一种将植物基因组中的碱基C突变为碱基T的方法

一种将植物基因组中的碱基c突变为碱基t的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种将植物基因组中的碱基c突变为碱基t的方法。


背景技术：

2.crispr-cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。crispr/cas9 protein-rna复合物通过向导rna(guide rna)定位于靶点上，切割产生dna双链断裂(dsdna break，dsb)，而后生物体会本能的启动dna修复机制修复dsb。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)，另一种是同源重组(homology-directed repair，hdr)。通常情况下nhej占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为hdr效率低以及需要dna模板，所以使用hdr实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。
3.2016年，david liu和akihiko kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，cbe)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rapobec1(rat apobec1)和pmcda1(activation-induced cytidine deaminase(aid)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(cytosine，c)碱基进行编辑，而不再通过产生dsb和启动hdr修复，大大提高了c替换为胸腺嘧啶(thymine，t)的碱基编辑效率。具体为dead cas9(dcas9)或the cas9 nickase(cas9n)连带着rapobec1或pmcda1通过向导rna定位到靶点，rapobec1或pmcda1催化非配对的单链dna上的c发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(uracil，u)，通过dna的修复使得u与腺嘌呤(adenine，a)配对，又通过dna复制，最终使得t与a配对，从而实现了c到t的转换。在所测试的编辑器中，spcas9n(d10a)&rapobec1/pmcda1&ugi碱基编辑系统(其含有尿嘧啶dna糖化酶抑制剂(uracil dna glycosylase inhibitor，ugi)的平均突变率较高，原因有二：一是ugi可以抑制尿嘧啶dna糖化酶(uracil dna glycosylase，udg)催化清除dna中u，二是spcas9n(d10a)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch ber(base-excision repair)修复机制，促使u:g错配更多的偏好性修复成u:a。
4.目前，spcas9n(d10a)&rapobec1/pmcda1&ugi碱基编辑系统已被广泛应用到水稻中，实现c到t的转换，但编辑的靶点主要局限在pam(protospacer adjacent motif)为ngg的序列，大大限制了可编辑的c的范围。spcas9的变体spcas9-ng能够识别ngn(n＝a，t，c或g)pam靶点，被成功的开发成cbe(spcas9-ng-cbe)，大大拓展了动物和植物基因组中可编辑的c的范围，但是相对于nga，ngt和ngg pam靶点，spcas9-ng-cbe对ngc pam靶点的编辑能力低。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法。
6.本发明提供的将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法为如下1)或2)或3)或
4)：
7.所述1)包括如下步骤：将spryn、胞嘧啶脱氨酶、sgrna和ugi导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的c突变为t；
8.所述2)包括如下步骤：将spryn、胞嘧啶脱氨酶和sgrna导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的c突变为t；
9.所述3)包括如下步骤：将spryn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因、转录sgrna的dna分子和ugi的编码基因导入植物体内，使所述spryn、所述胞嘧啶脱氨酶、所述sgrna和所述ugi均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的c突变为t；
10.所述4)包括如下步骤：将spryn的编码基因、胞嘧啶脱氨酶的编码基因和转录sgrna的dna分子导入植物体内，使所述spryn、所述胞嘧啶脱氨酶和所述sgrna均得到表达，实现将植物基因组靶点序列中的c突变为t；
11.所述sgrna靶向靶点序列；
12.所述靶点序列的pam序列为ngn；n为a、t、c或g。
13.上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法中，所述sgrna为trna-esgrna；
14.所述trna-esgrna如式i所示：trna-所述靶点序列转录的rna-esgrna骨架(式i)；
15.所述trna为m1)或m2)或m3)：
16.m1)将序列1第597-673位中的t替换为u得到的rna分子；
17.m2)将m1)所示的rna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna分子；
18.m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna分子；
19.所述esgrna骨架为n1)或n2)或n3)：
20.n1)将序列1第694-779位中的t替换为u得到的rna分子；
21.n2)将n1)所示的rna分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的rna分子；
22.n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的rna分子。
23.上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法中，所述spryn为a1)或a2)或a3)：
24.a1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
25.a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
26.a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
27.所述胞嘧啶脱氨酶可为human apobec3a、human aid、pmcda1或rapobec1等蛋白质。在本发明的具体实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶为pmcda1。
28.所述pmcda1为c1)或c2)或c3)：
29.c1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
30.c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
31.c3)在c1)或c2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
32.所述ugi为e1)或e2)或e3)：
33.e1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
34.e2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
35.e3)在e1)或e2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
36.为了使a1)、c1)或e1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2或序列3或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
37.表、标签的序列
38.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
39.上述a2)、c2)或e2)中的蛋白质，为与序列2或序列3或序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
40.上述a2)、c2)或e2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
41.上述a2)、c2)或e2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第3167-7267位、第7553-8176位或第8210-8458位所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连接上表所示的标签的编码序列得到。序列1的第3167-7267位、第7553-8176位和第8210-8458位分别编码序列2、序列3和序列4所示的蛋白质。
42.所述spryn的编码基因为b1)或b2)或b3)：
43.b1)序列表中序列1第3167-7267位所示的cdna分子或dna分子；
44.b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述spryn的cdna分子或dna分子；
45.b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述spryn的cdna分子或dna分子；
46.所述pmcda1的编码基因为d1)或d2)或d3)：
47.d1)序列表中序列1第7553-8176位所示的cdna分子或dna分子；
48.d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述pmcda1的cdna分子或dna分子；
49.d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述pmcda1的cdna分子或dna分子；
50.所述ugi的编码基因为f1)或f2)或f3)：
51.f1)序列表中序列1第8210-8458位所示的cdna分子或dna分子；
52.f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述ugi的cdna分子或dna分子；
53.f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述ugi的cdna分子或dna分子。
54.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述spryn、所述pmcda1或所述ugi的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述spryn、所述pmcda1或所述ugi的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述spryn、所述pmcda1或所述ugi且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
55.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2、3或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
56.所述严格条件是在2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
57.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
58.上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法中，所述转录trna-esgrna的dna分子转录后得到的所述trna-esgrna为不成熟的rna前体，该rna前体中的trna会被两种酶(rnase p和rnase z)切割掉后得到成熟的rna。一个重组表达载体中有多少个靶点，就会得到多少个独立的成熟的rna，每个成熟的rna依次由所述靶点序列转录的rna和所述esgrna骨架组成，或依次由所述trna残留的个别碱基、所述靶点序列转录的rna和所述esgrna骨架组成。
59.上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法中，所述1)和3)中，所述ugi的个数可为一个或两个或多个。在本发明的具体实施例中，所述ugi的个数具体为两个。
60.上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法中，所述3)中，所述spryn的编码基因、所述转录sgrna的dna分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述ugi的编码基因可通过一个或多个重组表达载体导入植物体内。在本发明的具体实施例中，所述spryn的编码基因、所述转录trna-esgrna的dna分子、所述pmcda1的编码基因和所述ugi的编码基因通过一个重组表达载体导入植物体内。
61.进一步的，所述重组载体还包括筛选剂抗性蛋白的编码基因。
62.更进一步的，所述重组载体包括含有转录trna-esgrna的dna分子的表达盒和依次含有所述spryn的编码基因、所述pmcda1的编码基因、所述ugi的编码基因、所述ugi的编码基因、所述自切割寡肽的编码基因和所述筛选剂抗性蛋白的编码基因的表达盒。
63.所述含有转录trna-esgrna的dna分子的表达盒的个数可为一个或两个或多个。具体可为一个或两个或三个。
64.所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2a自切割寡肽，如口蹄疫病毒(fmdv)
(f2a)肽、马a型鼻炎病毒(erav)(e2a)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea asigna virus)(t2a)肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)(p2a)肽、泰勒病毒2a肽以及脑心肌炎病毒2a肽。具体可为p2a肽。
65.所述筛选剂抗性蛋白具体可为潮霉素磷酸转移酶。
66.在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体具体为spryn-cbe-1重组表达载体、spryn-cbe-2重组表达载体、spryn-cbe-3重组表达载体、spryn-cbe-4重组表达载体、spryn-cbe-5重组表达载体、spryn-cbe-6重组表达载体、spryn-cbe-7重组表达载体。
67.本发明的另一个目的是提供上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法的新用途。
68.本发明提供了上述将植物基因组靶点序列中的c突变为t的方法在如下x1)-x3)任一种中的应用：
69.x1)植物基因组碱基替换或植物基因组碱基编辑；
70.x2)提高植物基因组碱基替换效率或植物基因组碱基编辑效率；
71.x3)制备植物突变体。
72.本发明还有一个目的是提供成套试剂的新用途；所述成套试剂包括上述spryn、上述胞嘧啶脱氨酶和上述sgrna；
73.本发明提供了成套试剂在如下t1)-t11)任一种中的应用：
74.t1)将植物基因组靶点序列中的c突变为t；
75.t2)制备将植物基因组靶点序列中的c突变为t的产品；
76.t3)植物基因组碱基替换；
77.t4)制备植物基因组碱基替换的产品；
78.t5)植物基因组碱基编辑；
79.t6)制备植物基因组碱基编辑的产品；
80.t7)提高植物基因组碱基替换效率；
81.t8)制备提高植物基因组碱基替换效率的产品；
82.t9)提高植物基因组碱基编辑效率；
83.t10)制备提高植物基因组碱基编辑效率的产品；
84.t11)制备植物突变体；
85.所述靶点序列的pam序列为ngn；n为a、t、c或g。
86.进一步的，所述成套试剂还包括上述ugi。
87.更进一步的，所述成套试剂由上述spryn、上述胞嘧啶脱氨酶、上述sgrna、上述ugi、上述自切割寡肽和上述筛选剂抗性蛋白组成。
88.上述任一所述方法或应用中，所述pam序列为与所述靶点序列3
′
端相连的一段dna序列。所述pam序列自5
′
端起第一个n与所述靶点序列3
′
端相连。所述靶点序列大小可为15-25bp，进一步可为18-22bp，更进一步可为20bp。
89.进一步的，所述ngn可为nga、ngg、ngc或ngt。
90.更进一步的，所述nga可为tga、aga或gga。
91.所述ngg可为tgg、cgg或agg。
92.所述ngc可为agc或ggc。
93.所述ngt可为cgt或agt。
94.上述任一所述方法或应用中，所述靶点序列可为一个或两个或多个。
95.上述任一所述方法或应用中，所述碱基替换或碱基编辑为将植物基因组靶点序列中的c突变为t。
96.所述碱基替换效率或所述碱基编辑效率为将位于植物基因组上的pam为ngc的靶点序列中的c突变为t的碱基替换效率或所述碱基编辑效率。
97.所述c可为位于所述靶点序列中任意位置的碱基c。
98.上述任一所述方法或应用中，所述植物为s1)或s2)或s3)：
99.s1)单子叶植物或双子叶植物；
100.s2)禾本科植物；
101.s3)水稻(如日本晴)。
102.本发明提供了一种将植物基因组中的碱基c突变为碱基t的方法。本发明方法包括如下步骤：将spryn、胞嘧啶脱氨酶、sgrna和ugi导入植物体内，实现将植物基因组靶点序列中的c突变为t。通过实验证明：本发明方法可对位于植物基因组上的pam序列为ngn的靶点序列中的碱基c进行编辑，实现碱基c到碱基t的替换，在拓展可编辑的c的范围的同时，还提高了碱基替换效率。
附图说明
103.图1为spryn-cbe碱基编辑系统载体各元件结构示意图。其中，n为靶点个数，具体可为1、2或3，osu6具体可为osu6a、osu6b或osu6c，一个靶点时使用osu6a，两个靶点时分别使用osu6a和osu6b，三个靶点时分别使用osu6a，osu6b和osu6c。
104.图2为spcas9n-ng-cbe碱基编辑系统载体各元件结构示意图。其中，n为靶点个数，具体可为2或3，osu6具体可为osu6a、osu6b或osu6c，两个靶点时分别使用osu6a和osu6b，三个靶点时分别使用osu6a，osu6b和osu6c。
具体实施方式
105.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
106.引物对ngc-c1由引物ngc-c1-f：5
’-
ggagctggatgaggtgct-3’和引物ngc-c1-r：5
’-
ggaagaagaaaagtagggaga-3’组成，用于扩增靶点ngc-c1。
107.引物对ngc-c2由引物ngc-c2-f：5
’-
tgttctgagttagcatgggctg-3’和引物ngc-c2-r：5
’-
ttgaacacaaaataagggca-3’组成，用于扩增靶点ngc-c2。
108.引物对ngc-c3由引物ngc-c3-f：5
’-
gattttgtagagcggcagccaa-3’和引物ngc-c3-r：5
’-
gtaggtcgagtcgacgatc-3’组成，用于扩增靶点ngc-c3。
109.引物对ngc-c4由引物ngc-c4-f：5
’-
atcacaaattgtgccaattcac-3’和引物ngc-c4-r：5
’-
tacaggaaatactgcaacaac-3’组成，用于扩增靶点ngc-c4。
110.引物对ngc-c5由引物ngc-c5-f：5
’-
gccgcgacggccaagacc-3’和引物ngc-c5-r：5
’-
aagcctcaattttccctgtc-3’组成，用于扩增靶点ngc-c5。
111.引物对nga-c1由引物nga-c1-f：5
’-
gcagcagcggtcggtgcagcg-3’和引物nga-c1-r：5
’-
gaattagtctgatcatcatggat-3’组成，用于扩增靶点nga-c1。
112.引物对nga-c2由引物nga-c2-f：5
’-
tcaattagttgtacccggtga-3’和引物nga-c2-r：5
’-
cgcccaccactgatcgatcg-3’组成，用于扩增靶点nga-c2。
113.引物对nga-c3由引物nga-c3-f：5
’-
ttttggtcgttgcagggatgt-3’和引物nga-c3-r：5
’-
gaacaacaagattaacctaaggct-3’组成，用于扩增靶点nga-c3。
114.引物对nga-c4由引物nga-c4-f：5
’-
ttttggtcgttgcagggatgt-3’和引物nga-c4-r：5
’-
gaacaacaagattaacctaaggct-3’组成，用于扩增靶点nga-c4。
115.引物对ngt-c1由引物ngt-c1-f：5
’-
cctagcaaggacaagtacatca-3’和引物ngt-c1-r：5
’-
gccatgatgagatgagcaagc-3’组成，用于扩增靶点ngt-c1。
116.引物对ngt-c2由引物ngt-c2-f：5
’-
ttttggtcgttgcagggatgt-3’和引物ngt-c2-r：5
’-
gaacaacaagattaacctaaggct-3’组成，用于扩增靶点ngt-c2。
117.引物对ngg由引物ngg-f：5
’-
tgacgtgatggaggagtttcac-3’和引物ngg-r：5
’-
tagctatagcttatgcgtggac-3’组成，用于扩增靶点ngg-c1、ngg-c2、ngg-c3和ngg-c4。
118.以下实施例中，c
·
t碱基替换是指靶点序列中任何位置的c突变为t。
119.c
·
t碱基替换效率＝发生c
·
t碱基替换的阳性t0苗数/分析的总阳性t0苗数
×
100％。
120.日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[j].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。
[0121]
恢复培养基：含有200mg/l特美汀的n6固体培养基。
[0122]
筛选培养基：含有50mg/l潮霉素的n6固体培养基。
[0123]
分化培养基：含有2mg/l kt、0.2mg/l naa、0.5g/l谷氨酸、0.5g/l脯氨酸的n6固体培养基。
[0124]
生根培养基：含有0.2mg/l naa、0.5g/l谷氨酸、0.5g/l脯氨酸的n6固体培养基。
[0125]
实施例1、spryn-cbe碱基编辑系统可实现对水稻基因组中pam序列为ngc的靶点进行碱基编辑
[0126]
一、重组表达载体的构建
[0127]
人工合成如下重组表达载体，spryn-cbe-1重组表达载体、spryn-cbe-2重组表达载体，spcas9n-ng-cbe-1重组表达载体和spcas9n-ng-cbe-2重组表达载体。spryn-cbe-1重组表达载体和spryn-cbe-2重组表达载体各元件结构示意图如图1所示。spcas9n-ng-cbe-1重组表达载体和spcas9n-ng-cbe-2重组表达载体各元件结构示意图如图2所示。各载体均为环状质粒，具体结构描述分别如下：
[0128]
spryn-cbe-1重组表达载体的序列为序列表中的序列1。序列1的第131-596位为osu6a启动子的核苷酸序列，第597-673位为trna的核苷酸序列，第674-693位为靶点ngc-c1的核苷酸序列，第694-779位为esgrna骨架的核苷酸序列，第780-786位为polyt序列；序列1的第787-1119位为osu6b启动子的核苷酸序列，第1126-1202位为trna的核苷酸序列，第
1203-1222位为靶点ngc-c4的核苷酸序列，第1223-1308位为esgrna骨架的核苷酸序列，第1309-1320位为polyt序列；序列1的第1327-3040位为osubq3启动子的核苷酸序列，第3167-7267位为spryn蛋白质的编码序列(不含有起始密码子和终止密码子)，编码序列2所示的spryn蛋白质；序列1的第7553-8176位为pmcda1蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列3所示的pmcda1蛋白质；序列1的第8210-8458位和第8471-8719位均为ugi蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列4所示的ugi蛋白质；序列1的第8762-8818位为p2a的编码序列，第8819-9844位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，第10184-10436位为nos终止子的核苷酸序列。spryn-cbe-1重组表达载体含有的两个靶点ngc-c1和ngc-c4，序列见表1。
[0129]
spryn-cbe-2重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第131-1320位的序列替换为序列表中的序列5,且保持其他序列不变后得到的序列。序列5的第1-466位为osu6a启动子的核苷酸序列，第467-543位为trna的核苷酸序列，第544-563位为靶点ngc-c2的核苷酸序列，第564-649位为esgrna骨架的核苷酸序列，第650-656位为polyt序列；序列5的第657-989位为osu6b启动子的核苷酸序列，第996-1072位为trna的核苷酸序列，第1073-1092位为靶点ngc-c3的核苷酸序列，第1093-1178位为esgrna骨架的核苷酸序列，第1179-1185位为polyt序列；序列5的第1186-1927位为osu6c启动子的核苷酸序列，第1934-2010位为trna的核苷酸序列，第2011-2030位为靶点ngc-c5的核苷酸序列，第2031-2116位为esgrna骨架的核苷酸序列，第2117-2128位为polyt序列。ngc-c2靶点序列、ngc-c3靶点序列和ngc-c5靶点序列见表1。
[0130]
spcas9n-ng-cbe-1重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第3167-7267位的序列替换为序列表中的序列6，且保持其他序列不变后得到的序列。序列6为spcas9n-ng蛋白质的编码序列(不含有起始密码子和终止密码子)。
[0131]
spcas9n-ng-cbe-2重组表达载体的序列为将spryn-cbe-2重组表达载体中所包含的序列1的第3167-7267位的序列替换为序列表中的序列6，且保持其他序列不变后得到的序列。
[0132]
各载体的esgrna的靶点核苷酸序列及相应的pam序列如表1所示。
[0133]
表1、各载体的esgrna的靶点核苷酸序列及相应的pam序列
[0134][0135]
二、水稻植株中对靶点进行碱基编辑
[0136]
将步骤一获得的spryn-cbe-1重组表达载体、spryn-cbe-2重组表达载体，spcas9n-ng-cbe-1重组表达载体和spcas9n-ng-cbe-2重组表达载体分别按照如下步骤1-11进行操作：
[0137]
1、将载体导入农杆菌eha105(上海唯地生物技术有限公司的产品，cat#:ac1010)，得到重组农杆菌。
[0138]
2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的yep培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至od
600
为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将
n6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/l和20g/l)重悬菌体并稀释至od
600
为0.2，得到农杆菌侵染液。
[0139]
3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100ml三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于n6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。
[0140]
4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。
[0141]
5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。
[0142]
6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。
[0143]
7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。
[0144]
8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻t0苗。
[0145]
9、提取水稻t0苗的基因组dna并以其作为模板，采用引物f(5
’-
ttattgccactagttcattctacttat-3’)和引物r(5
’-
ggggtacttctcgtggtagg-3’)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；将该pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果pcr扩增产物中含有约729bp的dna片段，则相应的水稻t0苗为水稻阳性t0苗；如果pcr扩增产物中不含有约729bp的dna片段，则相应的水稻t0苗不为水稻阳性t0苗。
[0146]
10、各载体分别取步骤9所获得的水稻阳性t0苗的基因组dna作为模板，对于ngc-c1靶点，采用引物对ngc-c1进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngc-c2靶点，采用引物对ngc-c2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngc-c3靶点，采用引物对ngc-c3进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngc-c4靶点，采用引物对ngc-c4进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngc-c5靶点，采用引物对ngc-c5进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0147]
11、将步骤10得到的pcr扩增产物进行sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计各靶点发生c
·
t碱基替换的阳性t0苗数，计算得出c
·
t碱基替换效率，结果见表2。
[0148]
结果表明，spryn-cbe碱基编辑系统对五个靶点均实现c
·
t碱基替换，spcas9n-ng-cbe碱基编辑系统仅实现对ngc-c5靶点的编辑，且c
·
t碱基替换效率低至2.4％。说明对于ngc pam靶点，spryn-cbe碱基编辑系统优于spcas9n-ng-cbe碱基编辑系统，能够在水稻基因组中很好的实现c
·
t碱基替换。
[0149]
表2、c
·
t碱基替换效率
[0150]
靶点名称cbe系统总阳性t0苗数发生c
·
t碱基替换的阳性t0苗数c
·
t碱基替换效率(％)ngc-c1spryn-cbe36719.4 spcas9n-ng-cbe3500ngc-c2spryn-cbe351337.1 spcas9n-ng-cbe2900ngc-c3spryn-cbe40410
ꢀ
spcas9n-ng-cbe4300ngc-c4spryn-cbe42716.7 spcas9n-ng-cbe2900ngc-c5spryn-cbe3825.3 spcas9n-ng-cbe4112.4
[0151]
实施例2、spryn-cbe碱基编辑系统可实现对水稻基因组中pam序列为nga，ngt或ngg的靶点进行碱基编辑
[0152]
一、重组表达载体的构建
[0153]
人工合成如下重组表达载体：spryn-cbe-3重组表达载体，spryn-cbe-4重组表达载体，spryn-cbe-5重组表达载体，spryn-cbe-6重组表达载体和spryn-cbe-7重组表达载体。各载体均为环状质粒。
[0154]
spryn-cbe-3重组表达载体的序列为将spryn-cbe-1重组表达载体序列中ngc-c1靶点序列替换为nga-c1靶点序列，ngc-c4靶点序列替换为nga-c2靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。nga-c1靶点序列和nga-c2靶点序列见表3。
[0155]
spryn-cbe-4重组表达载体的序列为将spryn-cbe-1重组表达载体序列中ngc-c1靶点序列替换为nga-c3靶点序列，ngc-c4靶点序列替换为nga-c4靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。nga-c3靶点序列和nga-c4靶点序列见表3。
[0156]
spryn-cbe-5重组表达载体的序列为将spryn-cbe-1重组表达载体序列中ngc-c1靶点序列替换为ngt-c1靶点序列，ngc-c4靶点序列替换为ngt-c2靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。ngt-c1靶点序列和ngt-c2靶点序列见表3。
[0157]
spryn-cbe-6重组表达载体的序列为将spryn-cbe-2重组表达载体序列中ngc-c2靶点序列替换为ngg-c1靶点序列，ngc-c3靶点序列替换为ngg-c2靶点序列，ngc-c5靶点序列替换为ngg-c3靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。ngg-c1靶点序列、ngg-c2靶点序列和ngg-c3靶点序列见表3。
[0158]
spryn-cbe-7重组表达载体的序列为将序列表中序列1的第131-1320位的序列替换为序列表中的序列7，且保持其他序列不变后得到的序列。序列7的第1-466位为osu6a启动子的核苷酸序列，第467-543位为trna的核苷酸序列，第544-563位为靶点ngg-c4的核苷酸序列，第564-649位为esgrna骨架的核苷酸序列，第650-661位为polyt序列。ngg-c4靶点序列见表3。
[0159]
各载体的esgrna的靶点核苷酸序列及相应的pam序列如表3所示。
[0160]
表3、各载体的esgrna的靶点核苷酸序列及相应的pam序列
[0161]
[0162]
二、水稻植株中对靶点进行碱基编辑
[0163]
1、将步骤一构建的spryn-cbe-3重组表达载体，spryn-cbe-4重组表达载体，spryn-cbe-5重组表达载体，spryn-cbe-6重组表达载体和spryn-cbe-7重组表达载体，分别按照实施例1步骤二的1-9进行操作，得到水稻阳性t0苗。
[0164]
2、各载体分别取步骤1所获得的水稻阳性t0苗的基因组dna作为模板，对于nga-c1靶点，采用引物对nga-c1进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于nga-c2靶点，采用引物对nga-c2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于nga-c3靶点，采用引物对nga-c3进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于nga-c4靶点，采用引物对nga-c4进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngt-c1靶点，采用引物对ngt-c1进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngt-c2靶点，采用引物对ngt-c2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；对于ngg-c1、ngg-c2、ngg-c3和ngg-c4靶点，均采用引物对ngg进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
[0165]
3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计各靶点发生c
·
t碱基替换的阳性t0苗数，计算得出c
·
t碱基替换效率，结果见表4。
[0166]
结果表明，spryn-cbe碱基编辑系统对所有测试的靶点均能够有效编辑，得到c
·
t碱基替换的t0苗，碱基编辑效率为4.2％-40％。由此表明spryn-cbe碱基编辑系统可以对水稻基因组中pam序列为nga，ngt和ngg的靶点序列进行碱基编辑，实现c
·
t碱基替换。
[0167]
表4、基因编辑效率分析结果
[0168]
靶点名称总阳性t0苗数发生c
·
t碱基替换的阳性t0苗数c
·
t碱基替换效率(％)nga-c133721.2nga-c239410.3nga-c33725.4nga-c436411.1ngt-c12414.2ngt-c24824.2ngg-c13425.9ngg-c235617.1ngg-c3351440ngg-c424937.5
[0169]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。