一种鉴别西葫芦品种真伪性的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别西葫芦品种真伪性的方法，该方法可应用于生物技术推广服务，为西葫芦种质资源和品种保护提供技术支持。

背景技术：

西葫芦，又名美洲南瓜，是葫芦科南瓜属重要的栽培蔬菜，其营养丰富，且含有一种抗干扰素的诱生剂，能够提高人体免疫力。西葫芦具有生长期短、产量高、耐贮运、适宜间作套种等优点，其已成为栽培面积仅次于黄瓜的瓜类蔬菜。我国西葫芦的种植面积超多500万亩，仅山东寿光每天的西葫芦产量7.5-10万公斤，具有广阔的应用前景和巨大的经济潜力。部分地区将西葫芦纳入非主要农作物登记目录，但是由于各省市之间品种审定相互不协调，市场中的西葫芦品种管理未能有效跟进。西葫芦品种知识产权保护不够完善，导致西葫芦存在假冒种子、套用亲本和f1的现象，这不仅严重打击育种工作者的积极性，也对广大西葫芦种植户带来了巨大的经济损失。例如，2016年4月新疆农林牧司法鉴定中心对“精品瑞丰9号”打籽葫芦种子进行的司法鉴定表明，农户购买的该西葫芦种子批存在严重混杂退化，给农民造成重大损失。如何高效进行西葫芦品种监管，保护育种家和菜农的经济权益已成为当前西葫芦产业发展面临的主要难题之一。根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种dus测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交dna检测结果。因此，建立一套基于dna指纹有效进行西葫芦品种真实性鉴定的标准显得尤为重要。

基于分子标记技术进行品种鉴定，具有不受环境因素影响、精确度高等优点。目前，我国尚没有西葫芦品种鉴定的dna分子检测方法。近年来，snp作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着第二代高通量测序技术的发展和测序成本的降低，利用西葫芦变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的snp位点。采用等位基因竞争性特异pcr法，并设计其特异引物，最终获得西葫芦品种在snp位点的基因型。snp分型检测技术具有高通量、低成本、snp分型无需对照品种等优势，结果以准确的碱基呈现，能直接反应西葫芦品种的分子遗传差异，是西葫芦品种真实性鉴定的理想标记。

技术实现要素：

本发明的目的是鉴定西葫芦品种，尤其是265个西葫芦品种。

本发明首先保护snp位点组合，可包括西葫芦基因组的48个snp位点；所述48个snp位点如下：cuposnp01位点为chr01染色体上的第2807880位核苷酸；cuposnp02位点为chr01染色体上的第9791465位核苷酸；cuposnp03位点为chr01染色体上的第19069993位核苷酸；cuposnp04位点为chr02染色体上的第1687667位核苷酸；cuposnp05位点为chr03染色体上的第794938位核苷酸；cuposnp06位点为chr03染色体上的第799507位核苷酸；cuposnp07位点为chr04染色体上的第4509600位核苷酸；cuposnp08位点为chr04染色体上的第7015999位核苷酸；cuposnp09位点为chr04染色体上的第11177727位核苷酸；cuposnp10位点为chr05染色体上的第4771908位核苷酸；cuposnp11位点为chr05染色体上的第9266170位核苷酸；cuposnp12位点为chr06染色体上的第3551450位核苷酸；cuposnp13位点为chr07染色体上的第1076750位核苷酸；cuposnp14位点为chr07染色体上的第7776963位核苷酸；cuposnp15位点为chr07染色体上的第8150946位核苷酸；cuposnp16位点为chr08染色体上的第419732位核苷酸；cuposnp17位点为chr08染色体上的第7173914位核苷酸；cuposnp18位点为chr08染色体上的第8024934位核苷酸；cuposnp19位点为chr09染色体上的第1524784位核苷酸；cuposnp20位点为chr09染色体上的第1823037位核苷酸；cuposnp21位点为chr09染色体上的第2169965位核苷酸；cuposnp22位点为chr10染色体上的第2352404位核苷酸；cuposnp23位点为chr10染色体上的第4943533位核苷酸；cuposnp24位点为chr11染色体上的第7237965位核苷酸；cuposnp25位点为chr11染色体上的第9818902位核苷酸；cuposnp26位点为chr12染色体上的第4936646位核苷酸；cuposnp27位点为chr12染色体上的第6034493位核苷酸；cuposnp28位点为chr12染色体上的第8635520位核苷酸；cuposnp29位点为chr13染色体上的第6704302位核苷酸；cuposnp30位点为chr13染色体上的第6770190位核苷酸；cuposnp31位点为chr13染色体上的第7984331位核苷酸；cuposnp32位点为chr13染色体上的第8283301位核苷酸；cuposnp33位点为chr14染色体上的第5675208位核苷酸；cuposnp34位点为chr14染色体上的第8439875位核苷酸；cuposnp35位点为chr15染色体上的第107674位核苷酸；cuposnp36位点为chr15染色体上的第997997位核苷酸；cuposnp37位点为chr15染色体上的第8052733位核苷酸；cuposnp38位点为chr16染色体上的第441092位核苷酸；cuposnp39位点为chr16染色体上的第4936150位核苷酸；cuposnp40位点为chr16染色体上的第8226807位核苷酸；cuposnp41位点为chr17染色体上的第365539位核苷酸；cuposnp42位点为chr17染色体上的第3071924位核苷酸；cuposnp43位点为chr18染色体上的第5566093位核苷酸；cuposnp44位点为chr19染色体上的第105081位核苷酸；cuposnp45位点为chr19染色体上的第1475103位核苷酸；cuposnp46位点为chr19染色体上的第6337473位核苷酸；cuposnp47位点为chr20染色体上的第1391021位核苷酸；cuposnp48位点为chr20染色体上的第7417753位核苷酸。

所述snp位点组合具体可由上述48个snp位点组成。

本发明还保护引物组合，可包括用于扩增所述cuposnp01位点的引物组1、用于扩增所述cuposnp02位点的引物组2、用于扩增所述cuposnp03位点的引物组3、用于扩增所述cuposnp04位点的引物组4、用于扩增所述cuposnp05位点的引物组5、用于扩增所述cuposnp06位点的引物组6、用于扩增所述cuposnp07位点的引物组7、用于扩增所述cuposnp08位点的引物组8、用于扩增所述cuposnp09位点的引物组9、用于扩增所述cuposnp10位点的引物组10、用于扩增所述cuposnp11位点的引物组11、用于扩增所述cuposnp12位点的引物组12、用于扩增所述cuposnp13位点的引物组13、用于扩增所述cuposnp14位点的引物组14、用于扩增所述cuposnp15位点的引物组15、用于扩增所述cuposnp16位点的引物组16、用于扩增所述cuposnp17位点的引物组17、用于扩增所述cuposnp18位点的引物组18、用于扩增所述cuposnp19位点的引物组19、用于扩增所述cuposnp20位点的引物组20、用于扩增所述cuposnp21位点的引物组21、用于扩增所述cuposnp22位点的引物组22、用于扩增所述cuposnp23位点的引物组23、用于扩增所述cuposnp24位点的引物组24、用于扩增所述cuposnp25位点的引物组25、用于扩增所述cuposnp26位点的引物组26、用于扩增所述cuposnp27位点的引物组27、用于扩增所述cuposnp28位点的引物组28、用于扩增所述cuposnp29位点的引物组29、用于扩增所述cuposnp30位点的引物组30、用于扩增所述cuposnp31位点的引物组31、用于扩增所述cuposnp32位点的引物组32、用于扩增所述cuposnp33位点的引物组33、用于扩增所述cuposnp34位点的引物组34、用于扩增所述cuposnp35位点的引物组35、用于扩增所述cuposnp36位点的引物组36、用于扩增所述cuposnp37位点的引物组37、用于扩增所述cuposnp38位点的引物组38、用于扩增所述cuposnp39位点的引物组39、用于扩增所述cuposnp40位点的引物组40、用于扩增所述cuposnp41位点的引物组41、用于扩增所述cuposnp42位点的引物组42、用于扩增所述cuposnp43位点的引物组43、用于扩增所述cuposnp44位点的引物组44、用于扩增所述cuposnp45位点的引物组45、用于扩增所述cuposnp46位点的引物组46、用于扩增所述cuposnp47位点的引物组47和用于扩增所述cuposnp48位点的引物组48。

所述引物组合中，所述引物组1可由seqidno:1所示的正向引物01f1、seqidno:2所示的正向引物01f2和seqidno:3所示的反向引物01r组成。所述引物组2可由seqidno:4所示的正向引物02f1、seqidno:5所示的正向引物02f2和seqidno:6所示的反向引物02r组成。所述引物组3可由seqidno:7所示的正向引物03f1、seqidno:8所示的正向引物03f2和seqidno:9所示的反向引物03r组成。所述引物组4可由seqidno:10所示的正向引物04f1、seqidno:11所示的正向引物04f2和seqidno:12所示的反向引物04r组成。所述引物组5可由seqidno:13所示的正向引物05f1、seqidno:14所示的正向引物05f2和seqidno:15所示的反向引物05r组成。所述引物组6可由seqidno:16所示的正向引物06f1、seqidno:17所示的正向引物06f2和seqidno:18所示的反向引物06r组成。所述引物组7可由seqidno:19所示的正向引物07f1、seqidno:20所示的正向引物07f2和seqidno:21所示的反向引物07r组成。所述引物组8可由seqidno:22所示的正向引物08f1、seqidno:23所示的正向引物08f2和seqidno:24所示的反向引物08r组成。所述引物组9可由seqidno:25所示的正向引物09f1、seqidno:26所示的正向引物09f2和seqidno:27所示的反向引物09r组成。所述引物组10可由seqidno:28所示的正向引物10f1、seqidno:29所示的正向引物10f2和seqidno:30所示的反向引物10r组成。所述引物组11可由seqidno:31所示的正向引物11f1、seqidno:32所示的正向引物11f2和seqidno:33所示的反向引物11r组成。所述引物组12可由seqidno:34所示的正向引物12f1、seqidno:35所示的正向引物12f2和seqidno:36所示的反向引物12r组成。所述引物组13可由seqidno:37所示的正向引物13f1、seqidno:38所示的正向引物13f2和seqidno:39所示的反向引物13r组成。所述引物组14可由seqidno:40所示的正向引物14f1、seqidno:41所示的正向引物14f2和seqidno:42所示的反向引物14r组成。所述引物组15可由seqidno:43所示的正向引物15f1、seqidno:44所示的正向引物15f2和seqidno:45所示的反向引物15r组成。所述引物组16可由seqidno:46所示的正向引物16f1、seqidno:47所示的正向引物16f2和seqidno:48所示的反向引物16r组成。所述引物组17可由seqidno:49所示的正向引物17f1、seqidno:50所示的正向引物17f2和seqidno:51所示的反向引物17r组成。所述引物组18可由seqidno:52所示的正向引物18f1、seqidno:53所示的正向引物18f2和seqidno:54所示的反向引物18r组成。所述引物组19可由seqidno:55所示的正向引物19f1、seqidno:56所示的正向引物19f2和seqidno:57所示的反向引物19r组成。所述引物组20可由seqidno:58所示的正向引物20f1、seqidno:59所示的正向引物20f2和seqidno:60所示的反向引物20r组成。所述引物组21可由seqidno:61所示的正向引物21f1、seqidno:62所示的正向引物21f2和seqidno:63所示的反向引物21r组成。所述引物组22可由seqidno:64所示的正向引物22f1、seqidno:65所示的正向引物22f2和seqidno:66所示的反向引物22r组成。所述引物组23可由seqidno:67所示的正向引物23f1、seqidno:68所示的正向引物23f2和seqidno:69所示的反向引物23r组成。所述引物组24可由seqidno:70所示的正向引物24f1、seqidno:71所示的正向引物24f2和seqidno:72所示的反向引物24r组成。所述引物组25可由seqidno:73所示的正向引物25f1、seqidno:74所示的正向引物25f2和seqidno:75所示的反向引物25r组成。所述引物组26可由seqidno:76所示的正向引物26f1、seqidno:77所示的正向引物26f2和seqidno:78所示的反向引物26r组成。所述引物组27可由seqidno:79所示的正向引物27f1、seqidno:80所示的正向引物27f2和seqidno:81所示的反向引物27r组成。所述引物组28可由seqidno:82所示的正向引物28f1、seqidno:83所示的正向引物28f2和seqidno:84所示的反向引物28r组成。所述引物组29可由seqidno:85所示的正向引物29f1、seqidno:86所示的正向引物29f2和seqidno:87所示的反向引物29r组成。所述引物组30可由seqidno:88所示的正向引物30f1、seqidno:89所示的正向引物30f2和seqidno:90所示的反向引物30r组成。所述引物组31可由seqidno:91所示的正向引物31f1、seqidno:92所示的正向引物31f2和seqidno:93所示的反向引物31r组成。所述引物组32可由seqidno:94所示的正向引物32f1、seqidno:95所示的正向引物32f2和seqidno:96所示的反向引物32r组成。所述引物组33可由seqidno:97所示的正向引物33f1、seqidno:98所示的正向引物33f2和seqidno:99所示的反向引物33r组成。所述引物组34可由seqidno:100所示的正向引物34f1、seqidno:101所示的正向引物34f2和seqidno:102所示的反向引物34r组成。所述引物组35可由seqidno:103所示的正向引物35f1、seqidno:104所示的正向引物35f2和seqidno:105所示的反向引物35r组成。所述引物组36可由seqidno:106所示的正向引物36f1、seqidno:107所示的正向引物36f2和seqidno:108所示的反向引物36r组成。所述引物组37可由seqidno:109所示的正向引物37f1、seqidno:110所示的正向引物37f2和seqidno:111所示的反向引物37r组成。所述引物组38可由seqidno:112所示的正向引物38f1、seqidno:113所示的正向引物38f2和seqidno:114所示的反向引物38r组成。所述引物组39可由seqidno:115所示的正向引物39f1、seqidno:116所示的正向引物39f2和seqidno:117所示的反向引物39r组成。所述引物组40可由seqidno:118所示的正向引物40f1、seqidno:119所示的正向引物40f2和seqidno:120所示的反向引物40r组成。所述引物组41可由seqidno:121所示的正向引物41f1、seqidno:122所示的正向引物41f2和seqidno:123所示的反向引物41r组成。所述引物组42可由seqidno:124所示的正向引物42f1、seqidno:125所示的正向引物42f2和seqidno:126所示的反向引物42r组成。所述引物组43可由seqidno:127所示的正向引物43f1、seqidno:128所示的正向引物43f2和seqidno:129所示的反向引物43r组成。所述引物组44可由seqidno:130所示的正向引物44f1、seqidno:131所示的正向引物44f2和seqidno:132所示的反向引物44r组成。所述引物组45可由seqidno:133所示的正向引物45f1、seqidno:134所示的正向引物45f2和seqidno:135所示的反向引物45r组成。所述引物组46可由seqidno:136所示的正向引物46f1、seqidno:137所示的正向引物46f2和seqidno:138所示的反向引物46r组成。所述引物组47可由seqidno:139所示的正向引物47f1、seqidno:140所示的正向引物47f2和seqidno:141所示的反向引物47r组成。所述引物组48可由seqidno:142所示的正向引物48f1、seqidno:143所示的正向引物48f2和seqidno:144所示的反向引物48r组成。

所述引物组合中，所述引物组1可由seqidno:1自5’末端起第22至46位所示的正向引物01f1、seqidno:2自5’末端起第22至46位所示的正向引物01f2和seqidno:3所示的反向引物01r组成。所述引物组2可由seqidno:4自5’末端起第22至45位所示的正向引物02f1、seqidno:5自5’末端起第22至46位所示的正向引物02f2和seqidno:6所示的反向引物02r组成。所述引物组3可由seqidno:7自5’末端起第22至45位所示的正向引物03f1、seqidno:8自5’末端起第22至43位所示的正向引物03f2和seqidno:9所示的反向引物03r组成。所述引物组4由seqidno:10自5’末端起第22至45位所示的正向引物04f1、seqidno:11自5’末端起第22至46位所示的正向引物04f2和seqidno:12所示的反向引物04r组成。所述引物组5可由seqidno:13自5’末端起第22至48位所示的正向引物05f1、seqidno:14自5’末端起第22至48位所示的正向引物05f2和seqidno:15所示的反向引物05r组成。所述引物组6可由seqidno:16自5’末端起第22至48位所示的正向引物06f1、seqidno:17自5’末端起第22至46位所示的正向引物06f2和seqidno:18所示的反向引物06r组成。所述引物组7可由seqidno:19自5’末端起第22至46位所示的正向引物07f1、seqidno:20自5’末端起第22至47位所示的正向引物07f2和seqidno:21所示的反向引物07r组成。所述引物组8可由seqidno:22自5’末端起第22至54位所示的正向引物08f1、seqidno:23自5’末端起第22至52位所示的正向引物08f2和seqidno:24所示的反向引物08r组成。所述引物组9可由seqidno:25自5’末端起第22至52位所示的正向引物09f1、seqidno:26自5’末端起第22至52位所示的正向引物09f2和seqidno:27所示的反向引物09r组成。所述引物组10可由seqidno:28自5’末端起第22至43位所示的正向引物10f1、seqidno:29自5’末端起第22至43位所示的正向引物10f2和seqidno:30所示的反向引物10r组成。所述引物组11可由seqidno:31自5’末端起第22至49位所示的正向引物11f1、seqidno:32自5’末端起第22至48位所示的正向引物11f2和seqidno:33所示的反向引物11r组成。所述引物组12可由seqidno:34自5’末端起第22至54位所示的正向引物12f1、seqidno:35自5’末端起第22至53位所示的正向引物12f2和seqidno:36所示的反向引物12r组成。所述引物组13可由seqidno:37自5’末端起第22至43位所示的正向引物13f1、seqidno:38自5’末端起第22至46位所示的正向引物13f2和seqidno:39所示的反向引物13r组成。所述引物组14可由seqidno:40自5’末端起第22至48位所示的正向引物14f1、seqidno:41自5’末端起第22至49位所示的正向引物14f2和seqidno:42所示的反向引物14r组成。所述引物组15可由seqidno:43自5’末端起第22至48位所示的正向引物15f1、seqidno:44自5’末端起第22至49位所示的正向引物15f2和seqidno:45所示的反向引物15r组成。所述引物组16可由seqidno:46自5’末端起第22至48位所示的正向引物16f1、seqidno:47自5’末端起第22至49位所示的正向引物16f2和seqidno:48所示的反向引物16r组成。所述引物组17可由seqidno:49自5’末端起第22至49位所示的正向引物17f1、seqidno:50自5’末端起第22至48位所示的正向引物17f2和seqidno:51所示的反向引物17r组成。所述引物组18可由seqidno:52自5’末端起第22至46位所示的正向引物18f1、seqidno:53自5’末端起第22至46位所示的正向引物18f2和seqidno:54所示的反向引物18r组成。所述引物组19可由seqidno:55自5’末端起第22至49位所示的正向引物19f1、seqidno:56自5’末端起第22至51位所示的正向引物19f2和seqidno:57所示的反向引物19r组成。所述引物组20可由seqidno:58自5’末端起第22至43位所示的正向引物20f1、seqidno:59自5’末端起第22至46位所示的正向引物20f2和seqidno:60所示的反向引物20r组成。所述引物组21可由seqidno:61自5’末端起第22至43位所示的正向引物21f1、seqidno:62自5’末端起第22至44位所示的正向引物21f2和seqidno:63所示的反向引物21r组成。所述引物组22可由seqidno:64自5’末端起第22至41位所示的正向引物22f1、seqidno:65自5’末端起第22至43位所示的正向引物22f2和seqidno:66所示的反向引物22r组成。所述引物组23可由seqidno:67自5’末端起第22至46位所示的正向引物23f1、seqidno:68自5’末端起第22至46位所示的正向引物23f2和seqidno:69所示的反向引物23r组成。所述引物组24可由seqidno:70自5’末端起第22至49位所示的正向引物24f1、seqidno:71自5’末端起第22至48位所示的正向引物24f2和seqidno:72所示的反向引物24r组成。所述引物组25可由seqidno:73自5’末端起第22至46位所示的正向引物25f1、seqidno:74自5’末端起第22至47位所示的正向引物25f2和seqidno:75所示的反向引物25r组成。所述引物组26可由seqidno:76自5’末端起第22至48位所示的正向引物26f1、seqidno:77自5’末端起第22至46位所示的正向引物26f2和seqidno:78所示的反向引物26r组成。所述引物组27可由seqidno:79自5’末端起第22至51位所示的正向引物27f1、seqidno:80自5’末端起第22至49位所示的正向引物27f2和seqidno:81所示的反向引物27r组成。所述引物组28可由seqidno:82自5’末端起第22至43位所示的正向引物28f1、seqidno:83自5’末端起第22至43位所示的正向引物28f2和seqidno:84所示的反向引物28r组成。所述引物组29可由seqidno:85自5’末端起第22至44位所示的正向引物29f1、seqidno:86自5’末端起第22至43位所示的正向引物29f2和seqidno:87所示的反向引物29r组成。所述引物组30可由seqidno:88自5’末端起第22至51位所示的正向引物30f1、seqidno:89自5’末端起第22至51位所示的正向引物30f2和seqidno:90所示的反向引物30r组成。所述引物组31可由seqidno:91自5’末端起第22至43位所示的正向引物31f1、seqidno:92自5’末端起第22至43位所示的正向引物31f2和seqidno:93所示的反向引物31r组成。所述引物组32可由seqidno:94自5’末端起第22至48位所示的正向引物32f1、seqidno:95自5’末端起第22至46位所示的正向引物32f2和seqidno:96所示的反向引物32r组成。所述引物组33可由seqidno:97自5’末端起第22至48位所示的正向引物33f1、seqidno:98自5’末端起第22至50位所示的正向引物33f2和seqidno:99所示的反向引物33r组成。所述引物组34可由seqidno:100自5’末端起第22至43位所示的正向引物34f1、seqidno:101自5’末端起第22至46位所示的正向引物34f2和seqidno:102所示的反向引物34r组成。所述引物组35可由seqidno:103自5’末端起第22至47位所示的正向引物35f1、seqidno:104自5’末端起第22至46位所示的正向引物35f2和seqidno:105所示的反向引物35r组成。所述引物组36可由seqidno:106自5’末端起第22至50位所示的正向引物36f1、seqidno:107自5’末端起第22至51位所示的正向引物36f2和seqidno:108所示的反向引物36r组成。所述引物组37可由seqidno:109自5’末端起第22至43位所示的正向引物37f1、seqidno:110自5’末端起第22至45位所示的正向引物37f2和seqidno:111所示的反向引物37r组成。所述引物组38可由seqidno:112自5’末端起第22至51位所示的正向引物38f1、seqidno:113自5’末端起第22至52位所示的正向引物38f2和seqidno:114所示的反向引物38r组成。所述引物组39可由seqidno:115自5’末端起第22至49位所示的正向引物39f1、seqidno:116自5’末端起第22至51位所示的正向引物39f2和seqidno:117所示的反向引物39r组成。所述引物组40可由seqidno:118自5’末端起第22至49位所示的正向引物40f1、seqidno:119自5’末端起第22至48位所示的正向引物40f2和seqidno:120所示的反向引物40r组成。所述引物组41可由seqidno:121自5’末端起第22至48位所示的正向引物41f1、seqidno:122自5’末端起第22至47位所示的正向引物41f2和seqidno:123所示的反向引物41r组成。所述引物组42可由seqidno:124自5’末端起第22至47位所示的正向引物42f1、seqidno:125自5’末端起第22至46位所示的正向引物42f2和seqidno:126所示的反向引物42r组成。所述引物组43可由seqidno:127自5’末端起第22至49位所示的正向引物43f1、seqidno:128自5’末端起第22至48位所示的正向引物43f2和seqidno:129所示的反向引物43r组成。所述引物组44可由seqidno:130自5’末端起第22至46位所示的正向引物44f1、seqidno:131自5’末端起第22至43位所示的正向引物44f2和seqidno:132所示的反向引物44r组成。所述引物组45可由seqidno:133自5’末端起第22至51位所示的正向引物45f1、seqidno:134自5’末端起第22至49位所示的正向引物45f2和seqidno:135所示的反向引物45r组成。所述引物组46可由seqidno:136自5’末端起第22至51位所示的正向引物46f1、seqidno:137自5’末端起第22至51位所示的正向引物46f2和seqidno:138所示的反向引物46r组成。所述引物组47可由seqidno:139自5’末端起第22至48位所示的正向引物47f1、seqidno:140自5’末端起第22至46位所示的正向引物47f2和seqidno:141所示的反向引物47r组成。所述引物组48可由seqidno:142自5’末端起第22至39位所示的正向引物48f1、seqidno:143自5’末端起第22至40位所示的正向引物48f2和seqidno:144所示的反向引物48r组成。

上述任一所述引物组中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。

上述任一所述引物组合具体可由所述引物组1—所述引物组48组成。

上文中，序列表中序列1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即fam荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即hex荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。

含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。

所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为x3)或x4)：x3)鉴定西葫芦品种；x4)鉴别西葫芦品种真伪性。

本发明还保护上述任一所述snp位点组合或上述任一所述引物组合的应用，可为x1)至x4)中的任一种：x1)制备用于鉴定西葫芦品种的试剂盒；x2)制备用于鉴别西葫芦品种真伪性的试剂盒；x3)鉴定西葫芦品种；x4)鉴别西葫芦品种真伪性。

本发明还保护一种鉴定待测西葫芦属于265个西葫芦品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：分别检测待测西葫芦和265个西葫芦品种基于所述48个snp位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测西葫芦基于所述48个snp位点的基因型和265个西葫芦品种中某品种基于所述48个snp位点的基因型完全一致，则待测西葫芦与该西葫芦品种属于同一个品种；如果待测西葫芦基于所述48个snp位点的基因型和265个西葫芦品种中各个品种基于所述48个snp位点的基因型均不一致，则待测西葫芦与265个西葫芦品种的品种均不相同。

上述方法中，所述“检测待测西葫芦和265个西葫芦品种基于所述48个snp位点的基因型”的步骤可如下：

(1)分别以待测西葫芦的基因组dna和265个西葫芦品种的基因组dna为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测西葫芦和265个西葫芦品种基于所述48个snp位点的基因型。

上述方法中，所述“检测待测西葫芦和265个西葫芦品种基于所述48个snp位点的基因型”的步骤可如下：

(1)分别以待测西葫芦的基因组dna和265个西葫芦品种的基因组dna为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物，测序；

(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测西葫芦和265个西葫芦品种基于所述48个snp位点的基因型。

本发明还保护一种鉴定待测西葫芦属于265个西葫芦品种中哪个品种的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测西葫芦的基因组dna为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；以标准西葫芦品种群中的各个西葫芦品种的基因组dna为模板，分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述标准西葫芦品种群由265个西葫芦品种组成；

(2)将待测西葫芦得到的各个pcr扩增产物与每个标准西葫芦品种对应的pcr扩增产物进行聚类分析，聚类分析中待测西葫芦与哪个标准西葫芦品种为同一类，该待测西葫芦与该标准西葫芦品种即属于同一个品种。

上述任一所述265个西葫芦品种可为籽丰131、籽丰13号、籽丰12号、籽丰11号、籽丰9号、籽丰4号、籽丰3号、籽丰2号、籽丰1号、圣葫11、圣葫7号、圣葫5号、翠葫336、翠葫22、翠葫8号、京碧、玉珠2号、新京珠2号、京珠2号、新京珠、京珠、京葫66、京葫42、京葫38、京葫37、京葫36、京葫35、京葫33、京葫crv4-2、京葫crv3-3、京葫crv4、京葫crv3、京葫crv1、京葫12号、京葫10、京葫9号(单抗)、京葫9号、京葫8号、京葫7号(18年)、京葫6号(双抗)、京葫6号、京葫3号、京葫2号、京葫1号、爱特4号、爱特3号、xhl14102、爱特、trq-20、trq-19、201-lsq236、205-8g504西葫芦、206-8g506、210-zg522、早春202-lsq237西葫芦、xhl1476、xhl1485、利郎3号、东丰5号、xhl14106、xhl1471、xhl14109、xhl14104、美剑8018、xh01587、lz-4、xhl14103、西星西葫10号、欣瑞1212、209-8g521西葫芦、trq-18、xhl14108、xhl1472、xhl1474、xhl1449、xhl14107、xhl14101、绿皇冠38、绿皇冠29、绿皇冠40、西多子、西玉、dtzu-42、春韵二号、欣瑞1430、trq-15、s-2西葫芦、atxs06、atxs11、atxs04、atxs03、atxs10、atxs05、atxs14、atxs13、早春、西星西葫7号、西星西葫8号、春秀2002西葫芦、丽秀2086西葫芦、东丰5号、利郎3号、明智s600、xhl1485、xhl1481、xhl1476、xhl1474、xhl1472、xhl1471、xhl1449、xhl1497、xhl14101、xhl14102、xhl14103、xhl14104、xhl14107、xhl14108、132号、xhl14109、14108、绿帅、sq217218、sq219220、xh01587、xh01588西葫芦、xh01589西葫芦、xh01590西葫芦、xh01591西葫芦、xh01592西葫芦、xh01594西葫芦、xh01595西葫芦、塞纳、xh01446、xh01447、碧玉、冠玉、金胡36、寒玉、东葫16号、东葫1712、东葫3329、东葫22号、东葫33号、东葫28号、xh04002、xh04003、xh04004、xh04005、xh01412、xh01414、珍宝、瑞宝(圆形西葫芦)、玉钻、福瑞、墨玉、莱特、夏绿、夏丰、瑞玉、华莱士、yq-4xh01375、yq-3xh01374、yq-2xh01373、yq-1xh01372、高抗型珍35、新珍玉28xh01377、万盛1222、丰宝、万盛碧秀2号、万盛盛宝2号、万盛秋冠、万盛娇子、万盛丰冠、绿丰89、京葫911、绿先锋、妙玉8号、马可波罗、北岳浪玉、西玉、西多子、西美、西之玉、谷雨·冬秀、夏丽、法国盛娜、法国丽莎、绿皇冠24、绿皇冠27、绿皇冠29、绿皇冠38、绿皇冠34、绿皇冠40、绿皇冠41、绿丰55f1、天丰、法国绿蓓7810、美葫38、绿霸王油绿西葫芦889、法宝、翠宝、墨西葫芦安东尼、西葫芦sq-17、廉老的小变大、福鑫9号、飞天8号、金丰八号、冬冠西葫芦f1、s-3西葫芦、atxs03、atxs04、atxs05、atxs07、atxs08、atxs09、atxs10、atxs11、atxs12、atxs13、atxs14、热火f1、绿娇f1、碧萝春f1、蔓迪f1、泰山、全能翠玉、天王2号、宝丽洁、绿虎、青莹、瑞葫818f1、瑞葫899f1、莱恩特f1、凤葫2号、凤葫3号、凤葫4号、凤葫5号、凤葫6号、凤葫7号、黑皮葫芦3号、朝研x3、朝研4号、齐盛西葫芦、sqlh7、sqlh10、sqlh11、sqlh12、瑞丰九号f1、金318f1、金618f1、ws4112f1、2088g517、2068g506、2058g504西葫芦、欣瑞1212、201lsq236、早春202lsq237西葫芦、绿碧玉、南奥26号、海美1207号、w1501f1、w368f1亚历山大、利德绿能蓝涧、华盛31和327号。

上述任一所述的方法中，“分别采用上述任一所述引物组合中引物组的进行pcr扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

本发明建立了基于等位基因竞争性特异pcr法鉴定西葫芦品种真实性的dna指纹数据库，可用于对西葫芦品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为西葫芦种质资源和新品种保护提供技术支持。本发明提供的方法既可以对未知西葫芦品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为48个引物组在部分供试西葫芦品种中的snp分型效果。

图2为建立在48个snp引物组上的265个供试西葫芦品种的聚类图。

图3为snp标记个数(即snp位点个数)与区分265个供试西葫芦品种的关系图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于鉴定西葫芦品种真实性的引物组合的获得

一、48个snp位点的发现

本发明基于30份西葫芦代表资源的重测序数据，获得48个snp位点。这30份西葫芦代表资源类型丰富，涵盖花叶西葫芦(8份)、无种皮西葫芦(7份)、绿皮西葫芦(8份)以及长蔓西葫芦(7份)，基本包括了西葫芦主要的生态类型，在农艺性状方面具有较高的遗传多样性，尽可能多地体现了种质代表性。

具体的，snp位点的筛选标准如下：在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、maf>0.3、pca聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无indel，无ssr，无其它snp)的snp位点。

48个snp位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中snp位点在染色体上的位置是基于zucchini参考基因组序列比对确定的(下载地址为：ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/cucurbita_pepo/)。

表1.48个snp位点基本信息

二、用于鉴定西葫芦品种真实性的引物组合的获得

根据步骤一发现的48个snp位点，开发出具有较高的多态性信息量(pic值)(见表1中第5列)且适合用等位基因竞争性特异pcr法鉴定西葫芦品种真实性的引物组合。

引物组合由48个引物组组成。每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个snp位点。48个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。

表2.48个引物组及其引物的核苷酸序列

注：单下划线为fam荧光标签序列，双下划线为hex荧光标签序列。

实施例2、实施例1开发的引物组合的有效性检验

随机选择265个供试西葫芦品种对实施例1开发的引物组合的有效性检验。

265个供试西葫芦品种的基本信息见表3。265个供试西葫芦品种均为常见的优良品种或部分国外引进品种。

表3.265个供试西葫芦品种的名称及来源

1、供试西葫芦品种的基因组dna的获得

采用ctab法分别提取265个供试西葫芦品种的叶片(混取30粒种子的真叶)的基因组dna，得到供试西葫芦品种的基因组dna。

供试西葫芦品种的基因组dna的质量和浓度均须满足pcr要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计nanodrop2000(thermo)检测a260/a280比值在1.8左右，a260/a230比值大于1.8；供试西葫芦品种的基因组dna的浓度在10-30ng/μl。

2、分别以265个供试西葫芦品种的基因组dna为模板，分别采用48个引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断265个供试西葫芦品种基于每个snp位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试西葫芦品种基于某snp位点显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试西葫芦品种基于某snp位点显示红色荧光信号，则该供试西葫芦品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试西葫芦品种基于某snp位点显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦品种基于该snp位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。

需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

部分结果见图1。结果表明，各个引物组在供试西葫芦品种中可以得到很好的分型效果。

4、聚类分析

根据265个供试西葫芦品种基于48个snp位点的基因型，利用minimarker和mega7软件对265个供试西葫芦品种进行聚类分析。

建立在48个引物组上的265个供试西葫芦品种的聚类图如图2所示。结果表明，48个引物组可以完全区分表3中的265个供试西葫芦品种。由此可见，实施例1开发的引物组合可以应用于西葫芦品种dna指纹数据库构建和品种真实性鉴定。

5、效率评价

品种真实性鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了snp标记个数(即引物组数)与区分265个供试西葫芦品种区分率的关系。

实验结果表明(图3)，48个引物组(即48个snp标记个数)在265个供试西葫芦品种中的区分率达到100％。

实施例3、建立检测待测西葫芦属于实施例2中265个西葫芦品种中哪个品种的方法

一、建立检测待测西葫芦属于实施例2中265个西葫芦品种中哪个品种的方法

1、待测西葫芦的基因组dna的获得

按照实施例2中步骤1的方法，将“供试西葫芦品种的叶片”替换为“待测西葫芦的叶片”，其它步骤均不变，得到待测西葫芦的基因组dna。

2、以待测西葫芦的基因组dna为模板，分别采用48个引物组进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测西葫芦基于每个snp位点的基因型。需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

具体的判断原则同实施例2中步骤3的判断原则。

4、完成步骤3后进行如下判断：如果待测西葫芦基于48个snp位点的基因型和265个西葫芦品种中某品种相应的snp位点的基因型完全一致，则待测西葫芦与该西葫芦品种属于同一个品种；如果待测西葫芦基于48个snp位点的基因型和265个西葫芦品种中各个品种相应的snp位点的基因型均不一致，则待测西葫芦与265个供试西葫芦品种的品种均不相同。

二、步骤一建立的方法的准确性鉴定

待测西葫芦1-待测西葫芦5的品种依次为籽丰131、籽丰13号、籽丰12号、籽丰11号和籽丰9号。待测西葫芦1-待测西葫芦5的叶片均取自北京市农林科学院蔬菜研究中心试验基地。

1、按照步骤一中1-3的方法，获得待测西葫芦1-待测西葫芦5基于48个snp位点的基因型。

2、将待测西葫芦1-待测西葫芦5基于48个snp位点的基因型和265个西葫芦品种基于48个snp位点的基因型进行比较。

结果表明，待测西葫芦1基于48个snp位点的基因型和籽丰131相应的snp位点的基因型完全一致，待测西葫芦1属于籽丰131；待测西葫芦2基于48个snp位点的基因型和籽丰13号相应的snp位点的基因型完全一致，待测西葫芦2属于籽丰13号；待测西葫芦3基于48个snp位点的基因型和籽丰12号相应的snp位点的基因型完全一致，待测西葫芦3属于籽丰12号；待测西葫芦4基于48个snp位点的基因型和籽丰11号相应的snp位点的基因型完全一致，待测西葫芦4属于籽丰11号；待测西葫芦5基于48个snp位点的基因型和籽丰9号相应的snp位点的基因型完全一致，待测西葫芦5属于籽丰9号。检测结果与预期结果完全一致。

由此可见，步骤一建立的方法具有较高的准确性。

<110>北京市农林科学院

<120>一种鉴别西葫芦品种真伪性的方法

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