一种高转化率的D泛解酸内酯制备方法与流程

本发明涉及化学技术领域，具体涉及一种高转化率的d泛解酸内酯制备方法。

背景技术：

d泛解酸内酯为制备泛化合物的重要中间体。微生物酶法拆分dl泛解酸内酯生成d泛解酸内酯的制备包括如下步骤：1)微生物酶选择性水解dl泛解酸内酯中的d泛解酸内酯或者l泛解酸内酯，得到l泛解酸内酯和d泛解酸；2)利用有机试剂萃取混合液，实现l泛解酸内酯和d泛解酸的分离；3)d泛解酸经过内酯化处理，得到d泛解酸内酯，l泛解酸内酯经过化学消旋重新变成dl泛解酸内酯，再拆分。但存在下述缺陷：一是拆分步骤多，分离效率低；二是化学消旋过程会产生大量色素和其它杂质，拆分制得的d泛解酸内酯颜色较深，外观品质较差；三是化学消旋会产生大量硫酸盐，形成固体废弃物，造成环境污染。

cn110423717a公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成d-泛解酸内酯的方法，该方法使用l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶组成的复合酶转化生产d泛解酸内酯。但葡萄糖脱氢酶在反应过程中易生成副产物，使得d泛解酸内酯的分离困难，影响转化率。需要研究高转化率的d泛解酸内酯制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种d泛解酸内酯的制备方法，包括如下步骤：向底物溶液中加入酶制剂后，经转化反应制得d泛解酸内酯，其中，所述底物溶液为dl泛解酸内酯和甲酸铵的水溶液，所述酶制剂为由l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和甲酸脱氢酶组成的复合酶。

本发明的优选方案中，所述dl泛解酸内酯与甲酸铵的初始质量浓度比为1:1-10:1，优选为1:1-4:1。

本发明的优选方案中，底物溶液中dl泛解酸内酯的浓度为10-300g/l，优选为100-250g/l，更优选为150-200g/l。

本发明的优选方案中，底物溶液中甲酸铵的浓度为1-100g/l，优选为20-80g/l，更优选为30-50g/l。

本发明的优选方案中，所述底物溶液ph5-7，优选ph5.5-6.5。

本发明的优选方案中，ph调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠中的任一种。

本发明的优选方案中，先将底物溶液升温到20-37℃，再加入酶制剂。

本发明的优选方案中，所述酶制剂的酶活单位为2-15u，优选为5-12u，更优选为8-10u。

本发明的优选方案中，还包括向底物溶液中添加磷酸盐。

本发明的优选方案中，底物溶液中磷酸盐的浓度为1-50mmol/l，优选为5-40mmol/l。

本发明的优选方案中，所述磷酸盐选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。

本发明的优选方案中，所述转化反应温度为25-40℃，优选为30-37℃。

本发明的优选方案中，所述转化反应时间为6-36小时，优选为12-24小时。

本发明的优选方案中，所述l泛解酸内酯脱氢酶来源于红串红球菌rhodococcuserythropolis。

本发明的优选方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶来源于木兰假丝酵母candidamagnolia。

本发明的优选方案中，所述甲酸脱氢酶来源于伯克霍尔德菌burkholderiastabilis。

本发明的另一个目的在于提供一种如上所述方法生产出来的d泛解酸内酯。

本发明的优选方案中，d泛解酸内酯的ee值大于99％。

本发明的另一目的在于提供一种如上所述的d泛解酸内酯在制备泛化合物中的应用。

本发明的优选方案中，所述泛化合物选自d-泛酸钙、d-泛醇、泛硫乙胺中的任一种。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

除非另有说明，本发明按照下述方法检测酶活和转化率。

1、酶活为酶活力的度量单位，单位为u。

本发明中的1个酶活单位表示1ml底物溶液在1分钟内转化生成1umold泛解酸内酯的酶量。

仪器及工作条件：岛津lc-16液相色谱仪，色谱柱ie(5μm，250mm)，d泛解酸内酯标准品，柱温30℃，采集时间30min，波长210nm，流速1.0ml/min，流动相为0.05mol/l磷酸二氢钠水溶液:甲醇＝60∶40。

实验步骤：

1)将d泛解酸内酯标准品用水稀释至浓度为c，过滤后进样，进样量10ul，记录峰面积s。

2)分别在转化时间t＝0和t＝n(n为大于0的任一数值，单位为分钟)时，取转化液稀释100倍，过滤后进样，进样量10ul，分别记录峰面积s0和sn。

酶活＝(c*(sn-s0)*1000)/(130.14*n*s)。

2、转化率

仪器及工作条件：岛津lc-16液相色谱仪，色谱柱ie(5μm，250mm)，柱温30℃，采集时间30min，波长210nm，流速1.0ml/min，流动相为0.05mol/l磷酸二氢钠水溶液∶甲醇＝60∶40。

实验步骤：分别在转化时间t＝0和t＝m(m为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后进样，进样量10ul，分别记录峰面积s0和sm。

转化率(m时刻)＝(s0-sm)/s0。

3、ee值计算公式

ee值＝d泛解酸内酯纯度-l泛解酸内酯纯度

与现有技术相比，本发明的有益技术效果为：

1.本发明通过反应原料的选择和工艺条件的优化，使得dl泛解酸内酯通过一步反应转化生成d泛解酸内酯。与传统酶法拆分法相比，具有工艺简便、副产物易分离、提取简单、环境友好、转化效率和转化程度高、适用于工业化生产等优点。

2.本发明所得d泛解酸内酯纯度高，无须结晶等后处理工艺即可应用于泛酸等产品的深加工。

附图说明

图1实施例1终产物的色谱检测图谱；

图2实施例2终产物的色谱检测图谱；

图3实施例3终产物的色谱检测图谱；

图4实施例4终产物的色谱检测图谱；

图5实施例5终产物的色谱检测图谱；

图6实施例1-6的反应转化率对比。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂、l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，均可从商业途径购买得到。

实施例1d泛解酸内酯的制备

称取1600gdl泛解酸内酯、400g甲酸铵、11.5g磷酸二氢铵，加水至混合溶液体积为10l，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液ph为6.0，升温至30℃，加入l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，使得混合溶液中总酶活为8u，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应20h，得反应液。对反应液进行色谱检测，结果见图1。反应过程中每隔2小时取样检测并计算转化率，结果见图6。反应产物ee值为99.1％。

实施例2d泛解酸内酯的制备

称取1600gdl泛解酸内酯、400g甲酸铵、23g磷酸二氢钠，加水至混合溶液体积为10l，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液ph为6.0，升温至30℃，加入l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，使得混合溶液中酶活为8u，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应20h，得反应液。对反应液进行色谱检测，结果见图2。反应过程中每隔2小时取样检测并计算转化率，结果见图6。反应产物ee值为99.3％。

实施例3d泛解酸内酯的制备

称取1600gdl泛解酸内酯、400g甲酸铵、46g磷酸二氢铵，加水至混合溶液体积为10l，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液ph为6.0，升温至30℃，加入l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，使得混合溶液中酶活为8u，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应20h，得反应液。对反应液进行色谱检测，结果见图3。反应过程中每隔2小时取样检测并计算转化率，结果见图6。反应产物ee值为99.2％。

实施例4d泛解酸内酯的制备

称取1600gdl泛解酸内酯、400g甲酸铵、27.2g磷酸二氢钾，加水至混合溶液体积为10l，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液ph为6.0，升温至30℃，加入l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，使得混合溶液中酶活为8u，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应20h，得反应液。对反应液进行色谱检测，结果见图4。反应过程中每隔2小时取样检测并计算转化率，结果见图6。反应产物ee值为99.3％。

实施例5d泛解酸内酯的制备

称取1600gdl泛解酸内酯、400g甲酸铵，加水至混合溶液体积为10l，搅拌溶解，用20-25％氨水调节溶液ph为6.0，升温至30℃，加入l泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶，使得混合溶液中酶活为8u，将混合溶液置于37℃恒温条件下搅拌反应20h，得反应液。对反应液进行色谱检测，结果见图5。反应过程中每隔2小时取样检测并计算转化率，结果见图6。反应产物ee值为97.1％。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。