、1
×
106个或1
×
107个moi。
[0251]
在一些方面，单独剂量通常不小于对受试者产生可测量效果所需的量，并且可以基于组合物或其副产物的吸收、分布、代谢和排泄(“adme”)的药代动力学和药理学来确定并且因此基于受试者内的组合物的处置来确定。这包含考虑施用途径和剂量。根据临床前测定、根据安全性和递增以及剂量范围试验、个体临床医师-患者关系以及体外和体内测定凭经验可以容易地确定有效剂量和/或剂量方案。
[0252]
在许多实施方案中，可将重组病毒与一种或多种额外的化合物或疗法，包括第二种重组病毒、化疗剂、手术、导管装置和放射结合施用。组合疗法包括施用包含重组病毒和一个或多个额外的试剂的单一药物剂量制剂；也包括施用重组病毒和在其自己独立的药物剂量制剂中的一个或多个额外的试剂。例如，可将重组病毒和细胞毒性剂、化疗剂或生长抑制剂以单一剂量组合物的形式如组合制剂的形式一起施用给患者，或每种试剂可以以独立的剂量制剂施用。当使用独立的剂量制剂时，本发明vegf特异性融合多肽和一种或多种额外的试剂可同时施用或在分别交错的时间即按顺序施用。
[0253]
如此处所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻碍细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意指包括放射性同位素(例如i131、i125、y90和re186)、化疗剂和毒素如细菌、
真菌、植物或动物源的酶促活性毒素或它们的片段。
[0254]“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如塞替派、环磷酰胺制剂；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；次乙亚胺类和methylamelamine类包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺、trimethylolomelamine；氮芥子气类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、氮芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀、亚硝基苯脲类(nitrosoureas)如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类如aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁斯(新制癌菌素)、佐柔比星、抗代谢药如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、叶酸类似物如denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、thiamiprine、硫鸟嘌呤、嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟脲苷、依诺他滨、氟尿苷；
[0255]
雄激素类如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、抑制肾上腺类药物如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、叶酸再补充类药物如frolinic酸；醋葡醛内酯；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺、地吖醌、elfornithine；依利醋铵；依托格鲁、硝酸镓、羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；phenamet；吡柔比星、鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2
”-
三氯三乙胺；urethan；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；派泊溴烷；gacytosine；腺嘌呤阿糖甙(arabinoside)；环磷酰胺；噻替派；紫杉醇类药物(taxanes)，如紫杉醇(bristol-myers squibboncology，princeton，n.j.)；多西他塞(aventis antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类药物如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂；依托泊苷(vp16)(etoposide(vp-16))；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维苯；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维a酸；esperamicin类；卡培他滨；以及任意上述药物的可药用盐、酸或衍生物。用作调节或抑制激素对肿瘤起作用的抗激素剂也包含在本定义中，所述的抗激素剂包括例如抗雌激素类药物；如他莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟三苯氧胺(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬、keoxifene、ly 117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(fareston))；和抗雄激素类药物如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任意上述药物的可药用盐、酸或衍生物。
[0256]
当在这里使用“生长抑制剂”时指在体外或体内抑制细胞生长，特别是癌细胞生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除了s期的其它阶段)的试剂，例如诱导g1期阻断和m期阻断的试剂。经典的m期阻断剂包括vincas(长春新碱和长春碱)、和拓扑异构酶ii抑制剂如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻断g1的
那些剂也延长到s期的阻断，例如dna烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。
[0257]
本说明书中提及的所有以上美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利公开以全文引用的方式并入本文中。
[0258]
根据前文应当理解，尽管出于说明的目的已经在此描述了本发明的具体实施例，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除所附权利要求之外，本发明不受限制。
[0259]
实施例
[0260]
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开内容和说明，并且以下实例不旨在限制诸位发明人视为其发明的范围，以下实例也不旨在表示以下实验是进行的所有实验或仅有的实验。
[0261]
实施例1表达载体的构建
[0262]
为了研究来自腺病毒的三联前导序列(tpl)序列和来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件序列(emlp)对基因表达的影响，设计了由tpl序列和emlp序列组成的调控核酸分子来调节基因的表达。选择以下4种tpl序列：tpl1、tpl2、tpl3和tpl4，其核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4所示。选择以下4种emlp序列：emlp1、emlp2、emlp3和emlp4，其核苷酸序列分别如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8所示。基于上述4种tpl序列和4种emlp序列的组合，设计以下16种调控核酸分子：
[0263]
调控核酸分子11，由tpl1和emlp1组成，其核苷酸序列如seq id no:19所示；
[0264]
调控核酸分子12，由tpl1和emlp2组成，其核苷酸序列如seq id no:20所示；
[0265]
调控核酸分子13，由tpl1和emlp3组成，其核苷酸序列如seq id no:21所示；
[0266]
调控核酸分子14，由tpl1和emlp4组成，其核苷酸序列如seq id no:22所示；
[0267]
调控核酸分子21，由tpl2和emlp1组成，其核苷酸序列如seq id no:23所示；
[0268]
调控核酸分子22，由tpl2和emlp2组成，其核苷酸序列如seq id no:24所示；
[0269]
调控核酸分子23，由tpl2和emlp3组成，其核苷酸序列如seq id no:25所示；
[0270]
调控核酸分子24，由tpl2和emlp4组成，其核苷酸序列如seq id no:26所示；
[0271]
调控核酸分子31，由tpl3和emlp1组成，其核苷酸序列如seq id no:27所示；
[0272]
调控核酸分子32，由tpl3和emlp2组成，其核苷酸序列如seq id no:28所示；
[0273]
调控核酸分子33，由tpl3和emlp3组成，其核苷酸序列如seq id no:29所示；
[0274]
调控核酸分子34，由tpl3和emlp4组成，其核苷酸序列如seq id no:30所示；
[0275]
调控核酸分子41，由tpl4和emlp1组成，其核苷酸序列如seq id no:31所示；
[0276]
调控核酸分子42，由tpl4和emlp2组成，其核苷酸序列如seq id no:32所示；
[0277]
调控核酸分子43，由tpl4和emlp3组成，其核苷酸序列如seq id no:33所示；
[0278]
调控核酸分子44，由tpl4和emlp4组成，其核苷酸序列如seq id no:34所示。
[0279]
构建了一种阿柏西普的表达载体，其结构如图1所示。所述表达载体按5'到3'顺序包含：cmv增强子(其核苷酸序列如seq id no:13所示)、cmv启动子(其核苷酸序列如seq id no:9所示)、tpl序列、emlp序列、内含子序列(其核苷酸序列如seq id no:14所示)、kozak序列、aflibercept编码序列(其编码蛋白如seq id no:10所示；其核苷酸序列如seq id no:
11所示)、人ifnb sar序列(其核苷酸序列如seq id no:15所示)和bgh polya序列(其核苷酸序列如seq id no:12所示)。
[0280]
构建了以下16种包含不同tpl和emlp组合的aav-aflibercept表达载体(见表1)，其编号分别为11、12、13、14、21、22、23、24、31、32、33、34、41、42、43、44。上述16种aav-aflibercept表达载体除了由tpl和emlp组成的调控核酸分子外，其他序列均相同。
[0281]
还构建了只包含cmv增强子和cmv启动子、aflibercept编码序列和bgh polya序列的基线对照载体aav-afibercept-basic，编号为basic(以下简称basic载体)。所述basic载体除了不具有tpl、emlp和intron序列外，其他序列均与上述16种aav-aflibercept表达载体的序列相同。
[0282]
表1 aav载体的序列元件组合方式
[0283][0284]
实施例2细胞转染实验
[0285]
1.293t细胞转染模型
[0286]
分别将实施例1构建的16种包含由不同tpl和emlp组成的调控核酸分子的aav-aflibercept表达载体以及basic载体使用pei转染至293t细胞。转染48小时后，分别收获细胞培养上清及细胞总蛋白。使用western blot分析293t细胞内aflibercept蛋白的表达水平，使用hrp抗-人igg(识别aflibercept的fc段)进行捕获和检测(图2a)，使用hrp抗-人gapdh检测gapdh蛋白作为内参。利用elisa分析293t上清中的分泌性aflibercept蛋白，使用anti-human igg(识别aflibercept的fc段)抗体进行捕获和检测(图3a)。结果发现相较于basic载体，多种含有tpl和emlp元件的aav-aflibercept载体具有显著增高的细胞内和上清aflibercept水平，包括编号为11、13、14、21、22、23、24、31、41、42、43和44的载体。
[0287]
2.arpe-19细胞转染模型
[0288]
分别将实施例1构建的16种包含由不同tpl和emlp组成的调控核酸分子的aav-aflibercept表达载体以及basic载体使用pei转染至arpe-19细胞。转染48小时后，分别收获细胞培养上清及细胞总蛋白。使用western blot分析arpe-19细胞内aflibercept蛋白的表达水平，使用hrp抗-人igg(识别aflibercept的fc段)进行捕获和检测(图2b)，使用hrp抗-人gapdh检测gapdh蛋白作为内参。利用elisa分析293t上清中的分泌性aflibercept蛋白，使用anti-human igg(识别aflibercept的fc段)抗体进行捕获和检测(图3b)。结果发现相较于basic载体，多种含有tpl和emlp元件的aav-aflibercept载体具有显著增高的细胞内aflibercept水平，包括编号为11、13、14、21、22、23、24、31、41、42、43和44的载体。
[0289]
实施例3细胞感染实验
[0290]
考虑质粒转染细胞和aav病毒颗粒感染细胞后，含有外源aflibercept编码序列的dna状态具有显著的差异，为了进一步模拟aav基因治疗的应用场景，使用了293t细胞(crl-3216tm)转染aav-dj、aav helper包装系统(cell biolabs,vpk-400-dj)以及任意一种afibercep表达载体，以包装生产aav病毒颗粒。
[0291]
aav病毒包装纯化的步骤如下：
[0292]
1)第0天(day 0)：细胞接种
[0293]
将293t接种于15cm培养皿中(接种数量由预期的病毒量决定)
[0294]
2)第1天(day 1)：质粒转染
[0295]
15cm培养皿转染体系：15μg aav表达质粒+15μg g aav helper+15μg g包膜
[0296]
3)第3天(day 3)：转染48h后
[0297]
a.准备液氮
[0298]
b.消化aav293，并收集至50ml离心管中(corning管比较耐受冷冻)，用pbs洗两次，1200rpm离心5min，吸干pbs；
[0299]
c.每个15cm培养皿用～2ml cell lysis buffer重悬细胞(每一种病毒的总裂解液体积不超过6ml)，使用液氮冻结细胞后，立即使用37℃水浴解冻，重复3次以充分裂解细胞；再次用液氮冻结细胞后，可以置于-80℃保存，或者继续纯化流程；
[0300]
4)37℃水浴解冻细胞裂解液后，加入benzonase至终浓度50u/ml(25u/ul benzonase储存液加8μl至4ml)，加入脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)至终浓度0.5％37℃水浴30min；
[0301]
5)碘克沙醇(iodixanol)密度梯度溶液配置(optprep为60％碘克沙醇，361625离心管的容量为32.4)
[0302]
表2碘克沙醇(iodixanol)密度梯度溶液配置
[0303][0304]
6)用10ml注射器灌注密度梯度：依次灌注9ml 15％碘克沙醇层，6ml 25％碘克沙醇层，5ml 40％碘克沙醇层和2ml 60％碘克沙醇层，密度从低到高进行灌注，每次灌注时均将注射器针头插至离心管底部，灌注时避免产生气泡；
[0305]
7)4500rpm，4℃离心30min；
[0306]
8)将包含病毒的细胞裂解上清(约6ml)，铺于密度梯度的最上层，用细胞裂解液封顶并配平；
[0307]
9)使用beckman ti70 rotor，67,000rpm 18℃离心1h，最大的加速度和刹车；
[0308]
10)使用10ml注射器和18g针头，在60
–
40％交界面下3
–
5mm穿刺(针头斜面朝上)，收集3
–
4ml含病毒的40％碘克沙醇的液层(避免40
–
25％界面的蛋白污染)；可以分管收集约500ul/管；
[0309]
11)取1-2ul各管收集液，20倍稀释后测定340nm的吸光度，最高吸光度之前的收集管都可以保留并混合；
[0310]
12)使用100k的蛋白浓缩管，最高转速离心，浓缩病毒上清，加入20ml pbs漂洗一次，再次离心浓缩至期望体积；
[0311]
13)可以使用hitrap heparin affinity column进一步纯化，或者使用100k的小体积蛋白浓缩管，进一步浓缩病毒。
[0312]
纯化和定量aav病毒后，使用携带不同aav-aflibercept载体的病毒在体外感染arpe-19细胞。感染72小时后，分别收获细胞培养上清及细胞总蛋白。使用western blot分析细胞内aflibercept蛋白的表达水平，使用anti-human igg(识别aflibercept的fc段)进行捕获和检测(图4)。利用elisa分析培养上清中的分泌性aflibercept蛋白使用anti-human igg(识别aflibercept的fc段)进行捕获和检测(图5b)。结果发现相较于basic载体，多种含有tpl和emlp元件的aav-aflibercept载体具有显著增高的细胞内和上清aflibercept水平。
[0313]
同时，利用感染72小时后的部分arpe-19细胞提取dna，然后使用aav基因组itr特异性引物进行实时pcr，确定各个实验组细胞内的平均aav基因组拷贝数，定量分析病毒感染后细胞内的病毒拷贝数(图5a)，并计算arpe-19细胞感染相应的aflibercept表达质粒包装所得aav病毒后，细胞内每个病毒拷贝对应的aflibercept表达水平，平均每个细胞内病毒基因组对应的上清中aflibercept蛋白量，以进一步准确地评估各种aav-aflibercept载体的表达水平(图5b)。
[0314]
实施例4不同细胞模型数据的整合分析
[0315]
为了整合上述实施例2和实施例3中的三种细胞模型中载体的表达水平，筛选出最有潜力的载体进行体内评估，对不同ao载体在转染后和感染后细胞的胞内和上清中aflibercept蛋白表达水平进行相关性分析(图6)。利用三种不同细胞模型中aflibercept蛋白水平绘制气泡图。x轴代表arpe-19细胞转染模型上清中分泌性aflibercept蛋白的水平，y轴代表293t细胞转染模型上清中分泌性aflibercept蛋白的水平；气泡的大小代表arpe-19细胞感染模型上清中分泌性aflibercept蛋白的水平，气泡着色的深度代表arpe-19细胞感染模型细胞内aflibercept蛋白的表达水平；气泡上方数字编号的字体大小代表293t细胞转染模型中细胞内aflibercept蛋白的表达水平；气泡右侧数字编号的字体大小代表293t细胞转染模型中细胞内aflibercept蛋白的表达水平。
[0316]
结果发现aav-aflibercept-23和aav-aflibercept-24这两种载体在293t细胞和arpe-19细胞中均有较高蛋白表达水平，aav-aflibercept-14在293t细胞中蛋白表达最高，aav-aflibercept-43在arpe-19细胞中蛋白表达最高。
[0317]
实施例5 aav-aflibercept载体大鼠视网膜内表达水平评估
[0318]
选择aav-aflibercept-23、aav-aflibercept-24、aav-aflibercept-43和aav-aflibercept-14四种aav载体进行后续开发，分别命名为ao-1(其核苷酸序列如seq id no:35所示)、ao-2(其核苷酸序列如seq id no:36所示)、ao-3(其核苷酸序列如seq id no:37所示)和ao-4(其核苷酸序列如seq id no:38所示)。使用了aav8包装系统，293t转染aav8、aav helper以及任意一种afibercep表达载体，以包装生产aav病毒颗粒。
[0319]
表3 aav载体名称对照表
[0320][0321]
取bn大鼠，视网膜下分别注射ao-1、ao-2、ao-3和ao-4四种病毒，每只大鼠眼球注射4e10 gc(genome copies)病毒。注射四周后，分离房水用于elisa分析分泌性aflibercept蛋白的水平(图7a)；分别提取视网膜组织和脉络膜组织总蛋白，用于western blot分析细胞内的aflibercept蛋白表达水平(图7b、7c)。
[0322]
同时，提取视网膜组织dna，利用实时pcr检测视网膜组织中aav基因组拷贝数，定量分析病毒感染后细胞内的病毒拷贝数(图7d)，并计算细胞内每个病毒拷贝对应的aflibercept表达水平，以进一步准确地评估注射ao-1、ao-2、ao-3和ao-4四种病毒后，大鼠视网膜房水中平均每个病毒基因组对应的分泌性aflibercept蛋白的水平(图7e)；以及大鼠视网膜和脉络膜中平均每个病毒基因组对应的胞内aflibercept蛋白的水平。结果发现，注射ao-1病毒的大鼠中，细胞内平均aav基因组拷贝数最高；注射ao-2病毒的大鼠中，房水中分泌性aflibercept水平、视网膜和脉络膜中的细胞内平均aflibercept水平均最高(图7f，g)。