鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于抗体的制备及序列测定领域，尤其是涉及一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。

背景技术：

烟曲霉（aspergillufumigatus，a.fumigatus）在自然界中广泛分布，其分生孢子漂浮在空气中，通过呼吸道进入人体，主要引起肺部感染，其次是颅内感染、外耳病、鼻窦炎，偶有通过皮肤、腹膜、肾、骨、眼睛及消化道感染的报道。随着糖皮质激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂使用以及器官移植患者的增多，免疫抑制患者中侵袭性曲霉病（invasiveaspergillosis,ia）的发病率呈迅速上升趋势。烟曲霉是引起免疫抑制患者肺部侵袭性曲霉感染的最常见病原菌，此外还有黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等。由于缺乏典型的临床表现及有效的早期诊断方法，ia的死亡率高达50%-100%。早期快速检测是ia的有效治疗及降低死亡的关键因素。

半乳甘露聚糖(galactomannan，gm)是存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守性的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子的标志物。当曲霉菌吸入进入人体肺组织中吞噬细胞便快速将其吞噬，消化处理后释放出真菌细胞壁结构成分。通过血清、支气管肺泡灌洗液、尿液、脑脊液均可监测到半乳甘露聚糖，因此，对gm测定是曲霉菌感染的敏感指标。gm试验特异性检测血清中或组织液中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，是早期发现侵袭性曲霉菌感染的有效检测手段，由于gm量的多少与组织中真菌含量密切相关，因此，检测gm抗原不仅可以帮助临床早期发现ia并早期进行干预，还可以对治疗效果进行监测和评估，同时对患者的临床结局起到提示作用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及其应用。

本发明采用的技术方案是：鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，保藏编号是cgmccno.20282命名为bb10。

优选地，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；

重链可变区序列的cdr区中包含如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的三个序列；

seqidno:1（cdrh1）

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轻链可变区序列的cdr区中包含如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的三个序列；

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seqidno:5（cdrl2）

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优选地，由保藏编号是cgmccno.20282的鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株产生。

优选地，重链可变区序列如seqidno:7所示，轻链可变区序列如seqidno:8所示。

seqidno:7

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seqidno:8

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一种核苷酸分子，核苷酸分子包含编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的核苷酸序列。

优选地，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:9所示，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:10所示。

seqidno:9

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一种检测曲霉菌半乳甘露聚糖的试剂盒，含有鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体。

本发明具有的优点和积极效果是：本发明提供了一种鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，由其制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达10⁶，不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖产生交叉反应，基于这些特性该单克隆抗体可用于曲霉菌半乳甘露聚糖的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。

附图说明

图1抗体bb10的纯化后蛋白电泳图；1marker；2bb10；

图2抗体bb10的腹水效价测定结果；

图3抗体bb10的交叉反应测定结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例做出说明。

本发明涉及鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，生物材料命名为bb10，属杂交瘤细胞，其保藏编号是cgmccno.20282，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2020年8月27日，检测为存活。

本发明涉及鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及rt-pcr法克隆ig可变区基因，获得稳定分泌抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用elisa方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗曲霉菌半乳甘露聚糖基因工程抗体的研发奠定了基础。

鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株产生鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；

重链可变区序列的cdr区中包含如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的三个序列；

seqidno:1（cdrh1）

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轻链可变区序列的cdr区中包含如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的三个序列；

seqidno:4（cdrl1）

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seqidno:5（cdrl2）

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具体的，重链可变区序列如seqidno:7所示，轻链可变区序列如seqidno:8所示。

seqidno:7

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seqidno:8

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核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:9所示，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:10所示。

seqidno:9

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由这种鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达10⁶，不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖产生交叉反应，基于这些特性这此单克隆抗体可用于曲霉菌半乳甘露聚糖的检测。

下面结合附图对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株的筛选

采用液体沙氏培养基培养曲霉菌，待菌丝体长至黄豆粒大小时离心收集菌丝体和培养液上清，上清经旋蒸浓缩后加三倍体积无水乙醇进行过夜醇沉，沉淀经水溶解即为粗制曲霉菌半乳甘露聚糖，用于动物免疫。采用肼解-亚硝酸法进行进一步纯化粗糖获得精制曲霉菌半乳甘露聚糖，用于特异性单克隆抗体的筛选。

首次免疫剂量为50ug粗糖/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，皮下多点注射，与二次免疫间隔时间为2周；二次免疫免疫剂量为50ug糖/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，腹腔注射，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：8000以上进行细胞融合。

融合前3天腹腔免疫50ug糖，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤sp2/0细胞进行细胞融合（以10：1比例），融合时在37℃水浴的环境下，将50%的peg在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有hat的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x10⁷细胞/板)。在37℃、5％co2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。

融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测od值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/ml；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37°c、5%co2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为bb10，为鼠源igg1亚型，轻链为κ链。

实施例2：鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备

2.1腹水制备及纯化

无菌pbs溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x10⁶/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的抗体进行粗纯，粗纯后的抗体按照ge公司提供的纯化手册，利用akta蛋白纯化系统，经1mlproteing纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。纯化后结果见附图1。

2.2单克隆抗体效价检测

以间接elisa方法进行腹水效价测定。包被曲霉菌半乳甘露聚糖10ug/ml，100ul/孔。1%bsa作为封闭液。将腹水从1：1000开始进行倍比稀释，共稀释12个梯度，promega酶标抗体作为二抗1：6000稀释后使用，od为450nm读值，同时设定不包被组进行对照，抗体稀释1024000倍时的od值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达1：1024000。结果见附图2，制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达10⁶。

2.3与其他多糖的交叉反应性

用间接elisa方法检测单克隆抗体与其他糖的交叉反应性。将隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖和曲霉菌半乳甘露聚糖按照10ug/ml浓度进行包被，纯化后的抗体作为一抗，promega抗鼠酶标抗体作为二抗。结果见图3，可见抗体bb10与其他糖无交叉反应，表明该抗体具有很强的特异性。

实施例3：鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的基因验证

rt-pcr法克隆ig可变区基因

总rna提取，单链cdna合成：

用trizol法（试剂盒购自invitrogen）提取bb10杂交瘤细胞株的总rna，用m-mlv逆转录酶（购自invitrogen）将总rna逆转为cdna文库。

重链骨架区上游引物

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重链可变区下游引物

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轻链前导肽上游引物

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轻链可变区下游引物

p4：5’ggatacagttggtgcagcatcagcccgttt3’（seqidno:14）

配制pcr反应体系（50μl）如下：

cdna:2μl；上游引物(10μm):2μl；下游引物(10μm):2μl；dntpmixture:2μl；pfudna聚合酶(5u/μl):1μl；10xpfubufferⅱ:5μl；ddh2o:补足至50μl。

反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳分离并回收vl、vh片段。将回收后的vl、vh片段分别与pmd19-t(simple)载体(takara公司)进行连接，连接体系如下：

vlpcr产物/vhpcr产物各70ng，pmd19-t(simple)载体1μl，solutioni连接反应液5μl；ddh2o补足至10μl，4℃连接过夜。

连接产物转化入e.colidh5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液pcr鉴定，以对应抗体的cdna为阳性对照。配制反应体系（25μl）如下：

菌液：1μl，上游引物(10μm)：1μl；下游引物(10μm)：1μl；dntpmixture(各2.5mm)2μl；taqdna聚合酶(5u/μl)：0.5μl；10×taqbuffer(mg2+plus)：2.5μl；补水至25μl。反应条件同前。

选取菌pcr阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体bb10的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。

实施例4：曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒（化学发光法）的制备及应用

基于该抗体，通过磁微粒化学发光技术，配套“全自动化学发光酶免分析仪”，开发出曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒（化学发光法），并进行了临床样本检测，试剂盒制备过程及临床样本检测结果如下。

4.1磁珠包被物制备

使用0.1mg/ml的edac溶液活化羧基化的磁珠，加入抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体bb10，标量为2mg/ml，标记1h，封闭1h，洗涤3次，沉淀使用偶联缓冲液容至磁珠加入体积的4倍。使用pbs将磁珠包被抗体稀释10倍，再加入tris粉末使其终浓度为0.1m，混匀，分装，冻干。

4.2酶标结合物制备

采用高碘酸钠氧化进行辣根过氧化物酶（hrp）与抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体bb10的偶联标记，首先，称取10mghrp，溶于去离子水，加入10mm的高碘酸钠溶液，4℃避光反应30min，加入乙二醇终止后，加入10mg该抗体，装入50kd透析袋中，在ph=9.6的碳酸钾溶液中反应6h，取出后加入硼氢化钠，反应2h后缓慢加入饱和硫酸铵进行沉淀，沉淀静置1h后进行高速离心，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，pbs过夜进行透析，次日取出后高速离心弃去上清，加入等体积甘油保存于-20℃。用时使用hrp抗体稀释液稀释hrp标记的抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体5000倍，分装。

4.3组装试剂条

将磁珠包被物、酶标结合物、样本稀释液、洗液、发光底物溶液（a液和b液）、吸头、检测仓按规定进行组装，制备成试剂条。

4.4临床样本检测

将曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒（化学发光法），其与法国bio-rad公司曲霉菌抗原检测试剂盒进行对比试验，测定100例临床样本，并进行一致性分析，结果显示，我司试剂灵敏度为94.0%、特异性为96.0%、总符合率为95.0%，kappa值为0.90，大于0.75，为高度一致，认为两系统等效。本采用化学发光法进行曲霉菌半乳甘露聚糖的定量检测，配套全自动化学发光酶免分析仪，突破性地实现了样本处理、检测、结果分析的自动化操作，同时，大大缩短了检测耗时，有效解决了常规gm试验操作繁琐、时间长的问题，实现了gm检测的自动化、标准化。认为以该抗体为原料开发的试剂盒具有较好的临床应用价值。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110>天津喜诺生物医药有限公司

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序列表

<110>天津喜诺生物医药有限公司

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151015

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202530

<210>3

<211>52

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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151015

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202530

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354045

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<213>人工序列(artificialsequence)

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