一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法与流程

一种生产a82846b的基因工程菌及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种生产a82846b的基因工程菌及其构 建/制备方法与应用。


背景技术：

2.随着抗菌药物应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重，耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa)在皮肤感染中的比例逐 年上升。临床通常使用糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁等治疗由mrsa引起的 严重感染。然而，耐万古霉素菌株的迅速出现，使得寻找新型抗mrsa抗菌药物 迫在眉睫。2014年8月6日，the medicines公司开发的新型糖肽类抗菌药物奥利 万星获美国食品药品监督管理局(fda)批准上市，商品名为orbactiv。该药用于治 疗由敏感革兰阳性菌(包括mrsa)引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染的首个 和唯一一种单剂量治疗方案的抗生素。奥利万星(oritavancin)是在第一代糖肽抗生 素的基础上开发的第二代糖肽抗生素，其作用机制是通过阻断肽聚糖生物合成时 转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成。故该类化合物对细菌细胞具有高度的特异性， 能迅速杀灭细菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。
3.a82846b是奥利万星的合成前体，分子式是c
86h97
cl2n
10o26
，它的结构与多 数糖肽类抗生素的结构类似，是万古霉素的结构相类似。目前，大规模微生物发 酵法是生产a82846b的主要方式，发酵液还会有a82846a和a82846c产生。 a82846a和a82846c都是a82846b的结构类似物，三者的结构式如下式1所示， 三者的区别在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸残基的取代基上的氯原子，a82846b 在2和6位取代基上各有一个氯原子，a82846a只在2位取代基有一个氯原子， a82846c没有氯原子(表1)。由于发酵液中a82846a和a82846c产生，给a82846b 的生产和后续的分离纯化增加了成本。由式可知，三种物质结构非常接近，分离 纯化工作比较困难。目前，关于奥利万星关键中间体a82846b提取分离的文献报 道较少。欧洲专利ep0280570a2及美国专利us4845194公开了三种物质的分离方 法，其中a82846b的分离方法为：将发酵液通过阳离子(nh
4+
)交换树脂进行初 步富集，然后通过制备性高效液相色谱柱分离，最后经过hp20ss树脂精制。专利 中主要进行了此3步纯化，后面的两个步骤的收率仅为29％，总收率更低。
[0004][0004][0005]
因此，通过构建新的生产a82846b的发酵菌株，从而减少发酵过程中结构类 似物的含量，从而降低生产成本，简化操作步骤，降低环境污染，提高收率，满 足工业化生产的需求。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中上述a82846b发酵过程中，副产 物a82846a和a82846c产生，减少生产a82846b及其分离纯化的时间和经济成 本；提供一种生产a82846b的高产低杂基因工程菌及其构建方法和应用，可以利 用基因工程技术提高生产a82846b的效率，降低成本。
[0007]
随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段能够定向改造或修饰抗生素 的生物合成基因簇，获得新型抗生素或提高抗生素产量。然而，本发明的难点在 于a82846b目标产物及其副产物a82846a和a82846c的产生在其生产菌中的基 因调控机理尚未清楚，特别是a82846a、a82846b与a82846c间的相互转化，以 及与其内部存在的卤化酶的关系均不清楚。本发明通过诸多研究和试验，发现将 内源卤化酶基因或糖基转移酶a基因导入产a82846b的宿主菌，使之过表达，获 得的工程菌产物中各物质的含量发生了变化，副产物a82846a和a82846c的产量 和/或比例显著降低，和/或a82846b产量和/或比例明显提高。
[0008]
因此，本发明的技术方案之一是：一种生产a82846b的基因工程菌，其特征 在于，其是在生产a82846b的出发菌荒漠拟孢囊菌(kibdelosporangium aridum)的 基因组中同源重组整合了人工构建的attb位点，同时整合了内源卤化酶基因orf10 和内源性糖基转移酶a基因orf11的基因工程菌。
[0009]
优选的，所述attb位点是同源重组插入的人工合成的外源基因片段。所述卤 化酶基因orf10和糖基转移酶基因orf11来源于自身基因。
[0010]
本发明在一较佳实施例中，是在宿主菌sipi-3927中导入一个人工构建的attb 位点，构建含attb位点的pkc1139-attb同源重组质粒，经过双交换筛选获得新宿 主菌sipi-3927-attb，其特征在于插入一个人工attb位点。
[0011]
本发明在一较佳实施例中，是在新宿主菌sipi-3927-attb中导入荒漠拟孢囊菌 的卤化酶基因orf10，使卤化酶过表达。
[0012]
本发明在一较佳实施例中，是在新宿主菌sipi-3927-attb中导入荒漠拟孢囊菌 的糖基转移酶a基因orf11，使糖基转移酶过表达。
[0013]
本发明在一较佳实施例中，是在新宿主菌sipi-3927-attb中导入荒漠拟孢囊菌 的卤化酶基因orf10和糖基转移酶a基因orf11，使卤化酶和糖基转移酶同时过表 达。
[0014]
更优选的，所述的卤化酶基因orf10优选来源于荒漠拟孢囊菌sipi-3927菌株， 其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述糖基转移酶a基因orf11是来源于荒漠拟 孢囊菌sipi-3927菌株，其核苷酸序列如seq id no.2所示；attb的核苷酸序列如 seq id no.3所示；同源重组质粒pkc1139-attb核苷酸序列如seq id no.4所示； 过表达质粒pset152-orf10-orf11核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0015]
本发明所述的基因工程菌为荒漠拟孢囊菌sipi-3927-d20(kibdelosporangiumaridum),保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.19794。
[0016]
本发明的再一技术方案是：一种本发明上述基因工程菌的制备方法，所述制 备方法包括下列步骤：
[0017]
1)pcr人工合成attb的全基因；
[0018]
2)构建含attb的同源重组pkc1139质粒，并转入大肠杆菌中；
[0019]
3)将带有重组质粒的大肠杆菌和生产a82846b的出发菌sipi-3927进行接合 培养；
[0020]
4)双交换筛选获得新宿主菌sipi-3927-attb；
[0021]
5)pcr扩增或人工合成orf10、orf11或orf10-orf11的全基因；
[0022]
6)构建过表达orf10、orf11或orf10-orf11的重组pset152质粒；
[0023]
7)将构建的重组质粒转化到新宿主菌sipi-3927-attb；
[0024]
8)将带有重组质粒的新宿主菌和生产a82846b的出发菌进行接合培养。
[0025]
较佳地，所述重组质粒的骨架为pkc1139质粒或pset152；优选地，所述的 中间宿主菌为大肠杆菌et12567/puz8002；优选地，所述的接合培养为在misp4 琼脂培养基培养，温度为28℃。
[0026]
本发明的另一技术方案是：一种a82846b的制备方法，包括将上述任一种基 因工程菌发酵，从发酵液中获得a82846b。培养发酵方法可以选用现有a82846b 生产菌、特别是荒漠拟孢囊菌的培养发酵方法。
[0027]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各 较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0028]
本发明的积极进步效果在于：本发明通过在a82846b的生产菌荒漠拟孢囊菌 中过表达内源的卤化酶基因orf10及糖基转移酶a基因orf11，可以将a82846a和 a82846c转化为a82846b，提高a82846b产量和/或在总产量中所占的比例，和/ 或降低两种副产物a82846a和a82846c的产量或和/在总产量中所占的比例，提 高了生产效率，降低生产成本，减少环
境污染。
[0029]
卤化酶基因orf10的核苷酸序列表seq id no.1：
[0030]
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[0031]
糖基转移酶a基因orf11的核苷酸序列如seq id no.2：
[0032]
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[0033]
attb的核苷酸序列表seq id no.3：
[0034]
ccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccac
[0035]
同源重组质粒pkc1139-attb的核苷酸序列表seq id no.4：
[0036]
tgtgaggaggctggtcctttaccctgatgcccgagggcatcagggtaaaggaccagcctcgccaactaggagcgcta ccaaggcgaacacaacccaggacttggtagaacccttcgccggagaagttcagactcatcggcatgagcacccctcgccgc gcactcggcaccggtccgtcgaccaccaccaggacgtcgttgtcgacgtcggccccgcggctcctgcccgccgaacgcgtc gtcgtcgacggcctggtgctcatcgacgagcacccggagccaggtgaaaagcgccggcggacgctcggactgggcgcgg gattccagcagtaacccaggtccgccggccacctcacggcaggcagaccctcggctttcgcgccgggaccgccatgagact gccacccggatgtccggggtggcggtctcatggcggtccctcagcggccctacgcgaccgctgtgtcgacgcggaggcag tctccggggagccggccccagggctggagtaccggggcgagcttgctcatggcggtccctcagcggccctacgcgaccgc tgtgtcgacgcggaggcagtctccggggtgctggccccagggctggagtaccggggcgagcttgcccttgcagcggcggc acacgggcgacgcggcgccgggcgggggagtcttgacgtcgacggtgaccggcttcggcttcaggcgcttccgaaggctg atcgtcgggcggatcgcctccttcttcggctgacgcactcggtcgagcgaagcggccagctcctccgtgcgggcctcgttgg ccttccggcgcgcctcgcggaaagcagcttcctcctcggacatgacctcgaacctcatctggtcagcgtcaaggtcgcccgg cgcggccggcgcttccggggcgggcgggtccaggacgtccttgccccacaccaggcctcaggactcgacgagccgccgg acgcccggtaggccgtacgtctcggcgaccttgatgaggtcgaggcgacgtccggcgacgcgggcgatgtatcggtacca gatgtaggccgggatgaccgcgatggcgaccaggccctcggtgtcgtcggtgatctcctcctcggtgcggacgtcctgctgg atgccgagttccttgatcagccggttcaggttctgcgaccggtagtgcttgcggacctggaagacgccgaactcgcgctcgcg gtacttctcgacgaacgggccgggccgacgaagccgctgcagctcggcggccgccgcgtcgcccaggtcgagcggtccc atgcggtcgtcgccgcgaccggccttgaagttctgtccggccagctccaggccgatcttggcgacgccgcccttggtcttgtc gccgtccttgtagaggtagcgggcctgcttgcccgcatcgccgtcagcggcgtccgcgccgttgagtgggcgcacgtcggt gccgtggcccttgccctcacaggagcaaccgggccggtcgcacgtctcgctgacggtgtagccgcccgcggattcgacccc ggcggcccaggctccggcgagtgcgtcgcggaacgcggcctgggcgtccgggccgagcacctcgcgggtgacccagag cgtgtgccagtgcaggtgccagccggagccccagccgaaggtgtcctcgaaggcccgctcgtagccgatgatcccgaagtc gtcgcgcatcgtgcgccagcggcggccggacgagccgtacgcgcccttccagccgtcgtgcaagaccgcgaccaggccg tgccgcattcccttgcggacggtgccgaacgccatgcgctcgaagtggcgcaacgtgttcgtgccaaggtgcagcccgtacc cggcgtccgcgagaccgtcggcggcgagctgcacgttcgagccccgtacggccaggatgcggctcatgcaccacgggca ggtgtggacgttgttgcagcggcacgtgttgccccacgtcgcctcgcccggcttccacatcagctcggccgtcccggcagtg agccgggtcccgcagcccttgaacgcctcgttcagcgacaccgtctggtgccggtcccgccgggcgaaccgctcgtcgcgc gggtcctcccgcccggctgtcgcggcaccctcgtttggggtagaacccgttccagttacagcgctctgacctgcagtggacg gagattttcccttactactaaagcccgcgtccggattacccgctgtagtcgtgcttgctacgctgcgtgactggtccgcaatgag acgctttgcgcgctttcggcaggcgtccgagcagtagattttggggcgcttcccggggatgtggacgatcggggtgccgcag tggcacttcggtccggcggggcgcggtggtgtcgacgcgctgttctctcgtacgctcgtcacagagcaaacgtcctcactcgg catgctgcgccggttcgggggcggcgagcccgggaggccaatcccgggctcgtgccatttctgggtcctgttgatcctggca ttggtgtggccgttcattgcccctgctcgctcctgacgcgccgatagacgtccgatacgcccggtgctggtgggatttgatagg tcggaagaagccccgcccgggcctgggcggggcttcctgtgcgtcaggacctcctcgtcgtgagcctcttcggcctatggac ggagtgacctcgtgatccgtta
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[0037]
质粒pset152-orf10-orf11的核苷酸序列表seq id no.5：
[0038]
atctacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcgcagggcgaagaa tctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgtta tgttgatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaatttatgcggtgtgaaataccgcac agatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgg gcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtca cgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgggctgcaggtcgactctagatgttcacattcgaaccgtctctgctttgaca acatgctgtgcggtgttgtaaagtcgtggccaggagaatacgacagtctaagtaaggagtgtccatatgtcggtcgaagacttc gatgtggttgttgctggtggcgggcctgccggttcgaccgtggccaccttggtggcgatgcaggggcatcgggtgctgttgct ggagaaagaggtctttccccggtaccagatcggtgagtcgctgctgcctgccacggtgcacggggtgtgccggatgctcgg catcacggacgagctggccaatgccgggttcccggtgaagcggggcggcactttccgctggggtgcgcgtccggagccgt ggacgttccacttcggtatctccgccaagatggcgggctcgacgtcgcacgcctatcaggtcgagcgggcgcggttcgacga gatcttgctgaacaacgccaagcgcaagggcgtggtcgtgcgggaagggtccccggtcaccgatgtggtggaagacggtg agcgggtcaccggtctgcggtacaccgacgccgatggcaacgagcgtgaagtgtcagcgcgcttcgtgatcgacgcgtcgg gcaacaagagccgcctctactccaaggtcggcggttcgcggaactactcggagttcttccgcagcctcgcgctgttcggctac ttcgagggtggcaagcggctgcccgcgccggtctcgggaaacatcctgagcgttgccttcgacagcggctggttctggtaca tcccgctgagcgacacgctgaccagcgtcggcgcggtggtgcgccgggaggacgccgagaagatccagggtgaccggg agaaggcgctcaacgccctgatcgccgagtgcccgctgatctcggagtacctcgcgaacgcgaccagggtgacgaccggc aagtacggggagttacgcgtccgcaaggactactcctaccagcaggagacctactggcggccggggatgatcctgatcggc gacgccgcgtgcttcgtggacccggtgttctcgtccggtgtgcacctggcgacctacagcgcgctgctcgcggcccggtcaa tcaacagcgtcctggcgggcgatctggacgagaagaccgcactgaacgagttcgaaatgcggtatcgccgcgagtacggg gtgttctacgagttcctcgtgtcgttctatcagatgaacgtgaatgaggagtcgtatttctggcaggccaagaaggtcacgcaga accagagcaccgatatcgagtcgttcgtcgaactgatcggtggggtgtcgtccggtgagaccgcgctgacggccgctgacc ggatcgccgcgcgcagtgccgaattcgccgcggccgtggaccagatggccagcggcgacggcgacaacatggtgccgat gttcaagtcgacggtggtcaagcaggcgatgcaggaagcgggccaggtccagatgaaggcgctgctcggcgaggacgcc gaacccgagctgccgctgttccccggcggcctggtgacctcgcccgacggaatgaaatggctgccgcaccatccggcatga gcctccgcacggtggtcgaggatctacgaaataggggatgcgaaatgcgcgtgttgattacggggtgtggatcgcgcggag ataccgaaccgttggtggcattggcggcacggttgcgggaactcggtgcggacgcgcggatgtgcctgccgccggactacg tggagcggtgcgccgaggtcggtgtgccgatggtgccggtcggtcgggcggtgcgcgcaggggcacgcgagccgggag aactgccgccgggggcggccgaagtcgtgaccgaggtggtcgccgaatggttcgacaaggtcccggcggccatcgaggg gtgtgacgcggtggtgacgaccggcttgctgccc
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附图说明
[0039]
图1为pkc1139-attb质粒图谱。
[0040]
图2为pset152-orf10-orf11质粒图谱。kaso*p为启动子序列，int为整合酶 基因，rep origin1为复制起始位点，acc(3)iv为安普霉素抗性基因，attp为整合位 点。
[0041]
图3为不同菌株发酵产物hplc图谱，从上至下依次是sipi-3927、 sipi-3927-orf10、sipi-3927-orf11、sipi-3927-orf10-orf11(sipi-3927-d20)菌株的 发酵产物图谱。
具体实施方式
[0042]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述 的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和 条件，或按照商品说明书选择。
[0043]
实施例1
[0044]
构建含人工attb位点的新宿主菌sipi-3927-attb
[0045]
(1)pkc1139-attb质粒构建
[0046]
将pkc1139质粒以bamh1与xba1 37℃酶切反应，获得双酶切线性载体片段。 以引物orf35-attb-f/r、orf36-attb-f/r为引物(南京金斯瑞生物科技有限公司有限 公司)，以sipi-3927基因组为模板进行pcr扩增获得大小为1000bp的左右同源 臂，反应体系(50μl)包括：25μl 2
×
pcr buffer缓冲液，2μl 2mm dntps，1μl fx 酶，2.5μldmso，17.5μl h2o,上下游引物各1μl，模板基因组0.3μl。pcr反应 程序为95℃4min，13个循环(95℃30s，60℃30s，72℃90s)，24个循环(95℃ 30s，71℃30s，72℃90s)，72℃10min，16℃5min。
[0047]
两段各1000bp的pcr产物与pkc1139的载体片段进行多片段重组；6μl多 片段重组反应体系为：1.2μl 5
×
buffer，0.6μl c113-02(25rxn)，载体：片段＝1：5， 然后加无菌去离子水至6μl，37℃水浴反应30min。将反应好后的重组体系加入到 25μl感受态细胞dh5α(预先放置在冰浴上)中，混匀冰预冷30min，42℃水浴热 激90s，再放回冰浴5min，然后加入200μl lb，37℃摇床培养1h。将整个体系涂 布于含有安普霉素的lb固体平板中，37℃倒扣培养过夜。长出的单菌落进行pcr 验证，验证正确的单菌落接种于含有50μg/ml安普霉素的2ml lb培养基中， 250rpm、37℃培养过夜。培养后的菌液抽提质粒送测序验证与酶切验证，至此得 到了质粒pkc1139-attb。
[0048]
(2)大肠杆菌et12567/puz8002/pkc1139-attb的获得
[0049]
将pkc1139-attb质粒导入到pset152/puz8002感受态细胞。方法同质粒导入 dh5α感受态细胞一致。菌液涂布于含有三抗(含安普霉素50μg/ml，氯霉素 25μg/ml，卡那霉素50μg/ml)的lb固体培养基，倒扣培养过夜，获得。
[0050]
(3)新宿主菌sipi-3927-attb的筛选
[0051]
将宿主菌sipi-3927接种到新鲜的斜面上，28℃培养5-6天，待白色的菌体长 出，用接种铲铲取约1cm的菌体接种到25ml yeme液体培养基中，28℃，200rpm， 培养2天，按1％接种量转接到25ml yeme培养基中，28℃，200rpm，培养1天。 离心去上清得菌丝体，用lb液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2ml的lb液体培 养基中，此为宿主菌液。
[0052]
将携带质粒pkc1139-attb的中间宿主大肠杆菌et12567/puz8002接种到5ml 含氯霉素、卡那霉素和安普霉素(生工生物工程有限公司)的浓度分别为25μg/ml、50μg/ml和50μg/ml(氯霉素、卡那霉素抗性来源来自宿主菌的puz8002)的lb液体 培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。按1％的接种量转接到25ml的相同培养基 中，37℃，200rpm培养约4小时后，使od值为0.4-0.6，用lb液体培养基洗涤2 次，最终悬浮于2ml的lb液体培养基中，此为带有pkc1139-attb质粒的大肠杆 菌液。
[0053]
将上述所制的sipi-3927宿主菌液与中间宿主大肠杆菌液按体积比1:1混合于 离心管中，充分混合后，涂布misp4琼脂培养基(甘露醇0.5％、葡萄糖0.1％、可 溶性淀粉0.5％、黄豆饼粉0.5％、胰蛋白胨0.2％、酵母提取物0.1％、硫酸铵0.2％， 氯化钠0.1％、磷酸氢二钾0.1％、碳酸钙0.2％、微量元素1ml，琼脂粉2％)。28℃ 培养15h后，再用1ml含500μg/ml的安普霉素和500μg/ml的萘啶酮酸的无菌水覆 盖平板，进一步于28℃培养一周，获得安普霉素抗性的单交换菌株sipi-3927-1。
[0054]
在斜面培养基上培养单交换菌株sipi-3927-1，接种于液体培养基 (30ml/250ml三角瓶)30℃培养48h，并连续传代10次，稀释培养物涂布在斜 面培养基上。挑取同一单菌落分别点种于含有安普霉素和不含安普霉素的平板上， 培养箱生长6-8天后观察抗性平板上菌落生长情况。若抗性平板上有菌落不生长的 点则选取无抗性平板上相同位置的菌落，同时在有抗性及无抗性的斜面培养基培 养接种，若菌体在抗性平板不生长而在无抗平板上生长，则取无抗性菌体抽提总 dna，并以引物attb-f/r进行pcr扩增验证attb基因插入，进而获得双交换菌株， 即新宿主菌sipi-3927-attb。
[0055]
实施例2
[0056]
卤化酶基因orf10的扩增、克隆和表达
[0057]
(1)荒漠拟孢囊菌(kibdelosporangium aridum)菌株sipi-3927的基因组提取及 卤化酶基因orf10的扩增：
[0058]
将sipi-3927接种于25ml yeme(上海源聚生物公司)培养基中，28℃、220rpm 振荡培养48h。将培养液用12000rpm离心5min，倒出上清，回收菌体。使用细菌 基因组dna快速提取试剂盒，按照供应商(生工生物工程有限公司)说明书提供的 提取方法进行基因组提取。
[0059]
引物的工作浓度均为50μm/l，dntp的工作浓度为2.5mm/l。pcr反应条件 如下：以引物orf10-r/f为引物，以sipi-39-27基因组为模板进行pcr扩增获得大 小为1500bp的左右卤化酶orf10基因，反应体系(50μl)包括：25μl 2
×
pcr buffer 缓冲液，2μl 2mm dntps，1μl fx酶，2.5μldmso，17.5μl h2o,上下游引物各1μl， 模板基因组0.3μl。pcr反应程序为95℃4min，13个循环(95℃30s，60℃30s， 72℃90s)，24个循环(95℃30s，71℃30s，72℃90s)，72℃10min，16℃5min。 特异性扩增出约1.5kb的dna片段，将pcr产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳(上海天 能科技有限公司)，电压120v，45min，切胶回收，使用sanprep柱式dna胶回收 试剂盒(生工生物工程有限公司)进行胶回收，最后溶到30μl纯水中，得到orf10目 的片段。
[0060]
(2)表达质粒pset152-orf10的构建：
[0061]
将pset152质粒以bamh1与xba1双酶切反应，胶回收目的片段pset152线 性载体，与orf10的片段使用多片段重组试剂盒(clonexpress multis one stepcloning kit，南京诺唯赞生物科技有限公司)连接得到表达质粒pset152-orf10。
[0062]
(3)基因工程菌的构建
[0063]
将新宿主菌sipi-3927-attb接种到新鲜的斜面上，28℃培养5-6天，待白色的 菌体长出，用接种铲铲取约1cm的菌体接种到25ml yeme液体培养基中，28℃， 200rpm，培养2天，按1％接种量转接到25ml yeme培养基中，28℃，200rpm， 培养1天。离心去上清得菌丝体，用lb液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2ml 的lb液体培养基中，此为新宿主菌液。
[0064]
将携带质粒pset152-orf10的中间宿主大肠杆菌et12567/puz8002接种到5ml 含氯霉素、卡那霉素和安普霉素的浓度分别为25μg/ml、50μg/ml和50μg/ml的lb 液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。按1％的接种量转接到25ml的相同培 养基中，37℃，200rpm培养约4小时后，使od值为0.4-0.6，用lb液体培养基 洗涤2次，最终悬浮于2ml的lb液体培养基中，此为带有卤化酶orf10基因质粒 的大肠杆菌液。
[0065]
将上述所制的宿主菌液与中间宿主大肠杆菌液按体积比1:1混合于离心管中， 充分混合后，涂布misp4琼脂培养基。28℃培养15h后，再用1ml含500μg/ml 的安普霉素和500μg/ml的萘啶酮酸的无菌水覆盖平板，进一步于28℃培养一周， 获得安普霉素抗性株。
[0066]
(4)基因工程菌的验证
[0067]
对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株进行抗性验证，将宿主菌和获得的安 普抗性的基因工程菌株分别接种到含有安普霉素(50μg/ml)的斜面上，28℃培养6 天，观察到仅宿主菌在含有安普霉素的斜面上不生长，而带转化子的基因工程菌 则能生长。
[0068]
(5)基因工程菌发酵
[0069]
平板培养基其组成如下：葡萄糖1％，可溶性淀粉2％，酵母提取物0.5％，酪 蛋白0.5％，碳酸钙0.1％，琼脂粉1.8％，ph6.8，28℃培养7天。
[0070]
种子培养基其组成如下：葡萄糖2％，玉米淀粉0.5％，玉米浆0.5％，酵母粉 0.5％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.5％，ph 6.8。将上述获得的基因工程菌接种于种子 培养基，刮取1cm
×
2cm的平板琼脂块接入100/750ml的种子培养基中，32℃培 养48h可得种子培养液。
[0071]
发酵罐(5l)培养基的组成如下：葡萄糖7％，玉米淀粉2％，水解酪蛋白0.5％， 黄豆饼粉1％，酵母粉0.81％，牛肉浸膏1％，磷酸二氢钾0.05％，七水合硫酸镁 0.18％，氯化钠0.21％，硫酸铵0.3％，消泡剂sag471 0.03％，碳酸钙0.3％，ph 6.9， 设定培养温度34℃，空气流量6l/min，罐压力0.03～0.05mpa，搅拌200-500rpm， 发酵5d，发酵罐内的溶氧量维持在20％以上。
[0072]
实施例3
[0073]
糖基转移酶a基因orf11的扩增、克隆和表达
[0074]
(1)糖基转移酶a基因orf11的扩增
[0075]
按照实施例2中的方法，选择orf11-r/f为引物，在相同的pcr扩增条件下， 获得相应的基因片段orf11。
[0076]
(2)表达质粒pset152-orf11的构建
[0077]
对pset152-orf10质粒进行nde1和bamh1双酶切从而获得目的载体片段，与 orf11的片段使用多片段重组试剂盒(clonexpress multis one step cloning kit，南京 诺唯赞生物科技有限公司)连接得到表达质粒pset152-orf11。
[0078]
(3)基因工程菌的构建，将步骤(2)中获得的外源卤化酶基因表达载体分别以实 施例2步骤(3)中同样的方法构建。
[0079]
(4)基因工程菌的验证：对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株分别进行抗性 验证，方法同实施例2步骤(4)。
[0080]
(5)基因工程菌发酵：将上述步骤(4)所得的基因工程菌，分别进行发酵，方法 同实施例2步骤(5)。
[0081]
实施例4
[0082]
卤化酶基因orf10和糖基转移酶a基因orf11的共同扩增、克隆和表达
[0083]
(1)卤化酶基因orf10和糖基转移酶a基因orf11的扩增
[0084]
按照实施例2中的方法，选择orf10-orf11-r/f为引物，在相同的pcr扩增条 件下，获得相应的基因片段orf10-orf11。
[0085]
(2)表达质粒pset152-orf10-orf11的构建
[0086]
对pset152-orf10质粒进行nde1和bamh1双酶切从而获得目的载体片段，与 orf10-orf11的片段使用多片段重组试剂盒(clonexpress multis one step cloningkit，南京诺唯赞生物科技有限公司)连接得到表达质粒pset152-orf10-orf11。
[0087]
(3)基因工程菌的构建，将步骤(2)中获得的外源卤化酶基因表达载体分别以实 施例2步骤(3)中同样的方法构建。
[0088]
(4)基因工程菌的验证：对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株分别进行抗性 验证，方法同实施例2步骤(4)。
[0089]
(5)基因工程菌发酵：将上述步骤(4)所得的基因工程菌，分别进行发酵，方法 同实施例2步骤(5)，最终将该基因工程菌株命名为sipi-3927-d20，即为 sipi-3927-orf10-orf11。
[0090]
实施例5
[0091]
a82846b产生菌发酵产物分析：含实施例1-4及对比实施例1中获得的3种重 组质粒的sipi-3927基因工程菌，及不含重组质粒的野生sipi-3927宿主菌，分别 经发酵以后，经hplc分析a82846各种类似物的含量。hplc分析方法简述如下： 对发酵液进行预处理：发酵培养10d的培养物2ml，加入0.05mol/l氢氧化钠溶 液4ml，混合混匀，250w超声处理10min，2504
×
g离心10min，上清液加入1 倍体积0.12mol/l盐酸，过0.22μm滤膜后用于hplc法测定。色谱条件：色谱柱 phenomenex c8柱(4.6mm
×
200mm，3um)；流动相0.1％三氟乙酸(a)∶乙腈(b)， 梯度洗脱(0
→
20min，b 5％～20％)；流速1.0ml/min；检测波长225nm；柱温 30℃；进样量20μl。根据标准品浓度计算发酵液中a82846b的含量。结果如下 表1所示：
[0092]
表1.基因工程菌发酵产物
[0093][0094]
从以上实施例可得出结论：整合自身来源的卤化酶基因orf10和糖基转移酶a 基因orf11对产物影响最显著，杂质的比例显著降低。sipi-3927-d20基因工程菌 的a82846b产量达到2760mg/l，较出发菌株提高了2.9倍，a82846b组分由最初 的33.6％提高至89.3％，副产物a82846a和a82846c的降低的效果非常显著。
[0095]
表1质粒构建的引物序列
[0096][0097]
表2序列清单
[0098]
[0099][0100]
seq id no.1(基因orf10)：
[0101]
atgtcggtcgaagacttcgatgtggttgttgctggtggcgggcctgccggttcgaccgtggccaccttggtggcgatgc aggggcatcgggtgctgttgctggagaaagaggtctttccccggtaccagatcggtgagtcgctgctgcctgccacggtgca cggggtgtgccggatgctcggcatcacggacgagctggccaatgccgggttcccggtgaagcggggcggcactttccgct ggggtgcgcgtccggagccgtggacgttccacttcggtatctccgccaagatggcgggctcgacgtcgcacgcctatcaggt cgagcgggcgcggttcgacgagatcttgctgaacaacgccaagcgcaagggcgtggtcgtgcgggaagggtccccggtca ccgatgtggtggaagacggtgagcgggtcaccggtctgcggtacaccgacgccgatggcaacgagcgtgaagtgtcagcg cgcttcgtgatcgacgcgtcgggcaacaagagccgcctctactccaaggtcggcggttcgcggaactactcggagttcttccg cagcctcgcgctgttcggctacttcgagggtggcaagcggctgcccgcgccggtctcgggaaacatcctgagcgttgccttc gacagcggctggttctggtacatcccgctgagcgacacgctgaccagcgtcggcgcggtggtgcgccgggaggacgccga gaagatccagggtgaccgggagaaggcgctcaacgccctgatcgccgagtgcccgctgatctcggagtacctcgcgaacg cgaccagggtgacgaccggcaagtacggggagttacgcgtccgcaaggactactcctaccagcaggagacctactggcgg ccggggatgatcctgatcggcgacgccgcgtgcttcgtggacccggtgttctcgtccggtgtgcacctggcgacctacagcg cgctgctcgcggcccggtcaatcaacagcgtcctggcgggcgatctggacgagaagaccgcactgaacgagttcgaaatgc ggtatcgccgcgagtacggggtgttctacgagttcctcgtgtcgttctatcagatgaacgtgaatgaggagtcgtatttctggca ggccaagaaggtcacgcagaaccagagcaccgatatcgagtcgttcgtcgaactgatcggtggggtgtcgtccggtgagac cgcgctgacggccgctgaccggatcgccgcgcgcagtgccgaattcgccgcggccgtggaccagatggccagcggcgac ggcgacaacatggtgccgatgttcaagtcgacggtggtcaagcaggcgatgcaggaagcgggccaggtccagatgaaggc gctgctcggcgaggacgccgaacccgagctgccgctgttccccggcggcctggtgacctcgcccgacggaatgaaatggc tgccgcaccatccggcatga
[0102]
seq id no.2(基因orf11)：
[0103]
atgcgcgtgttgattacggggtgtggatcgcgcggagataccgaaccgttggtggcattggcggcacggttgcggga actcggtgcggacgcgcggatgtgcctgccgccggactacgtggagcggtgcgccgaggtcggtgtgccgatggtgccgg tcggtcgggcggtgcgcgcaggggcacgcgagccgggagaactgccgccgggggcggccgaagtcgtgaccgaggtg gtcgccgaatggttcgacaaggtcccggcggccatcgaggggtgtgacgcggtggtgacgaccggcttgctgcccgccgc ggtcgctgtccggtcgatggccgagaagctgggcatcccgtaccgctacaccgtgctgtctccggaccatctgccgtcggag caaagccaggcggagcgggacatgtacaaccagggcgccgacaggcttttcggtgacgcggtcaacagccaccgggcct cgatcggcctgccaccggtggagcacctctacgactacggctacaccgatcagccctggctggcggcggacccggtgctgt ccccgctgcggccgacggacctcggcactgtgcagaccggtgcgtggatcctgcccgacgaacggccgctttccgcggag ctggaggcgtttctggctgccgggtcgacgccggtgtacgtgggtttcggcagctcgtcccgaccggcaaccgctgacgcc gcgaagatggccatcaaggcggtccgtgccagtggccgccggatcgttctctcccgcggctgggccgatttggtcctgccgg acgacggggccgactgcttcgtggtcggcgaagtgaaccttcaggagctgttcggccgggtggccgccgccatccaccacg acagcgcgggcac
gacgctgctggccatgcgggcgggcatcccccagatcgtggtgcgccgcgtagtggacaacgtggtg gagcaggcgtaccacgccgaccgggtggccgagctgggtgtcggtgtggcggtcgacggtccggtcccgaccatcgactc cttgtcggccgcgctcgacacggctctggccccggagatccgtgcgcgagcgacgaccgtggcagacacgattcgcgccg atgggacaacggtggccgcgcagctgctgttcgacgcggtcagcctggaaaagccgactgttcccgcctga
[0104]
seq id no.3(基因attb)：
[0105]
ccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccac
[0106]
seq id no.4(质粒pkc1139-attb)：
[0107]
tgtgaggaggctggtcctttaccctgatgcccgagggcatcagggtaaaggaccagcctcgccaactaggagcgcta ccaaggcgaacacaacccaggacttggtagaacccttcgccggagaagttcagactcatcggcatgagcacccctcgccgc gcactcggcaccggtccgtcgaccaccaccaggacgtcgttgtcgacgtcggccccgcggctcctgcccgccgaacgcgtc gtcgtcgacggcctggtgctcatcgacgagcacccggagccaggtgaaaagcgccggcggacgctcggactgggcgcgg gattccagcagtaacccaggtccgccggccacctcacggcaggcagaccctcggctttcgcgccgggaccgccatgagact gccacccggatgtccggggtggcggtctcatggcggtccctcagcggccctacgcgaccgctgtgtcgacgcggaggcag tctccggggagccggccccagggctggagtaccggggcgagcttgctcatggcggtccctcagcggccctacgcgaccgc tgtgtcgacgcggaggcagtctccggggtgctggccccagggctggagtaccggggcgagcttgcccttgcagcggcggc acacgggcgacgcggcgccgggcgggggagtcttgacgtcgacggtgaccggcttcggcttcaggcgcttccgaaggctg atcgtcgggcggatcgcctccttcttcggctgacgcactcggtcgagcgaagcggccagctcctccgtgcgggcctcgttgg ccttccggcgcgcctcgcggaaagcagcttcctcctcggacatgacctcgaacctcatctggtcagcgtcaaggtcgcccgg cgcggccggcgcttccggggcgggcgggtccaggacgtccttgccccacaccaggcctcaggactcgacgagccgccgg acgcccggtaggccgtacgtctcggcgaccttgatgaggtcgaggcgacgtccggcgacgcgggcgatgtatcggtacca gatgtaggccgggatgaccgcgatggcgaccaggccctcggtgtcgtcggtgatctcctcctcggtgcggacgtcctgctgg atgccgagttccttgatcagccggttcaggttctgcgaccggtagtgcttgcggacctggaagacgccgaactcgcgctcgcg gtacttctcgacgaacgggccgggccgacgaagccgctgcagctcggcggccgccgcgtcgcccaggtcgagcggtccc atgcggtcgtcgccgcgaccggccttgaagttctgtccggccagctccaggccgatcttggcgacgccgcccttggtcttgtc gccgtccttgtagaggtagcgggcctgcttgcccgcatcgccgtcagcggcgtccgcgccgttgagtgggcgcacgtcggt gccgtggcccttgccctcacaggagcaaccgggccggtcgcacgtctcgctgacggtgtagccgcccgcggattcgacccc ggcggcccaggctccggcgagtgcgtcgcggaacgcggcctgggcgtccgggccgagcacctcgcgggtgacccagag cgtgtgccagtgcaggtgccagccggagccccagccgaaggtgtcctcgaaggcccgctcgtagccgatgatcccgaagtc gtcgcgcatcgtgcgccagcggcggccggacgagccgtacgcgcccttccagccgtcgtgcaagaccgcgaccaggccg tgccgcattcccttgcggacggtgccgaacgccatgcgctcgaagtggcgcaacgtgttcgtgccaaggtgcagcccgtacc cggcgtccgcgagaccgtcggcggcgagctgcacgttcgagccccgtacggccaggatgcggctcatgcaccacgggca ggtgtggacgttgttgcagcggcacgtgttgccccacgtcgcctcgcccggcttccacatcagctcggccgtcccggcagtg agccgggtcccgcagcccttgaacgcctcgttcagcgacaccgtctggtgccggtcccgccgggcgaaccgctcgtcgcgc gggtcctcccgcccggctgtcgcggcaccctcgtttggggtagaacccgttccagttacagcgctctgacctgcagtggacg gagattttcccttactactaaagcccgcgtccggattacccgctgtagtcgtgcttgctacgctgcgtgactggtccgcaatgag acgctttgcgcgctttcggcaggcgtccgagcagtagattttggggcgcttcccggggatgtggacgatcggggtgccgcag tggcacttcggtccggcggggcgcggtggtgtcgacgcgctgttctctcgtac
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[0108]
seq id no.5(质粒pset152-orf10-orf11)：
[0109]
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